砷（arsenic, As）作为常见的类金属元素，主要以有机As或无机As（inorganic arsenic, iAs）化合物的形式存在于自然界中，其合成的大部分化合物均有毒，其中iAs的毒性更强。长期的iAs暴露不仅能导致心血管系统及神经系统等的多种疾病^[1]，还可引起多种癌症的发生^[2]。砷暴露将降低多种细胞的活力、促进细胞发生凋亡及代谢异常等^[3]。甲状腺在调节新陈代谢、体温、心率和生长发育等方面起着关键作用。甲状腺激素对于维持身体的正常功能至关重要。甲状腺功能异常与多种健康问题相关，包括肥胖、糖尿病、心血管疾病和心理健康问题^[4]。我国甲状腺疾病发病率较高，患者主要是女性，因现代人们生活方式的逐渐改变，相应的甲状腺疾病发病率也呈现增长趋势^[5]。研究表明，砷暴露可能会干扰甲状腺激素的合成和分泌，导致甲状腺功能异常^[6–7]。伴随iAs毒性作用的更加深入研究，砷暴露可对多个内分泌器官产生影响，从而影响其功能，其功能异常与砷暴露之间的关系现已成为iAs引发中毒机制的研究热点，但是砷暴露致甲状腺损伤的机制尚不明确。

研究发现，iAs被认为是雌激素内分泌干扰物，通过发挥雌激素样效应，对内分泌稳态造成影响^[8–9]。雌激素可通过经典的基因组和非基因组途径发挥其促生长作用，并通过膜结合雌激素受体（estrogen receptor, ER）介导，通过该受体激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B, AKT）信号通路^[10]，ER和PI3K/AKT信号通路的异常高表达与甲状腺癌的发生发展密切相关^[11]。甲状腺功能损伤作为一种常见的甲状腺病理状态，与甲状腺癌的发展存在潜在联系。提示砷致甲状腺损伤的发生机制可能与ER和PI3K/AKT信号通路有关。雌激素受体抑制剂（ICI182780）是一种新型雌激素受体拮抗剂，目前发现只具有单纯拮抗雌激素作用^[12]。本研究拟通过ICI182780干预ER-PI3K/AKT通路观察砷雌激素样效应指标的逆向变化及相互影响。

本课题以人甲状腺正常细胞Nthy-ori3-1为研究对象，明确砷暴露对Nthy-ori3-1增殖和凋亡的作用途径，进一步探索其分子机制，为深入认识iAs导致甲状腺雌激素样效应的危害，并早期采取防治措施提供实验依据。

1.   材料与方法

1.1   细胞株

人甲状腺正常细胞（Nthy-ori3-1细胞），购自中国北纳生物公司。

1.2   主要仪器与试剂

倒置荧光显微镜（日本Olympus）；免疫印迹法（Western blot, WB）电泳及电转装备（美国Bio-Rad）；高速冷冻离心机、全波长酶标仪、CO₂培养箱、实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR, qRT-PCR）扩增仪（美国Thermo Fisher Scientific）。

亚砷酸钠（NaAsO₂，分析纯，北京化学试剂三厂）；ICI182780（HY-13636，美国MedChemExpress）；胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）、RPMI-1640完全培养基、0.25% 胰酶（以色列BI）、磷酸盐缓冲液（phosphate-Buffered Saline, PBS，美国HyClone）；高效放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay, RIPA）裂解液（R0010）、TriQuick Reagent总RNA提取试剂（R1100）、Hoechst 33342（C0031）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, BCA）蛋白浓度测定试剂盒（PC0020）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacryamide gel electropHoresis, SDS-PAGE）凝胶制备试剂盒（P1200）均购于中国北京索莱宝；三色预染marker（北京博泰斯）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8, CCK-8试剂）、细胞髓样肉瘤癌基因（Cellular Myelocytomatosis oncogene, c-MYC）单克隆抗体（1∶5000）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）单克隆抗体（1∶15000）购于中国武汉三鹰；兔抗人Bax抗体（1∶2000）、兔抗人Bcl-2抗体（1∶2000）购于中国沈阳万类；PI3K（1∶1000）、磷酸化PI3K（p-PI3K, 1∶1000）、AKT（1∶1000）、磷酸化AKT（p-AKT，1∶1000）均购于美国CST；鼠抗人ERα/β单克隆抗体（1∶2000）、二抗为辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）（1∶15000）和HRP标记的山羊抗兔IgG（H+L）（1∶15000）购于美国Affinity；cDNA逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒（日本TaKaRa）。

