RING2对苯并[a]芘导致的人支气管上皮细胞BPDE-DNA加合物及CHK1的影响
详细信息Effects of ubiquitin protein ligase RING2 on BPDE-DNA adducts and CHK1 in BEAS-2B cells exposed to benzo (a) pyrene
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摘要:[目的] 探讨泛素连接酶RING2对苯并[a]芘（BaP）导致的人支气管上皮细胞（BEAS-2B）BPDE-DNA加合物及周期检测点激酶1（CHK1）表达水平的影响。
[方法] 用不同浓度的BaP（0、1、2、4、8、16、32μmol/L）染毒BEAS-2B细胞24 h，以16μmol/L BaP染毒BEAS-2B细胞不同时间（0、1、2、4、8、12、24 h）；通过siRNA干扰技术降低BEAS-2B细胞中泛素连接酶RING2的表达水平，用16 μmol/L BaP染毒BEAS-2B和BEAS-2B（siRNA-RING2）细胞24 h。使用免疫组化荧光法检测细胞中BPDE-DNA加合物的表达情况，采用Western blot检测细胞中CHK1及其S345位点磷酸化的水平。
[结果] 免疫组化荧光法结果显示，与正常对照组相比，转染前后染毒组的荧光强度均增加（P < 0.01），提示染毒后BPDEDNA加合物增加，其中BESA-2B（siRNA-RING2）染毒组的荧光强度较正常染毒组的增加了32%。Western blot结果显示，随着染毒时间和染毒浓度的增加，BESA-2B的CHK1及CHK1 S345-p的水平逐渐增加（P < 0.01）；16 μmol/L BaP染毒BEAS-2B（siRNA-RING2）细胞24 h后，其CHK1及CHK1 S345-p水平较对照组明显下降（P < 0.01）；析因分析表明，转染与染毒均对CHK1及CHK1 S345-p的表达量有影响，两因素间存在交互作用（P < 0.01），转染后染毒组与不染毒组CHK1及CHK1 S345-p水平的差异，与正常细胞组的相比，分别降低了54%和51%；协方差分析控制染毒因素后，BESA-2B（siRNA-RING2）组CHK1及CHK1 S345-p水平的修正均数（分别为0.77和0.89）较BEAS-2B组的修正均数（分别为1.24和1.32）明显降低（P < 0.01）。
[结论] RING2低表达的细胞DNA对BaP更加敏感，这提示RING2可能通过影响CHK1及其磷酸化水平来调控细胞周期的进程，进而影响DNA的损伤修复。
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关键词:
- 苯并[a]芘 /
- 泛素连接酶RING2 /
- BPDE-DNA加合物 /
- 周期检测点激酶1
Abstract:[Objective] To explore the role of ubiquitin protein ligase RING2 in the changes of BPDE-DNA adducts and checkpoint kinase 1 (CHK1) in human bronchial epithelial cells (BEAS-2B) exposed to benzo (a) pyrene (BaP).
[Methods] BESA-2B cells were exposed to BaP at concentrations of 0, 1, 2, 4, 8, 16, and 32μmol/L for 24h, respectively; BESA-2B cells were exposed to 16 μmol/L BaP for 0, 1, 2, 4, 8, 12, and 24 h, respectively. The expressions of RING2 were inhibited by small in terfering RNA (siRNA) in BEAS-2B cells, then the BESA-2B cells and BESA-2B (siRNA-RING2) cells were exposed to 16μmol/L BaP for 24 h. BPDE-DNA adducts were evaluated by fluorescent immunohistochemistry. The levels of CHK1 and CHK1 S345-p were detected by Western blot.
