Effects of atmospheric particulate matters and high-fat and high-glucose diet on mRNA expressions of CREB, BDNF, and ERK1/2 in cerebral cortex and hippocampus in male rats
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摘要:[背景] 大气颗粒物污染和高脂高糖饮食均与认知功能、神经退行性疾病发病相关，但研究两者的联合作用文献报道较少。
[目的] 研究大气颗粒物与高脂高糖饮食对雄性大鼠认知功能及大脑皮质和海马组织中环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）、脑源性神经营养因子（BDNF）和细胞外调节蛋白激酶（ERK）1/2基因表达的影响。
[方法] 3周龄SD雄性大鼠48只，随机分为对照组（普通饲料喂养，无大气颗粒物暴露，CC组）、高脂高糖组（高脂高糖饲料喂养，无大气颗粒物暴露，HC组）、大气颗粒物组（普通饲料喂养，暴露大气颗粒物，CP组）和高脂高糖大气颗粒物暴露组（高脂高糖饲料喂养，暴露大气颗粒物，HP组）。通过独立通气笼盒，CP和HP大鼠自然吸入含大气颗粒物的空气，CC和HC组大鼠自然吸入通过高效过滤器过滤大气颗粒物的空气（空气动力学直径>0.1 μm大气颗粒物被过滤掉）。暴露结束采用旷场实验评价大鼠的认知功能，采用RT-qPCR检测海马组织与大脑皮质组织中CREB、BDNF、ERK1和ERK2 mRNA表达。组间比较采用单因素方差分析，交互作用采用析因方差分析。
[结果] 与CC组相比，CP组大鼠跨格次数减少为（46.60±16.55）次，HP组大鼠活动总路程、跨格次数降低至（163.17±32.54）m和（43.40±8.40）次，中央区活动时间升高至（7.58±1.27）s（均P < 0.05）。HC组大鼠大脑皮质CREB、ERK2，CP组的CREB、ERK2，HP组的CREB、ERK1、ERK2和BDNF mRNA表达水平均低于CC组（P < 0.05）；HP组大脑皮质中CREB、BDNF mRNA表达水平均低于HC组（P < 0.05）；HP组大脑皮质中CREB、ERK1、BDNF mRNA表达水平均低于CP组（P < 0.05）。HC组大鼠海马组织ERK2，CP组CREB、ERK2，HP组中4种基因的mRNA表达水平均低于CC组（P < 0.05）；HP组海马组织中4种基因的mRNA水平均低于HC组（P < 0.05）；HP组海马组织中ERK1和BDNF mRNA表达水平均低于CP组（P < 0.05）。析因方差分析结果显示，大气颗粒物与高脂高糖饮食对雄性大鼠总路程、跨格次数、中央区活动时间以及大脑皮质和海马组织中CREB mRNA表达的影响不存在交互作用（均P > 0.05）。
[结论] 一定浓度的大气颗粒物以及高脂高糖饮食单独暴露可降低大脑皮质和海马组织中CREB、BDNF和ERK1及ERK2基因表达水平，尚未发现二者具有联合作用。
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关键词:
- 大气颗粒物 /
- 高脂高糖饮食 /
- 认知功能 /
- 环磷腺苷效应元件结合蛋白 /
- 脑源性神经营养因子 /
- 细胞外调节蛋白激酶1 /
- 细胞外调节蛋白激酶2
Abstract:[Background] Both atmospheric particulate matter pollution and combined high-fat and highglucose diet are related to cognitive function and neurodegenerative diseases, but there are few reports on the synergistic effect of the two factors.
[Objective] The study is conducted to investigate the effects of atmospheric particulate matters and combined high-fat and high-glucose diet on the mRNA expressions of cAMP-response element binding protein (CREB), brain derived neurotrophic factor (BDNF), extracellular regulated protein kinases 1 (ERK1), and extracellular regulated protein kinases 2 (ERK2) in cerebral cortex and hippocampus in male rats.
[Methods] A total of 48 male SD rats aged three weeks were randomly divided into four groups:control group (normal feed, no atmospheric particulate matter exposure, CC group), high-fat and high-glucose diet group (high-fat and high-glucose feed, no atmospheric particulate matter exposure, HC group), atmospheric particulate matter exposure group (normal feed, atmospheric particulate matter exposure, CP group), and atmospheric particulate matter exposure plus high-fat and high-glucose diet group (high-fat and high-glucose feed, atmospheric particulate matter exposure, HP group). In independent ventilation cages, the rats in the CP and HP groups inhaled air containing atmospheric particulate matters, while the rats in the CC and HC groups inhaled air filtered by high efficiency filters (atmospheric particulate matters with aerodynamic diameter >0.1 μm were filtered out). Rats' cognitive function was measured by open field test after the three-month exposure. The mRNA expressions of CREB, BDNF, ERK1, and ERK2 in hippocampus and cerebral cortex were detected by RT-qPCR. One-way ANOVA was used for comparison between groups, and factorial ANOVA was used for interaction effects.