1.3   细胞培养及分组

取出冻存于液氮罐中的Nthy-ori3-1细胞，37 ℃水浴锅消融后移至超净台后迅速加入含有10% FBS的RPMI-1640培养基，于37 ℃、5% CO₂条件下温箱培养，次日同一时间换液。当细胞长至80%，用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，传代培养。选用对数生长期细胞，开展实验，根据预实验结果确定NaAsO₂干预细胞时长为24 h，实验分组按照NaAsO₂干预细胞半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration, IC₅₀）4.034 μmol·L⁻¹分为0、1、2、4 μmol·L⁻¹组，对应对照组（0 μmol·L⁻¹ NaAsO₂）、1 μmol·L⁻¹ NaAsO₂组、2 μmol·L⁻¹ NaAsO₂组、4 μmol·L⁻¹ NaAsO₂组。1 μmol·L⁻¹ ICI182780按照使用说明书确定干预时长24 h，实验分组为1 μmol·L⁻¹ NaAsO₂+ICI182780组、2 μmol·L⁻¹ NaAsO₂+ICI182780组、4 μmol·L⁻¹ NaAsO₂ +ICI182780组。

1.4   CCK-8法检测细胞增殖

选用对数生长期的细胞，将其接种到96孔板，每孔个数3×10³个，并设置3个复孔，37 ℃培养箱过夜，细胞贴壁后，给予不同浓度NaAsO₂干预24、36、48 h，次日同一时间每孔加10 μL CCK-8试剂，37 ℃培养箱培养2 h，酶标仪测450 nm光密度值。

1.5   平板克隆实验检测细胞集落形成能力

使用3.5 cm小皿进行克隆形成试验，将不同分组的细胞以1×10³个细胞·皿⁻¹进行常规培养，继续培养2周并出现肉眼可见的单个细胞克隆集落，立即停止培养，中途每隔2~3 d进行培养基更换，及时观察细胞的生长状态；克隆完成后，PBS洗3次，每个小皿加2 mL 4%多聚甲醛固定液，固定30 min，PBS洗3次；继续加入2 mL结晶紫染液，染色时间10 min；PBS洗数次，清洗干净后晾干，拍照并统计数据。

1.6   Hoechst染色法检测细胞凋亡

将每组Nthy-ori3-1细胞制成5×10⁴·mL⁻¹细胞悬液，将其接种在6孔细胞培养板内，次日，细胞贴壁后，PBS洗3次，10 min·次⁻¹；加入4%多聚甲醛固定液，将细胞固定30 min，弃去固定液，PBS洗3次，10 min·次⁻¹；每孔加入1 mL的Hoechst 33342（10 μg·mL⁻¹）稀释液继续染色15 min，弃去染色液，PBS洗3次，10 min·次⁻¹；最后一次加入1 mL PBS，放在荧光倒置显微镜下，观察细胞核的蓝色荧光染色及分析细胞核形态学是否改变；出现细胞核体积缩小、固缩、染色质浓缩则判断该细胞发生凋亡。

1.7   qRT-PCR测定ERα、ERβ、c-MYC、Bax、Bcl-2 mRNA表达水平

收集每组对数生长期细胞，利用Trizol试剂法提取RNA，测定RNA的浓度及纯度。根据反转录试剂盒说明书，以总RNA为模板反转录合成cDNA，利用Primer-Blast软件设计针对ERα、ERβ、c-MYC、Bax、Bcl-2的PCR引物并由生物工程（中国上海）有限公司合成，引物序列详见表1。根据荧光定量试剂盒说明书内容，建立荧光定量PCR反应体系，采用2^−ΔΔCt值表示mRNA的相对表达量。

表  1  实验中所使用mRNA引物序列

Table  1.  mRNA primer sequences used in the experiment

基因	引物序列（5'→3'）
	上游	下游
GAPDH	TGTTCGTCATGGGTGTGAAC	TCATGAGTCCTTCCACGATACC
ERα	GGAGACGGACCAAAGCCACT	TTCCCAACAGAAGACAGAAGATG
ERβ	GCTGAACGCCGTGACCGATGCT	CCCGTGATGGAGGACTTGC
c-MYC	GGTGATGTCACCAGCCTGAG	CTTCTGGCAGTGGAGGTTCC
Bax	CCAGAGGCGGGGGATGATTG	GCAGGGTAGATGAATCGGGG
Bcl-2	TTTGTGGAACTGTACGGCCC	TCACTTGTGGCTCAGATAGGC
[注] 扩增条件为95 ℃预变性30 s；PCR反应95 ℃变性5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。每个样本做3次重复实验。