[Results] Compared with the normal control group, the fluorescence intensities were significantly elevated both in the BESA-2B cells and the BESA-2B (siRNA-RING2) cells exposed to BaP (P < 0.01), indicating elevated levels of BPDE-DNA adducts, and the fluorescence intensity of BESA-2B (siRNA-RING2) cells were increased by 32% compared with the BESA-2B cells. According to results of Western blot, the relative expression levels of CHK1 and CHK1 S345-p in BESA-2B cells were significantly elevated along with increasing concentration and exposure time (P < 0.01); the levels of CHK1 and CHK1 S345-p in BESA-2B (siRNA-RING2) cells exposed to 16 μmol/L BaP for 24 h were significantly decreased compared with the normal control group (P < 0.01). The results of factorial analysis showed both transfection and BaP treatment had impacts on the expression levels of CHK1 and CHK1 S345-p, as well as interactions between these two factors (P < 0.01). Compared with the BESA-2B cells, the difference between levels of CHK1 and CHK1 S345-p in BESA-2B (siRNA-RING2) cells exposed or non-exposed to BaP decreased by 54% or 51%. The results of covariance analysis showed that the estimated means of the levels of CHK1 and CHK1 S345-p (0.77 and 0.89 respectively) in BESA-2B (siRNA-RING2) cells were significantly lower than those in BESA-2B cells (1.24 and 1.32 respectively) (P < 0.01) with control of BaP exposure.
[Conclusion] The DNA of siRNA-RING2 cells are much more sensitive to BaP exposure than that of normal cells, which in dicates that RING2 may be involved in DNA repair by affecting the expression of CHK1 and CHK1 S345-p.
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环境中的多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbon，PAHs）主要是通过煤、原油等碳氢化合物的不完全燃烧所产生，其致癌性早在1876年就有报道。1930年，苯并[a]芘[benzo [a]pyrene，BaP]作为PAHs的一种，被认定为致癌物。焦炉工、化石燃料加工工人、长期吸烟和经常食用烧烤食品的人群被判定为BaP高暴露人群，且流行病学调查显示，长期接触BaP可增加肺癌和结肠癌的易感性[1-3]。2012年，国际癌症研究中心（IARC）将BaP认定为2A类致癌物。细胞实验表明，BaP进入机体后，经过细胞色素氧化酶P450s（CYP450）代谢成为终致癌物苯并[a]芘-7，8-二氢二醇-9，10-环氧化物[benzo（a）pyrene-7，8-dihyrodiol-9，10-epoxide，BPDE] [4]。BPDE具有亲电子性，容易与DNA的鸟嘌呤共价结合形成稳定的BDE-DNA加合物，导致DNA双螺旋结构受损[5]。当DNA受损时，机体会启动相应的DNA修复机制来进行修复，以保证遗传物质的稳定性。近年来的研究表明，表观遗传在DNA修复过程中发挥重要作用，其中组蛋白修饰的作用日益受到人们的重视[6]。本课题组前期研究表明，组蛋白H2A的单泛素化水平会影响BaP所致的DNA损伤修复[7]，而泛素连接酶RING2是其单泛素化过程中的关键酶。