Effect of VEGF-C production mediated by SiO2 stimulated U937 cells on tubular structure formation of human lymphatic endothelial cells
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摘要:背景
课题组前期动物实验研究表明，二氧化硅(SiO2)诱导的矽肺大鼠早期肺组织中出现大量淋巴管生成，其对于清除肺内粉尘，缓解矽肺发病进程具有重要意义，但淋巴管生成的具体分子机制尚未明确。
目的探究SiO2介导人单核巨噬细胞株U937产生血管内皮生长因子C(VEGF-C)对人淋巴内皮细胞(HLECs)管状结构形成的影响及作用机制。
方法采用不同质量浓度(后称：浓度)(0、25、50、100、200 mg·L-1)SiO2刺激U937细胞不同时间(12、24、48 h)。Western blotting检测U937细胞中VEGF-C蛋白水平，ELISA法检测细胞培养上清液中VEGF-C蛋白水平。选择VEGF-C蛋白表达水平最高的SiO2刺激浓度和时间，收集其细胞培养上清液作为条件培养基(CM)。HLECs分为阴性对照组、CM对照组、CM处理组、VEGF-C处理组。CM处理组采用SiO2刺激后的CM处理，VEGF-C处理组采用含质量浓度5 000 ng·L-1的人VEGF-C重组蛋白培养基处理，CM对照组采用未经SiO2刺激的细胞培养上清液处理，阴性对照组为常规培养。HLECs增殖能力实验，CM处理组采用体积分数为10%、50%和100%的CM处理细胞，培养24、48、72 h；迁移能力和管状结构形成能力实验均采用100% CM处理细胞，分别培养12 h和6 h。通过MTS法检测HLECs增殖能力，划痕实验和基质胶管形成实验检测细胞迁移和管状结构形成能力。
结果与0 mg·L-1组相比，SiO2浓度为50 mg·L-1，刺激时间为24 h时，VEGF-C蛋白水平在U937细胞和细胞培养上清液中均最高[分别为(1.12±0.08)和(5 464.00±231.21)ng·L-1]。随着作用时间(24、48、72 h)的延长，CM浓度越大，HLECs的增殖能力越强，72 h时100% CM处理组的细胞增殖能力最强(2.00±0.13)，与对照组相比差异具有统计学意义(
P < 0.05)；72 h时VEGF-C处理组HLECs的增殖能力增强(1.67±0.10)，与对照组相比差异具有统计学意义(P < 0.05)。CM处理组和VEGF-C处理组中HLECs迁移面积比[(53.64±4.74)%、(56.82±5.72)%]增加，与对照组相比差异具有统计学意义(P < 0.05)。CM处理组和VEGF-C处理组中HLECs的管腔数量(7.20±1.30、8.20±1.64)和管分枝数量(32.60±5.13、38.20±8.70)增加，与对照组相比差异具有统计学意义(P < 0.05)。结论SiO2可能通过介导人单核巨噬细胞株U937产生VEGF-C，从而促进HLECs的增殖、迁移及管状结构形成。
Abstract:BackgroundOur preliminary animal experiment results show that silica (SiO2) induces significant lymphangiogenesis in rat lung tissues in early stage, which may be of great significance in removing lung dust and alleviating the pathogenesis of silicosis. However, the specific molecular mechanism of lymphangiogenesis has not been fully understood.
ObjectiveThis experiment explores the effect of SiO2 stimulated human mononuclear macrophages U937 producing vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) on the tubular structure formation of human lymphatic endothelial cells (HLECs).
MethodsU937 cells were stimulated with different concentrations of SiO2 (0, 25, 50, 100, and 200 mg·L-1) for different time (12, 24, and 48 h). Western blotting and ELISA were used to detect the VEGF-C protein level in U937 cells and in cell culture supernatant respectively. The combination of SiO2 stimulation concentration and time generating the highest VEGF-C protein expression level was selected for further experiment, and the cell culture supernatant was collected as conditioned medium (CM). HLECs were divided into four groups. The CM treatment group was treated with CM stimulated by SiO2, the VEGF-C treatment group with a medium containing 5000ng·L-1 human VEGF-C recombinant protein, the CM control group with cell culture supernatant without SiO2 stimulation, and the negative control group without any administration. The cell proliferation of HLECs was detected by MTS method after the cells were treated by 10%, 50%, and 100% CM for 24, 48, and 72 h; the cell migration and tubular structure formation were detected by scratch test and matrigel tube formation test after the cells were treated by 100% for 12 h and 6 h respectively.