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1.8   WB法检测细胞中ERα、ERβ、PI3K、AKT、c-MYC、Bax、Bcl-2蛋白表达水平

收集每组对数生长期细胞沉淀，于细胞裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂混合物中冰上静置30 min，然后在温度4 ℃，以12000 r·min⁻¹的速度离心15 min，取细胞上清进行BCA蛋白定量。取20 μg蛋白经10% SDS-PAGE凝胶中进行电泳、电转，将蛋白转膜，10%脱脂奶粉于室温封闭2 h，一抗室温孵育100 min，兔或鼠的二抗室温继续孵育2 h，应用增强化学发光（enhanced chemiluminescence, ECL）高灵敏凝胶成像仪显影。

1.9   统计学方法

使用GraphPad Prism.v 7.0软件和SPSS 19.0软件进行数据处理与统计学分析，数据结果以$ {{\bar X}}\pm S $表示，应用One-Way ANOVA比较多组间变量，两两组间比较时，方差齐运用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2.   结果

2.1   NaAsO₂对Nthy-ori3-1细胞活力的影响

CCK-8检测不同浓度（0、1.6、2.0、3.6、4.0、5.0、6.0 μmol·L⁻¹）的NaAsO₂对Nthy-ori3-1细胞染毒24 h后细胞活性。结果如图1显示，NaAsO₂染毒浓度逐渐增高，Nthy-ori3-1细胞活力逐级降低，结果呈现剂量依赖性；当染毒浓度到达4 μmol·L⁻¹时，Nthy-ori3-1细胞的存活率已急剧下降约至50%；计算NaAsO₂的IC₅₀为4.034 μmol·L⁻¹，因此选择1、2、4 μmol·L⁻¹ NaAsO₂组持续作用Nthy-ori3-1细胞24 h，再进行后续实验研究。

图  1  NaAsO₂对Nthy-ori3-1细胞活力的影响

Figure  1.  Effect of NaAsO₂ on the viability of Nthy-ori3-1 cells

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2.2   NaAsO₂对Nthy-ori3-1细胞形态和增殖能力的影响

经NaAsO₂处理Nthy-ori3-1细胞24 h，对照组Nthy-ori3-1细胞呈上皮样，形状多为多边形或梭形，其排列紧密，每个细胞界限清晰。NaAsO₂染毒24 h后，细胞体积变大，甚至变圆并脱落，细胞间隙增加，排列松散；当NaAsO₂染毒浓度逐渐递增，每组细胞开始出现不同程度的死亡现象，当NaAsO₂浓度达4 μmol·L⁻¹时，细胞趋向死亡数目最多；与1、2、4 μmol·L⁻¹ NaAsO₂组比较，经ICI182780干预同剂量NaAsO₂染毒组后，可在一定程度上恢复细胞生长状态，细胞存活数量增加，细胞活力增强，见图2A。CCK-8结果显示，染毒24、36以及48 h时与对照组相比，1、2、4 μmol·L⁻¹ NaAsO₂组抑制Nthy-ori3-1细胞增殖能力（P＜0.001），见图2B；平板克隆实验结果表明，Nthy-ori3-1细胞集落形成能力呈浓度梯度降低（P＜0.001），见图2C；与Nthy-ori3-1细胞的同剂量染NaAsO₂组比较，经ICI182780干预的1、2、4 μmol·L⁻¹ NaAsO₂+ICI182780组细胞的增殖能力、集落形成能力得到恢复（P＜0.001，P＜0.01），见图2B、2C。

图  2  NaAsO₂对Nthy-ori3-1细胞形态和增殖能力的影响（n=3）

A：各组Nthy-ori3-1细胞的生长状态（倒置显微镜，×200）；B：各组Nthy-ori3-1细胞的CCK-8实验结果；C：各组Nthy-ori3-1细胞的平板克隆实验结果；***：与对照组比较，P＜0.001；与Nthy-ori3-1细胞的同剂量染NaAsO₂组比较，+++：P＜0.001，++：P＜0.01。

Figure  2.  Effects of NaAsO₂ on the morphology and proliferation capacity of Nthy-ori3-1 cells (n=3)