此外，有研究表明，组蛋白泛素化可能参与细胞周期的调控[8]。当DNA出现损伤时，机体会激活相应的DNA损伤检测点共济失调-毛细血管扩张突变激酶-周期检测点激酶2（ATM-CHK2）、共济失调-毛细血管扩张有关激酶-周期检测点激酶1（ATR-CHK1）通路，参与DNA损伤位点的识别、修复等[9]。其中ATR-CHK1通路在维持DNA复制过程中基因组的稳定性方面发挥重要作用。ATR-CHK1通路的活化会激活一系列的酶级联反应[10]，导致细胞周期阻滞，使受损的DNA有充足的时间来进行修复。考虑到泛素连接酶RING2可能通过调节组蛋白H2A的单泛素化水平，进而调控细胞周期进程来影响DNA的损伤修复，因此本研究以永生化人支气管上皮细胞（BEAS-2B）为对象，通过观察BaP染毒前后BEAS-2B和BEAS-2B（siRNA-RING2）细胞中BPDE-DNA加合物的量、CHK1及其磷酸化水平的变化，探讨泛素连接酶RING2在BaP致细胞DNA损伤中的作用及其对CHK1水平的影响。
1. 材料与方法
1.1 细胞株、主要试剂和仪器
人支气管上皮细胞株由首都医科大学田琳教授惠赠。BaP（批号WUD5H，Sigma，美国）；Lipofectamine RNAi MAX转染试剂（Invitrogen，美国）；RING2 siRNA序列（广州市锐博生物科技有限公司，中国）；BPDE-DNA抗体（Santa Cruz Biotechnology，美国）；Alexa Fluor 488山羊抗鼠抗体、CHK1鼠单克隆抗体（Proteintech，美国）；抗CHK1-Ser345抗体（Abcam，美国）；哺乳动物蛋白抽提试剂盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒、抗β-Actin鼠单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（北京康为世纪生物科技有限公司，中国）。二氧化碳培养箱（Heraeus，德国）；SpectraMaxM2型多功能酶联免疫检测仪（Molecular Divices，美国）；Olympus BX-51荧光显微镜（Olympus，日本）；DYY-7C型电泳仪（北京六一仪器厂，中国）；凝胶成像仪Universal Hood Ⅱ（BioRad，美国）。
1.2 方法
1.2.1 siRNA-RING2转染BEAS-2B细胞BEAS-2B（siRNA-RING2）
取适量处于对数生长期的BEAS-2B细胞混悬液均匀地铺于6孔板中，待细胞密度达到40%时进行转染。由广州锐博生物科技有限公司根据人RING2基因靶序列“ GGCAATAACAGATGGCTTA”设计RING2干扰序列5′GGCAAUAACAGAUGGCUUA dTdT 3′，3′dTdTCCGUUAUUG UCUACCGAAU 5′，阴性对照序列由该公司一并提供。用245 μL不含血清和双抗的培养基稀释5 μL 20 μmol/L siRNA，轻轻混匀，室温孵育5 min。用245 μL不含血清和双抗的培养基稀释5 μL lipofectamine RNAi MAX，轻轻混匀并室温孵育5 min。将两种混合液轻轻混匀，室温孵育20 min后，加入细胞密度40%的6孔培养板中。将培养板置于37℃、体积分数为5%CO2的培养箱中培养，6 h后将孔里含有混合液的培养基移去，更换新鲜的生长培养基，再培养24 h，之后进行染毒处理。
1.2.2 细胞染毒及处理
前期实验结果[7]显示，随着BaP染毒浓度和染毒时间的增加，H2A的单泛素化水平和S期阻滞会随之增加，但当浓度高于16 μmol/L时，细胞的H2A单泛素化水平会达到一个平台期，此时再增加BaP染毒浓度和染毒时间，H2A的单泛素化水平无明显改变，S期阻滞也不再增加，且细胞的活力会迅速下降，细胞大量死亡，无法进行之后的免疫荧光和免疫印记实验。在16 μmol/L染毒达到24 h时，此时细胞的活力还比较高，且BaP导致的DNA损伤和S期阻滞都比较明显，因此选用16 μmol/L BaP染毒不同时间点，又选用24 h作为不同浓度BaP染毒的观察时间。
用不同浓度的BaP（0、1、2、4、8、16、32 μmol/L）染毒BEAS-2B细胞24 h，以16 μmol/L BaP染毒BEAS-2B细胞不同时间（0、1、2、4、8、12、24 h）；用16 μmol/L BaP染毒BEAS-2B和BEAS-2B（siRNA-RING2）细胞24 h，各组设3个平行样。以未染毒组为空白对照组，体积分数0.1%DMSO处理组为溶剂对照组，阴性对照序列组作为干扰阴性对照组。
1.2.3 免疫荧光法检测细胞BPDE-DNA加合物的含量