ResultsThe SiO2 stimulation at 50 mg·L-1 for 24 h produced the highest VEGF-C protein level in both U937 cells and cell culture supernatant[(1.12±0.08) and (5 464.00±231.21) ng·L-1 respectively] compared with the 0 mg·L-1 group. With time extension (24, 48, and 72 h), the CM concentration was higher, and the proliferation of HLECs was enhanced. The 100% CM treatment group at 72 h had the highest cell proliferation (2.00±0.13), the VEGF-C treatment group at 72 h also showed increased proliferation (1.67±0.10), and the differences were significant compared with the control group (
P < 0.05). The migration area ratios of HLECs in the CM treatment group and the VEGF-C treatment group[(53.64±4.74)% and (56.82±5.72)% respectively] were increased compared with the control group (P < 0.05). The number of tubes (7.20±1.30, 8.20±1.64) and the number of tube branches (32.60±5.13, 38.20±8.70) of HLECs were increased in the CM treatment group and the VEGF-C treatment group compared with the control group (P < 0.001).ConclusionSiO2 may promote the proliferation, migration, and tubular structure formation of HLECs by stimulating human mononuclear macrophages U937 to produce VEGF-C.
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矽肺是一种以肺部炎症、矽结节形成和间质纤维化为主要表现，并且难以治愈的职业病，通常是由于职业性接触矽尘而引起[1]。有较多实验研究表明淋巴系统作为重要的免疫清除系统参与了矽肺的发病进程[2-3]。本课题组前期动物实验研究发现，二氧化硅(silica，SiO2)诱导的矽肺大鼠疾病早期肺部出现较多新生淋巴管，与体内硅元素的排出相关；给予丹参酮、银杏叶提取物等药物治疗后淋巴管生成进一步增加，肺内硅元素排出增多，炎症、纤维化程度得到缓解[4-5]。但淋巴管生成的具体分子机制尚未作进一步研究。
SiO2颗粒进入肺部的早期阶段，被肺巨噬细胞吞噬，促使其活化并释放大量炎性因子，具有活化淋巴管的功能，促进淋巴管生成增加[6]。血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGF-C)作为炎性因子中主要的促淋巴管生成因子，可与其位于淋巴内皮细胞(lymphatic endothelial cells，LECs)上的血管内皮生长因子受体3结合，促进淋巴管生成[7]。因此，推测矽肺早期的淋巴管生成与SiO2诱导肺巨噬细胞活化产生VEGF-C作用于LECs密切相关。本研究通过SiO2刺激人单核巨噬细胞株U937，收集细胞培养上清液用于体外培养人淋巴内皮细胞(human lymphatic endothelial cells，HLECs)，观察细胞培养上清液中的VEGF-C及其对HLECs增殖、迁移及管状结构形成的影响，探究矽肺早期肺部淋巴管生成的分子机制。
1. 材料与方法
1.1 材料
HLECs(上海子实生物有限公司，中国)；U937细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，中国)；内皮细胞培养基(endothelial cell medium，ECM)(Science cell，美国)；1640培养基(Gibco，美国)；胎牛血清(Gibco，美国)；佛波醇酯(phorbol myristate acetate，PMA)(上海碧云天生物技术有限公司，中国)；SiO2(粒径为0.5~10µm)(Sigma，美国)；VEGF-C兔多克隆抗体(Affinity Biosciences，美国)；人VEGF-C ELISA试剂盒(无锡市东林科技发展有限责任公司，中国)；人VEGF-C重组蛋白(Sino Biological，中国)；MTS[3(-4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-5(-3-carboxymethoxyphenyl)-2(- 4-sulfophenyl)-2Htetrazolium, inner salt]细胞增殖试剂盒(Promega，美国)；Matrigel基质胶(Corning，美国)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