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2.3   NaAsO₂对Nthy-ori3-1细胞凋亡变化的影响

Hoechst 33342染色结果显示，对照组的细胞核染色均匀，轮廓清晰，有弱蓝色荧光，染色质浓缩现象不明显；1、2、4 μmol·L⁻¹ NaAsO₂组细胞核呈亮蓝色，各组细胞核的蓝色荧光随NaAsO₂染毒剂量增加逐渐增亮，细胞核固缩，染色质浓缩现象加重。砷与ICI182780联合作用下，与同剂量NaAsO₂组相比，亮蓝色荧光有所减少，染色质浓缩现象相应减轻（P＜0.001），见图3。

图  3  NaAsO₂对Nthy-ori3-1细胞凋亡的影响（n=3）

各组Nthy-ori3-1细胞的Hoechst 33342染色结果。蓝色：细胞核染色；***：与对照组比较，P＜0.001；+++：与Nthy-ori3-1细胞的同剂量染NaAsO₂组比较，P＜0.001。

Figure  3.  Effect of NaAsO₂ on apoptosis in Nthy-ori3-1 cells (n=3)

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2.4   NaAsO₂对Nthy-ori3-1细胞c-MYC、Bcl-2、Bax基因及蛋白表达的影响

qRT-PCR实验测定各组Nthy-ori3-1细胞c-MYC、Bax、Bcl-2 mRNA表达水平结果显示，与对照组相比，1、2、4 μmol·L⁻¹ NaAsO₂组c-MYC、Bcl-2 mRNA表达水平降低，而Bax mRNA表达水平升高，差异均有统计学意义（P＜0.001）；与Nthy-ori3-1细胞的同剂量染NaAsO₂组比较，经ICI182780干预的NaAsO₂染毒组的细胞内c-MYC、Bcl-2 mRNA表达升高，Bax mRNA表达降低（P<0.001，P＜0.01），见图4A；WB实验结果与qRT-PCR一致（P<0.001，P＜0.01），见图4B。

图  4  NaAsO₂对Nthy-ori3-1细胞c-MYC、Bax、Bcl-2基因及蛋白的表达影响（n=3）

A：各组Nthy-ori3-1细胞的qRT-PCR结果；B：各组Nthy-ori3-1细胞WB实验结果；***：与对照组比较，P＜0.001；与Nthy-ori3-1细胞的同剂量染NaAsO₂组比较，+++：P＜0.001，++：P＜0.01。

Figure  4.  Effects of NaAsO₂ on the expression of c-MYC, Bax, and Bcl-2 genes and proteins in Nthy-ori3-1 cells (n=3)

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2.5   NaAsO₂对Nthy-ori3-1细胞ER-PI3K/AKT信号通路mRNA及蛋白表达的影响

qRT-PCR实验检测各组细胞内ERα、ERβ mRNA表达水平，结果显示，与对照组相比，1、2、4 μmol·L⁻¹ NaAsO₂组ERα、ERβ mRNA表达水平逐渐下降（P＜0.001），见图5A。WB实验测定各组Nthy-ori3-1细胞ERα、ERβ、PI3K、AKT及p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平。如图所示，与对照组相比，1、2、4 μmol·L⁻¹ NaAsO₂组ERα、ERβ、p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平随染砷浓度的增加逐渐下降（P＜0.001），见图5B、5C；PI3K、AKT蛋白相对表达量差异无统计学意义（P＞0.05），见图5B、5C；在ICI182780联合处理细胞后，与Nthy-ori3-1细胞的同剂量染NaAsO₂组比较，PI3K、AKT蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），ERα、ERβ、p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平升高，差异有统计学意义（P<0.001，P＜0.01），见图5B、5C。

图  5  NaAsO₂对Nthy-ori3-1细胞ER-PI3K/AKT信号通路 mRNA及蛋白表达的影响（n=3）

A：各组Nthy-ori3-1细胞ERα、ERβ的qRT-PCR实验结果；B：各组Nthy-ori3-1细胞的WB结果；C：各组Nthy-ori3-1细胞内ERα、ERβ、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表达水平；***：与对照组比较，P＜0.001；与Nthy-ori3-1细胞的同剂量染NaAsO₂组比较，+++：P＜0.001，++：P＜0.01。

Figure  5.  Effects of NaAsO₂ on the mRNA and protein expressions of the ER-PI3K/AKT signaling pathway in Nthy-ori3-1 cells (n=3)