细胞染毒结束后，加适量质量分数为4%的多聚甲醛室温固定1 h，用体积分数为0.1%的TritonX-100室温通透30 min，之后用RNAse A（100 μg/mL，37℃，1 h）和蛋白激酶K（10μg/mL，室温，30min）进行处理，用4mol/L HC（l室温，10 min）变性，50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris-base）（室温，5 min）进行中和，随后用BSA封闭1 h，滴加BPDE-DNA抗体（抗体与稀释液的体积比为1:50），4℃孵育过夜。第二天用滴加Alexa Fluor 488山羊抗鼠抗体（抗体与稀释液的体积比为1: 200），37℃孵育1 h，接着滴加4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，抗体与稀释液的体积比为1:1 000）室温孵育10min；PBS冲洗3min，3次后，用激光共聚焦仪检测BPDE-DNA加合物的表达。采用Olympus BX-51荧光显微镜进行图像采集，用FV10-ASW软件对各组荧光强度进行分析。
1.2.4 Western blot检测CHK1及其磷酸化水平
各组细胞染毒结束后，用质量分数为0.25%的胰酶消化细胞，D-hanks平衡盐溶液清洗2遍，收集至1.5 mL离心管中。按哺乳动物蛋白抽提剂试剂盒说明书提取蛋白，采用BCA蛋白定量法测各组蛋白浓度，将各组蛋白浓度调至同一浓度，加入相应的蛋白示踪上样缓冲液。取约50 μg总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳（SDS-PAGE）。电泳后湿转至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidenefluoride，PVDF）膜上，用质量分数为5%的脱脂奶粉室温封闭2 h后，加入CHK1及CHK1 S345-p抗体孵育，4℃过夜。PBS漂洗10 min，3次，加入相对应的二抗37℃孵育2 h，PBS漂洗10 min，3次。用Bio-Rad凝胶成像仪进行检测，用Quantity One-4.6.5软件进行读数，得到各组的灰度值。
1.3 统计学分析
用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以
x ± s表示，不同组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD法。采用2×2析因分析比较各处理因素对检测指标的单独效应和交互效应。以α=0.05为检验水准。2. 结果
2.1 泛素连接酶RING2对BaP所致细胞BPDE-DNA加合物的影响
如图 1所示，用16 μmol/L BaP染毒BEAS-2B和BEAS-2B（siRNA-RING2）细胞24 h后，各染毒组（C2、E2和G2）的荧光强度较正常组（A2）分别增加了59%、61%和110%，差异有统计学意义（P < 0.01），说明染毒后BPDE-DNA加合物表达增加。BEAS-2B（siRNA-RING2）染毒组（G2）的荧光强度较BEAS-2B染毒组（C2）增加了32%，差异有统计学意义（P < 0.01）。溶剂对照组、阴性序列干扰组、RING2序列干扰组与正常组相比，BPDE-DNA加合物表达差异无统计学意义（P=0.422），正常细胞染毒组（C2）与阴性序列干扰后染毒组（E2）差异无统计学意义（P=0.864）。
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图 1BaP染毒转染前后各组细胞BPDE-DNA加合物的情况
[注]图中A1~G1是4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色结果，A2~G2是BPDE-DNA加合物染色结果，其中A是正常细胞培养组，B是正常细胞的溶剂对照组，C是正常细胞16 μmol/L BaP染毒24 h组，D是阴性序列干扰对照组，E是阴性序列干扰后16 μmol/L BaP染毒24 h组，F是RING2 干扰组，G是RING2 干扰后16 μmol/L BaP染毒24 h组。C2、E2、G2较A2相比，荧光强度增加（P < 0.01），G2较C2荧光更强（P < 0.01），C2与E2差异无统计学意义（P =0.864）。Figure 1. Changes of BPDE-DNA adducts in BEAS-2B cells with different treatments[Note]Results of confocal analysis with immunostaining of 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (blue) in Figure A1-G1 and BPDE-DNA adducts (green) in Figure A2-G2. BEAS-2B, BEAS-2B (Si-NC), BEAS-2 (Si-RING2 ) are cultured withou (t Figure A, D, and F, respectively) or with (Figure C, E, and F, respectively)16 μmol/L BaP. The solvent control group of BEAS-2B shows in Figure B. The levels of fluorescence intensity are significantly higher in Figure C2, E2, and G2 than in Figure A2 (P < 0.01), and the level of Figure G2 is increased compared with Figure C2 (P < 0.01). However, no significant difference is found between Figure C2 and Figure E2 (P =0.864).2.2 BaP对CHK1及CHK1 S345-p表达水平变化的剂量效应与时间效应