U937细胞株采用体积分数为90%的1640培养基和10%胎牛血清进行传代培养。HLECs采用ECM培养基进行传代培养，5到10代为工作细胞。
1.2.2 SiO2刺激U937细胞
SiO2充分研磨，高压灭菌后备用。U937细胞株经PMA诱导48 h成为贴壁的单核巨噬细胞后，采用浓度为0、25、50、100、200mg·L-1的SiO2刺激，刺激时间为12、24、48h。
1.2.3 Western blotting法检测U937细胞中VEGF-C蛋白表达
收集细胞，裂解离心后提取蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测细胞内VEGF-C蛋白表达，以β-actin作为内参。
1.2.4 ELISA法检测U937细胞培养上清液中VEGF-C蛋白表达
根据试剂盒说明书，采用ELISA法定量检测U937细胞培养上清液中VEGF-C的蛋白表达水平。
1.2.5 条件培养基(conditioned medium，CM)制备
U937细胞经PMA诱导48 h成为贴壁的单核巨噬细胞后，除去培养基，并用PBS洗涤两次，采用含SiO2的ECM作为基础培养基(0.5%胎牛血清)培养。培养相应时间后，收集细胞培养液于超速离心机(离心半径5.5 cm)3 000 r·min-1，4℃离心5 min，收集上清液作为CM，-80℃保存备用。
1.2.6 HLECs分组
HLECs采用ECM培养基传至5~10代。实验分为4组：阴性对照组，CM对照组，CM处理组，VEGF-C处理组。CM处理组采用SiO2刺激后VEGF-C表达水平最高的U937细胞培养上清液培养，VEGF-C处理组采用含质量浓度5000ng·L-1的人VEGF-C重组蛋白的ECM基础培养基培养，CM对照组采用未经SiO2刺激的培养相同时间的U937细胞培养上清液培养，阴性对照组采用ECM基础培养基培养。各组胎牛血清均为0.5%。具体培养时间见后续实验。
1.2.7 HLECs增殖能力检测
HLECs接种于96孔板，每孔细胞数量为(6~8)×103个，每孔加入100 µL ECM完全培养基。细胞贴壁后，去除培养基；CM处理组加入100µL体积分数分别为10%、50%和100%的CM，VEGF-C处理组、CM对照组、阴性对照组分别加入100 µL相应的培养基(详见1.2.6)进行处理。设置空白孔。每组各设5个复孔，在37℃、5% CO2条件下培养24、48、72 h后，向每个孔中加入10 µL MTS试剂，孵育4 h。采用酶标仪测定光密度值(D)，测定波长为490 nm。细胞增殖率=(D实验组-D空白组)/(D对照组-D空白组)×100%。
1.2.8 HLECs迁移能力检测
细胞接种于6孔板，每孔细胞数量为(4~5)×105个。待细胞融合，立即使用1 000 µL移液器吸头垂直于孔板划痕。PBS缓慢冲洗3次，洗去划下的细胞。各组加入2 mL相应的培养基(详见1.2.6)进行处理。为了排除细胞增殖的影响，培养12 h后，于倒置显微镜下针对划痕区域选取5个随机视野(4倍)，通过Image J 1.52v软件计算细胞迁移面积比，面积比增大，表明细胞迁移能力增强。细胞迁移面积比=(0 h该组细胞未覆盖面积-12 h该组细胞未覆盖面积)/0h该组细胞未覆盖面积×100%。
1.2.9 HLECs管状结构形成能力检测
Matrigel基质胶4℃过夜冷溶，96孔板每孔加入50 µL Matrigel基质胶，37℃聚合45 min。根据实验分组，通过不同培养基调整HLECs浓度并接种于96孔板，每孔细胞数量为1.5×104个。每组设3个复孔。37℃培养6h后，于显微镜下选取5个随机视野(10倍)并拍照，使用Image J 1.52v软件分析图像中生成的管腔数量和管分枝数量[8]。
1.3 统计学分析
采用SPSS 21.0统计软件进行统计分析。多组数据间的比较采用方差齐性检验和单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。检验水准α=0.05。
2. 结果
2.1 SiO2刺激U937细胞后VEGF-C蛋白表达
图 1显示，不同浓度的SiO2刺激细胞12、48 h后，两时点的最大值分别与0 mg·L-1浓度组相比，VEGF-C蛋白表达无明显增高(P分别为0.833、0.579)。当SiO2刺激24 h，细胞中VEGF-C蛋白表达水平于50 mg·L-1组达到峰值(1.12±0.08)，与0 mg·L-1浓度组相比差异具有统计学意义(P < 0.05)。ELISA结果显示，当SiO2刺激时间为24 h，浓度为50 mg·L-1时，VEGF-C在U937细胞培养上清液中的蛋白含量最高[(5 464.00±231.21)ng·L-1]，与0 mg·L-1浓度组相比差异具有统计学意义(P < 0.05)，见图 2；12 h组和48 h组的细胞培养上清液中VEGF-C蛋白含量较低，各组之间差异无统计学意义(P>0.05)。