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3.   讨论

流行病学资料和体内动物实验发现砷暴露可对甲状腺和其功能造成不同程度的损伤^[13]。然而，砷暴露对人甲状腺Nthy-ori3-1细胞的毒性作用目前鲜见相关的报道。本研究以人甲状腺Nthy-ori3-1细胞为主要研究对象，深入探讨砷暴露对甲状腺细胞的毒性作用及内分泌干扰机制。砷暴露的个体易患各种疾病，包括肺、皮肤和膀胱的损伤和促进癌症发生^[14]。研究显示，长期接触低剂量砷诱导有氧糖酵解，导致细胞异常增殖^[15]。长期暴露于低剂量亚砷酸钠会异常保留有丝分裂，有助于建立遗传不稳定性并使细胞易于发生肿瘤^[16]。慢性砷暴露通过凋亡相关因子/凋亡相关因子受体通路诱导大鼠神经细胞凋亡^[17]。细胞异常增殖和凋亡涉及多种基因的激活、表达以及调控等作用，砷致甲状腺细胞凋亡的毒性作用机制尚未完全明确，目前砷与雌激素样效应的相互作用引起广泛关注。PI3K/AKT信号通路与细胞存活、增殖、凋亡密切相关。PI3K/AKT信号通路主要是通过PI3K活化即可激活AKT，AKT进一步磷酸化，发生磷酸化后的AKT（p-AKT）可启动其下游抑凋亡因子Bcl-2及促凋亡因子Bax，介导细胞发生凋亡，从而导致其功能障碍^[18–19]。AKT的磷酸化是一个决定其活性的关键后修饰。只有当AKT被磷酸化时，它才是活跃的。研究显示，砷性肿瘤的发生可能与p-AKT蛋白表达水平增高有关，砷通过激活PI3K/AKT信号通路，抑制永生化人上皮细胞（Hacat）的凋亡发生促使其发生恶性转化^[20]。砷暴露能够干扰ER的表达，而ER异常表达又与甲状腺癌的发生发展密切相关^[21]。研究发现，ER信号通路和PI3K通路可能存在交叉调节^[22]。因此本研究进一步推测，NaAsO₂染毒抑制Nthy-ori3-1细胞的增殖能力和促进凋亡的发生是否与ER-PI3K/AKT信号通路有关。

本研究通过NaAsO₂染毒Nthy-ori3-1细胞发现，随着染毒浓度升高，细胞存活率呈剂量依赖性降低，Hoechst 33342染色进一步证实NaAsO₂对Nthy-ori3-1细胞的凋亡具有促进作用。Western blot分析表明，c-MYC和Bcl-2蛋白表达随砷剂量递增而下调，Bax蛋白表达则同步上调。值得注意的是，ERα/β及p-PI3K/p-AKT信号通路关键蛋白表达均呈现剂量依赖性抑制，且ICI182780干预可逆转上述蛋白变化趋势，提示砷通过ER介导的雌激素样效应调控PI3K/AKT信号通路，进而影响细胞增殖与凋亡平衡。甲状腺功能损伤引起的甲状腺癌风险，亚砷酸钠对Nthy-ori3-1细胞的影响在短期内，其抑制增殖和促进凋亡的作用可能有助于清除潜在的异常细胞，从而降低甲状腺癌的风险。长期来看，持续的细胞损伤和凋亡可能促使甲状腺组织的再生和重塑，进而可能导致癌变的风险增加。因此，NaAsO₂对Nthy-ori3-1细胞的影响是否促进或抑制甲状腺癌的发生，取决于多种因素，包括暴露时间、剂量、细胞环境和个体的遗传易感性。今后课题组在研究此类关系时，应综合考虑以上因素，并进行更深入的机制研究。

综上所述，NaAsO₂对Nthy-ori3-1细胞增殖具有抑制作用，抑制作用随作用时间和作用浓度的递增而增强，对Nthy-ori3-1细胞凋亡具有促进作用，这可能是与NaAsO₂发挥雌激素样效应，抑制ER-PI3K/AKT信号通路活化有关。ICI182780可拮抗砷雌激素样效应，负反馈调控ER-PI3K/AKT信号通路，起到一定保护作用。本研究通过对NaAsO₂发挥雌激素样效应及其对细胞增殖和凋亡调控的作用研究，可为防治甲状腺的相关疾病提供科学依据。