图 2显示，用不同浓度BaP处理BEAS-2B细胞24h（图A1、A2）以及用16 μmol/L BaP处理BEAS-2B细胞不同时间（图B1、B2）的蛋白检测结果。随着染毒浓度和染毒时间的增加，CHK1及CHK1 S345-p的水平均增加（P < 0.01）。不同染毒浓度组中，32 μmol/L BaP组的CHK1和CHK1 S345-p的含量较正常组分别增加了59%和98%，差异有统计学意义（P < 0.05）；不同染毒时间点中，24 h的CHK1和CHK1 S345-p的含量较正常组分别增加了62%和109%，差异有统计学意义（P < 0.05）。CHK1的水平在16 μmol/L BaP染毒24 h后达到峰值，之后随着浓度的增加，其表达水平基本不变，差异无统计学意义（P=0.326）；但其磷酸化水平依然增加，差异有统计学意义（P < 0.05）。溶剂对照组与正常组相比，两种蛋白表达量差异均无统计学意义（分别为P=0.668和P=0.761）。
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图 2BaP不同染毒浓度（A1、A2）处理24h和16μmol/L Bap染毒不同时间（B1、B2）对BEAS-2B细胞CHK1及CHK1 S345-p表达的影响
[注]*、#：与正常对照组相比，P < 0.05。Figure 2. Protein expression of CHK1 and CHK1 S345-p in BEAS-2B cells exposed to different concentrations of BaP for 24 h (A1, A2) or to 16μmol/L BaP for different time (B1, B2)[Note]*, #: Compared with the normal control group,P < 0.05.2.3 泛素连接酶RING2对BaP所致细胞CHK1及CHK1 S345-p表达水平的影响
本次实验采用SiRNA技术沉默RING2，经检测，干扰后可以使泛素连接酶RING2的表达水平下调72% [7]，此水平满足后续实验需求。如图 3和表 1、表 2所示，用16 μmol/L BaP染毒BEAS-2B和BEAS-2B（siRNA-RING2）细胞24 h后，BESA-2B组的CHK1及CHK1 S345-p的水平分别比不染毒组增加了48%和65%；而BESA-2B（siRNA-RING2）组CHK1及CHK1 S345-p的水平分别下降了45%和28%，差异有统计学意义（P < 0.01）。析因分析结果显示，转染与染毒均对CHK1及CHK1 S345-p的水平有影响，且转染与染毒之间存在交互效应（P < 0.01）。转染后染毒组CHK1及CHK1 S345-p水平比非染毒组的低，差异为负值，而正常细胞染毒组与不染毒组间的差异为正值。因此，转染后染毒组与不染毒组两种蛋白水平的差异较正常细胞组的差异分别降低了46%和49%。协方差分析控制染毒因素后，BESA-2B（siRNA-RING2）组CHK1及CHK1 S345-p水平的修正均数（0.77和0.89）较BEAS-2B组的修正均数（1.24和1.32）明显降低，差别有统计学意义（P < 0.01）。溶剂对照组、阴性序列干扰组与正常组相比差异均无统计学意义（P > 0.05）。
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图 3BaP染毒转染前后各组细胞CHK1及CHK1 S345-p的变化情况
Figure 3. Changes of protein expression of CHK1 and CHK1 S345-p in BEAS-2B cells with different treatments表 1CHK1的相对表达量及转染、染毒因素的效应分析
Table 1. Relative expression of CHK1 and effect analysis on transfection and exposure factors是否转染
Transfection or notBaP（μmol/L） 染毒的单独效应
Effect of BaP only0 16 BEAS-2B 1.00 1.48a 0.48 BESA-2B（siRNA-RING2） 0.99 0.55a -0.44 转染的单独效应
Effect of transfection only-0.01 -0.93 -0.46（交互效应）
-0.46(Interaction effect)[注]a：与BEAS-2B 0μmol/L Bap组相比，P < 0.05。