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图 1 不同浓度SiO2刺激12、24、48 h后U937细胞中VEGF-C的蛋白表达水平变化[注]A：蛋白电泳图；B：VEGF-C蛋白表达水平变化直条图。1：SiO2刺激12 h；2：SiO2刺激24 h；3：SiO2刺激48 h。**：与0 mg·L-1浓度组相比，P < 0.05。Figure 1. Changes of VEGF-C protein expressions in U937 cells exposed to different concentrations of SiO2 for 12, 24, and 48h![]()
图 2 不同浓度SiO2刺激24 h后U937细胞培养上清液中VEGF-C的蛋白表达水平变化[注]**：与0mg·L-1浓度组相比，P < 0.05。Figure 2. Changes of VEGF-C protein expressions in U937 cell culture supernatant exposed to different concentrations of SiO2 for 24h因此选择浓度50 mg·L-1的SiO2刺激U937细胞24 h后的培养上清液作为CM，用于后续实验。
2.2 HLECs增殖能力
如表 1所示，培养48、72 h后，CM处理和VEGF-C处理可明显增强HLECs的增殖能力。随着CM体积分数的增加，细胞增殖能力增强，100% CM组的细胞增殖能力最大。因此后续实验均采用100%CM处理细胞。
表 1 不同体积分数CM处理和VEGF-C处理24、48、72 h后HLECs增殖能力的变化(n=3, x±s)Table 1. Changes of the proliferation of HLECs exposed to different volumefrac of CM and VEGF-C for 24, 48, and 72 h (n=3, x±s)组别 处理时问/h 24 48 72 阴性对照组 100.00 100.00 100.00 CM对照组 100.00 100.00 100.00 10% CM 93.33±6.66 94.67±7.64 103.00±14.53 50% CM 107.33±15.57 116.00±12.49c 136.33±9.02abc 100% CM 131.00±10.58abcd 140.33±17.62abcd 200.33±13.61abcd VEGF-C 119.67±19.86 136.33±8.96a 167.00±9.54a F 4.35 10.57 48.42 P 0.027 0.001 0.001 [注]a :与阴性对照组相比，P < 0.05; b :与CM对照组相比，P < 0.05; c :与10% CM处理组相比，P < 0.05; d:与50% CM处理组相比，P < 0.05。 2.3 HLECs迁移能力
划痕实验结果显示，处理12 h后，4个组的HLECs的细胞迁移面积比不全相同(F=213.12，P < 0.001)。与阴性对照组和CM对照组相比，CM处理组和VEGF-C处理组HLECs的细胞迁移面积比均明显增加(P < 0.05)，表明HLECs细胞的迁移能力增强。阴性对照组和CM对照组之间差异无统计学意义(P=0.27)。见图 3、表 2。
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图 3 100% CM处理和VEGF-C处理12 h后HLECs迁移能力的变化[注]A：处理0 h；B：处理12 h。1：阴性对照组；2：CM对照组；3：CM处理组；4：VEGF-C处理组。黑色箭头为12 h后细胞未覆盖面积明显减少。Figure 3. Changes of the migration of HLECs exposed to 100% CM and VEGF-C for 12h表 2 100%CM和VEGF-C处理后HLECs迁移能力和管腔数量及管分枝数量的变化水平(n=5, x±s)Table 2. Changes of the migration and the number of tubes and branches of HLECs exposed to 100% CM and VEGF-C (n=5, x±s)组别 处理12 h后细胞迁移面积比/% 处理6h后 管腔数量 管分枝数量 阴性对照组 6.84±2.98 0.60±0.55 10.20±3.27 CM对照组 9.84±2.23 1.20±0.84 8.40±2.07 CM处理组 53.64±4.74ab 7.20±1.30ab 32.60±5.13ab VEGF-C处理组 56.82±5.72ab 8.20±1.64ab 38.20±8.70ab F 213.12 57.93 39.80 P < 0.001 < 0.001 < 0.001 [注]a :与阴性对照组相比，P < 0.05; b :与CM对照组相比，P < 0.05。 2.4 HLECs管状结构形成能力
对各组管状结构生成数量统计分析发现，4个组情况不全相同(P < 0.001)；100% CM处理组和VEGF-C处理组中形成的管腔数量、管分枝数量明显高于阴性对照组和CM对照组(P < 0.05)，阴性对照组和CM对照组之间差异无统计学意义(P=0.60)。见图 4、表 2。
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图 4 100% CM处理和VEGF-C处理6 h后HLECs管状结构形成的变化[注]A：阴性对照组；B：CM对照组；C：CM处理组；D：VEGF-C处理组。黑色箭头为形成的管腔；白色箭头为形成的管分枝。Figure 4. Changes of the tubular structure formation of HLECs exposed to 100% CM and VEGF-C for 6h3. 讨论
矽肺病是一种慢性肺部炎症和进行性肺间质纤维化疾病，发病机制尚未完全阐明，目前也无有效的治疗方法[9]，因此其发病机制研究尤为重要。本课题组前期动物实验证明，矽肺大鼠病变早期肺部淋巴管生成对肺内矽尘排出起重要作用，并有效延缓了矽肺病程进展[4-5]。基于此，本实验旨在通过体外细胞实验进一步探讨矽肺病早期肺部淋巴管生成的分子机制。实验结果表明SiO2刺激肺内巨噬细胞分泌淋巴管生成关键因子VEGF-C并作用于LECs，通过促进LECs的管状结构形成，进而促进肺部淋巴管再生。
众所周知，矽肺病早期表现为肺巨噬细胞活化，吞噬SiO2粉尘颗粒，诱发肺部急性炎症反应。活化的巨噬细胞可分泌大量的炎性因子和致纤维化因子，其中的炎性因子VEGF不仅对炎症细胞具有趋化性，也是淋巴管形成的主要作用因子[10-11]。人们普遍认为VEGF-C是淋巴管生成最重要的介导因子之一，其可与位于LECs的血管内皮生长因子受体3结合，促进淋巴管生成[12-14]。VEGF-C已被证明是淋巴管正常发育所必需的，特别是那些从胚胎静脉中发芽长出的淋巴管[15]。在细菌病原体诱导的皮肤急性炎症模型中，CD11b+巨噬细胞向发炎区域和相关淋巴结浸润，通过分泌VEGF-C/D促进淋巴管生成，加速炎症介质消除[16]。Yamashita等[17]研究表明，CD68+/CCR7+肺巨噬细胞通过分泌VEGF-C可在肺泡区域形成新的淋巴管。因此本实验重点研究了SiO2介导人单核巨噬细胞株U937产生VEGF-C对HLECs管状结构形成的影响。
尽管研究认为淋巴管生成过程由几个单一步骤组成(浸润、毛细淋巴管构成、管状分支、网络形成与成熟)，但确切的机制仍未完全明了[18]。在关于淋巴管生成的众多机制研究中，普遍认为LECs的增殖、迁移与管状结构形成密切相关，它们是反映淋巴管生成的三个关键指标[19-20]。因此，本研究通过收集SiO2作用后的U937细胞培养上清液用于体外培养HLECs，观察培养上清液中的VEGF-C对HLECs增殖、迁移及管状结构形成的影响。结果表明，50 mg·L-1的SiO2刺激U937细胞24 h时细胞内合成和分泌到细胞培养上清液中的VEGF-C蛋白表达水平均达到最高峰值。本课题组前期研究也发现，针对不同细胞器进行体外诱导的矽肺模型，50 mg·L-1 SiO2，作用时间24 h，可作为诱导的最佳刺激条件。因此，将50 mg·L-1的SiO2刺激U937细胞24 h的细胞培养上清液收集处理后作为CM。通过观察不同体积分数的CM对HLECs增殖能力的影响，发现100% CM刺激HLECs的细胞增殖能力最强。因此在迁移和管形成实验中均采用100% CM。为了表征CM中的VEGF-C发挥的促淋巴管生成作用，本实验采用与CM中相同质量浓度的人VEGF-C重组蛋白单独处理HLECs。结果表明，与对照组相比，100% CM处理和VEGF-C处理均可增强HLECs的迁移和管状结构形成能力(P < 0.05)；阴性对照组和CM对照组各项指标之间差异均无统计学意义(P > 0.05)。Western botting和ELISA结果显示，未经SiO2刺激的U937细胞培养上清液也可表达一定量的VEGF-C蛋白，但对HLECs的增殖、迁移和管结构形成能力未产生影响。本研究选用两个指标即管腔数量和管分枝数量能更好地反映LECs管状结构形成能力。
已有研究表明矽肺病人淋巴结内粉尘含量明显高于肺内粉尘量，并证实了肺内淋巴系统对粉尘清除的重要作用[21]。因此对矽肺病中肺内淋巴管生成的分子机制的研究具有重要意义。本研究首次探讨了矽肺病变早期肺部淋巴管生成的分子机制，证实SiO2可能通过诱导肺巨噬细胞活化，分泌促淋巴管生成的关键因子VEGF-C并作用于LECs，通过促进LECs的增殖、迁移和管状结构形成，进而促进淋巴管生成，为进一步在分子层面通过早期调控淋巴管生成缓解矽肺病变进程奠定了实验基础。但该分子机制在体内发挥的作用需进一步探讨。
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图 1 不同浓度SiO2刺激12、24、48 h后U937细胞中VEGF-C的蛋白表达水平变化
[注]A：蛋白电泳图；B：VEGF-C蛋白表达水平变化直条图。1：SiO2刺激12 h；2：SiO2刺激24 h；3：SiO2刺激48 h。**：与0 mg·L-1浓度组相比，P < 0.05。