[Note]a：Compared with the BEAS-2B 0μmol/L Bap group，P < 0.05.表 2CHK1 S345-p的相对表达量及转染、染毒因素的效应分析
Table 2. Relative expression of CHK1 S345-p and effect analysis on transfection and exposure factors是否转染
Transfection or notBaP（μmol/L） 染毒的单独效应
Effect of BaP only0 16 BEAS-2B 1.00 1.65a 0.65 BESA-2B（siRNA-RING2） 1.05 0.72a -0.33 转染的单独效应
Effect of transfection only0.05 -0.93 -0.49（交互效应）
-0.49(Interaction effect)[注]a：与BEAS-2B 0μmol/L Bap组相比，P < 0.05。
[Note]a：Compared with the BEAS-2B 0μmol/L Bap group，P < 0.05.3. 讨论
PAHs包含萘、蒽、菲、芴、芘等150多种化合物，BaP常作为PAHs的代表物被研究。动物实验和流行病学研究表明，动物和人类肺癌的发生与BaP的暴露有一定的关系[11]。BaP在机体内经过一系列反应后与DNA共价结合形成BPDE-DNA加合物，此加合物是导致细胞发生癌变的源头[12]。Einaudi等[13]学者研究表明，细胞内的BPDE-DNA加合物随着接触BaP时间的延长而增加。本次结果表明，BPDE-DNA加合物的量随着BaP染毒浓度和染毒时间的增加而增加，提示随着BaP染毒浓度和时间的增加，DNA损伤越来越严重，这与本课题组之前的彗星试验[14]和ELISA [15]法检测结果相一致。
正常情况下，组蛋白与DNA超螺旋形成致密的核小体，这种结构可以对DNA起到保护作用[16]。当出现DNA损伤时，这种致密结构使得相应的损伤识别因子、修复因子等不能很好地识别损伤位点，从而影响受损DNA的修复。近年来，组蛋白的修饰在DNA损伤修复过程中的作用受到人们的重视，Bergink [17]与Zhu等[18]学者认为，组蛋白的单泛素化修饰的作用与DNA修复有着密切的关系，而泛素连接酶RING2由于其特异识别底物的能力，在组蛋白单泛素化的过程中起着关键性的作用。在机体应答DNA损伤过程中，RING2起着保护性的作用[19]，当RING2表达量受限时，会影响受损DNA的修复。本次实验证明，RING2低表达的细胞对BaP更为敏感，DNA损伤更严重，此结果与Gieni等[20]学者的观点相符。
本课题组前期结果显示，BaP会导致BEAS-2B细胞阻滞在S期[21]。DNA受损时，真核生物会激活相应的信号通路阻止复制叉的进行从而使细胞周期阻滞，DNA得以有时间进行修复。彗星实验结果显示，碱性（pH=12.1）电泳[22]检测出BaP所致的DNA损伤与紫外线所致的DNA损伤相似，都是以单链损伤为主。单链损伤主要由ATR-CHK1 [23]信号通路来识别，CHK1在感应到损伤后，其Ser345位点被磷酸化激活，从而磷酸化下游的细胞分裂周期蛋白25A（Cdc25A），导致Cdc25A抑制、水解，进而导致周期素依赖性蛋白激酶2（Cdk2）的抑制性磷酸化位点不能被去磷酸化激活，最终导致细胞周期阻滞[24-25]。本次实验结果显示，随着染毒时间和染毒剂量的增加，CHK1及CHK1 S345-p的表达量增加，与前期S阻滞结果相一致，而RING2低表达的细胞，CHK1及CHK1 S345-p的水平均下降。析因分析表明，染毒和RING2两种因素都会对CHK1及其磷酸化水平产生影响，从而影响细胞周期的进程；用协方差分析平衡染毒因素后，观察RING2的作用，发现RING2低表达的细胞中，CHK1及其磷酸化水平均降低，进一步说明了RING2的存在有助于受损DNA的修复。
本次研究表明，泛素连接酶RING2低表达后，会下调CHK1的表达水平及磷酸化水平，进而影响细胞周期的进程，导致BPDE-DNA加合物增多，DNA损伤加重。本次实验通过siRNA干扰RING2前后，BPDEDNA加合物的水平变化，CHK1及CHK1 S345-p表达量的差异，在细胞水平上阐明了泛素连接酶RING2可能在BaP所致DNA损伤修复中的作用。但RING2所致的组蛋白H2A单泛素化与周期检测点激酶对DNA损伤的识别之间有无其他机制参与尚不清楚，有待于进一步研究。
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图 1
BaP染毒转染前后各组细胞BPDE-DNA加合物的情况
[注]图中A1~G1是4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色结果，A2~G2是BPDE-DNA加合物染色结果，其中A是正常细胞培养组，B是正常细胞的溶剂对照组，C是正常细胞16 μmol/L BaP染毒24 h组，D是阴性序列干扰对照组，E是阴性序列干扰后16 μmol/L BaP染毒24 h组，F是
RING2 干扰组，G是RING2 干扰后16 μmol/L BaP染毒24 h组。C2、E2、G2较A2相比，荧光强度增加（P < 0.01），G2较C2荧光更强（P < 0.01），C2与E2差异无统计学意义（P =0.864）。Figure 1. Changes of BPDE-DNA adducts in BEAS-2B cells with different treatments