Figure 1. Changes of VEGF-C protein expressions in U937 cells exposed to different concentrations of SiO2 for 12, 24, and 48h
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图 2 不同浓度SiO2刺激24 h后U937细胞培养上清液中VEGF-C的蛋白表达水平变化
[注]**：与0mg·L-1浓度组相比，P < 0.05。
Figure 2. Changes of VEGF-C protein expressions in U937 cell culture supernatant exposed to different concentrations of SiO2 for 24h
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图 3 100% CM处理和VEGF-C处理12 h后HLECs迁移能力的变化
[注]A：处理0 h；B：处理12 h。1：阴性对照组；2：CM对照组；3：CM处理组；4：VEGF-C处理组。黑色箭头为12 h后细胞未覆盖面积明显减少。
Figure 3. Changes of the migration of HLECs exposed to 100% CM and VEGF-C for 12h
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图 4 100% CM处理和VEGF-C处理6 h后HLECs管状结构形成的变化
[注]A：阴性对照组；B：CM对照组；C：CM处理组；D：VEGF-C处理组。黑色箭头为形成的管腔；白色箭头为形成的管分枝。
Figure 4. Changes of the tubular structure formation of HLECs exposed to 100% CM and VEGF-C for 6h
表 1 不同体积分数CM处理和VEGF-C处理24、48、72 h后HLECs增殖能力的变化(n=3, x±s)
Table 1 Changes of the proliferation of HLECs exposed to different volumefrac of CM and VEGF-C for 24, 48, and 72 h (n=3, x±s)
组别 处理时问/h 24 48 72 阴性对照组 100.00 100.00 100.00 CM对照组 100.00 100.00 100.00 10% CM 93.33±6.66 94.67±7.64 103.00±14.53 50% CM 107.33±15.57 116.00±12.49c 136.33±9.02abc 100% CM 131.00±10.58abcd 140.33±17.62abcd 200.33±13.61abcd VEGF-C 119.67±19.86 136.33±8.96a 167.00±9.54a F 4.35 10.57 48.42 P 0.027 0.001 0.001 [注]a :与阴性对照组相比，P < 0.05; b :与CM对照组相比，P < 0.05; c :与10% CM处理组相比，P < 0.05; d:与50% CM处理组相比，P < 0.05。 
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表 2 100%CM和VEGF-C处理后HLECs迁移能力和管腔数量及管分枝数量的变化水平(n=5, x±s)
Table 2 Changes of the migration and the number of tubes and branches of HLECs exposed to 100% CM and VEGF-C (n=5, x±s)
组别 处理12 h后细胞迁移面积比/% 处理6h后 管腔数量 管分枝数量 阴性对照组 6.84±2.98 0.60±0.55 10.20±3.27 CM对照组 9.84±2.23 1.20±0.84 8.40±2.07 CM处理组 53.64±4.74ab 7.20±1.30ab 32.60±5.13ab VEGF-C处理组 56.82±5.72ab 8.20±1.64ab 38.20±8.70ab F 213.12 57.93 39.80 P < 0.001 < 0.001 < 0.001 [注]a :与阴性对照组相比，P < 0.05; b :与CM对照组相比，P < 0.05。
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期刊类型引用(1)
1. 郭莎，陈小菊，谭婷婷. LncRNA KCNQ1OT1靶向调控miR-24-3p/VEGFA轴对慢性阻塞性肺疾病大鼠血管重塑的影响及相关机制. 中国老年学杂志. 2024(18): 4585-4591 . 
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