[Note]Results of confocal analysis with immunostaining of 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (blue) in Figure A1-G1 and BPDE-DNA adducts (green) in Figure A2-G2. BEAS-2B, BEAS-2B (Si-NC), BEAS-2 (Si-
RING2 ) are cultured withou (t Figure A, D, and F, respectively) or with (Figure C, E, and F, respectively)16 μmol/L BaP. The solvent control group of BEAS-2B shows in Figure B. The levels of fluorescence intensity are significantly higher in Figure C2, E2, and G2 than in Figure A2 (P < 0.01), and the level of Figure G2 is increased compared with Figure C2 (P < 0.01). However, no significant difference is found between Figure C2 and Figure E2 (P =0.864).![]()
图 2
BaP不同染毒浓度（A1、A2）处理24h和16μmol/L Bap染毒不同时间（B1、B2）对BEAS-2B细胞CHK1及CHK1 S345-p表达的影响
[注]*、#：与正常对照组相比，
P < 0.05。Figure 2. Protein expression of CHK1 and CHK1 S345-p in BEAS-2B cells exposed to different concentrations of BaP for 24 h (A1, A2) or to 16μmol/L BaP for different time (B1, B2)
[Note]*, #: Compared with the normal control group,
P < 0.05.![]()
图 3
BaP染毒转染前后各组细胞CHK1及CHK1 S345-p的变化情况
Figure 3. Changes of protein expression of CHK1 and CHK1 S345-p in BEAS-2B cells with different treatments
表 1
CHK1的相对表达量及转染、染毒因素的效应分析
Table 1 Relative expression of CHK1 and effect analysis on transfection and exposure factors
是否转染
Transfection or notBaP（μmol/L） 染毒的单独效应
Effect of BaP only0 16 BEAS-2B 1.00 1.48a 0.48 BESA-2B（siRNA-RING2） 0.99 0.55a -0.44 转染的单独效应
Effect of transfection only-0.01 -0.93 -0.46（交互效应）
-0.46(Interaction effect)[注]a：与BEAS-2B 0μmol/L Bap组相比，P < 0.05。
[Note]a：Compared with the BEAS-2B 0μmol/L Bap group，P < 0.05.
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表 2
CHK1 S345-p的相对表达量及转染、染毒因素的效应分析
Table 2 Relative expression of CHK1 S345-p and effect analysis on transfection and exposure factors
是否转染
Transfection or notBaP（μmol/L） 染毒的单独效应
Effect of BaP only0 16 BEAS-2B 1.00 1.65a 0.65 BESA-2B（siRNA-RING2） 1.05 0.72a -0.33 转染的单独效应
Effect of transfection only0.05 -0.93 -0.49（交互效应）
-0.49(Interaction effect)[注]a：与BEAS-2B 0μmol/L Bap组相比，P < 0.05。
[Note]a：Compared with the BEAS-2B 0μmol/L Bap group，P < 0.05.
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