[Results] The average number of grid crossings of rats in the CP group was 46.60±16.55, and the total distance and the number of grid crossings of rats in the HP group were (163.17±32.54)m and 43.40±8.40, respectively, all lower than those in the CC group; the time spent in the central grid in the HP group[(7.58±1.27) s] was higher than that in CC group (Ps < 0.05). In cerebral cortex:the mRNA expression levels of CREB and ERK2 in the HC group, CREB and ERK2 in the CP group, as well as CREB, ERK1, ERK2, and BDNF in the HP group were all lower than those in the CC group (P < 0.05); the mRNA expression levels of CREB and BDNF in the HP group were lower than those in the HC group (P < 0.05); the mRNA expression levels of CREB, ERK1, and BDNF in the HP group were lower than those in the CP group (P < 0.05). In hippocampus:the mRNA expression levels of ERK2 in the HC group, CREB and ERK2 in the CP group, as well as the four genes in the HP group were all lower than those in the CC group (P < 0.05); the mRNA expression levels of the four genes in the HP group were lower than those in the HC group (P < 0.05); the mRNA expression levels of ERK1 and BDNF in the HP group were lower than those in the CP group (P < 0.05). The results of factorial ANOVA showed that there was no interaction between atmospheric particulate matter and combined highfat and high-glucose diet on the total distance, the number of grid crossings, the time spent in the central grid, and the mRNA expression levels of CREB in cerebral cortex and hippocampus in male rats (Ps> 0.05).
[Conclusion] Particulate matters at certain levels and combined high-fat and high-glucose diet may separately reduce the mRNA expressions of CREB, BDNF, ERK1, and ERK2 in cerebral cortex and hippocampus in male rats, but the synergistic effects of the two factor have not been observed.
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大气颗粒物是目前影响我国大多数城市空气质量的首要污染物，其对人类健康的影响已成为世界关注的焦点。研究发现，大气颗粒物可通过血脑屏障、嗅神经等途径进入中枢神经系统，与阿尔茨海默病、帕金森病和认知功能损害等中枢神经系统疾病或损害有关[1-2]。交通相关的空气污染与儿童的认知功能异常之间存在剂量-反应关系，长期暴露于交通来源的颗粒物可能是阿尔兹海默病的致病因素[3]。70~81岁妇女长期暴露可吸入颗粒物（PM10）和细颗粒物（PM2.5）可造成认知功能减弱[4]。墨西哥老年人认知功能减退与高浓度PM2.5暴露有关[5]。动物实验研究表明长期高脂饮食亦可对认知功能产生不良影响，主要表现为焦虑或抑郁、学习和记忆障碍等症状[6-7]。
环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）对学习和记忆分子机制的调节尤为重要，脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）是CREB转录调控的靶点之一，BDNF与其受体酪氨酸激酶B（tyrosine kinase B，TrKB）结合会导致下游Raf-MEK-ERK（Raf激酶-ERK激酶-细胞外调节蛋白激酶）通路激活，活化的ERK1/2可以磷酸化Raf、MEK等激酶[8]，进而活化CREB等底物，启动转录和翻译，形成新的突触。
基于目前大气颗粒物污染的现状以及人们高脂高糖饮食生活习惯的普遍性，本研究采用旷场实验评价大气颗粒物对高脂高糖饮食大鼠认知能力的影响，探讨大脑皮质和海马组织中ERK1/2-CREB-BDNF信号分子基因表达在大气颗粒物和高脂高糖饮食对大鼠认知能力损害中的作用。
1. 材料与方法
1.1 试剂和仪器
高脂高糖饲料（北京华阜康生物科技股份有限公司KK鼠料，能量值为17.78 kJ/g，其中蛋白质、脂肪和碳水化合物供能占总能量的百分比分别为16.46%、45.65%和37.89%），Trizol（美国Ambion），cDNA反转录试剂盒和2×SYBRGreen扩增试剂盒（瑞士Roche），目的基因及内参基因引物均由美国Invitrogen公司合成。LC96实时荧光定量PCR仪（瑞士Roche），BRHOL-1210空气质量检测仪（中国博朗通），大小鼠独立通气笼具系统（意大利Tecniplast），旷场分析箱（上海欣软信息科技有限公司），高速低温离心机（德国Eppendorf），Versa Max型连续光谱酶标仪（美国Molecular Devices）。
1.2 实验方法
1.2.1 实验动物与分组
3周龄清洁级SD雄性大鼠48只，适应性喂养1周，按体重随机分成4组，分别为对照组（普通饮食喂养，不暴露大气颗粒物，简称为CC组）、高脂高糖暴露组（高脂高糖饮食喂养，不暴露大气颗粒物，简称为HC组）、大气颗粒物暴露组（普通饮食喂养，暴露大气颗粒物，简称为CP组）和高脂高糖大气颗粒物暴露组（高脂高糖饮食喂养，暴露大气颗粒物，简称为HP组），暴露3个月，暴露期间自由摄食和饮水，按昼夜节律采光。所有动物实验均通过华北理工大学伦理委员会审查。
1.2.2 大气颗粒物暴露环境
饲养室内安装两个排气扇，一个进气，一个排气。室内放置两套独立通气笼具（individual ventlated cages，IVC）系统。将IVC系统的进气孔安装在进气扇下方，排气孔连通到室外，将其中一套IVC中进气端的高效过滤器拆掉，使室内空气进入到大气颗粒物暴露组（CP和HP组）的各个笼盒中（为暴露舱）。经检测，暴露舱各笼盒内PM2.5和PM10浓度与室内基本一致，室内颗粒物浓度达到室外浓度的80%~90%。CP和HP组大鼠24 h全身暴露大气颗粒物。另一套IVC进气端的高效过滤器过滤大气颗粒物（空气动力学直径>0.1 μm的大气颗粒物被过滤掉），经过滤的空气进入CC和HC组大鼠笼盒（为对照舱）。经检测，对照舱笼盒内PM2.5和PM10浓度均保持在0~5 µg/m3。室内安装空调，控制室温保持在21~22℃。
使用空气质量检测仪每日早中晚3次检测对照舱和室内的颗粒物浓度，检测结束后即将检测仪放置在暴露舱内，24h随时记录PM2.5与PM10的浓度。
1.2.3 旷场实验检测认知能力的变化
暴露结束后，采用旷场实验评价大鼠认知能力的变化。行为学实验室保持安静，室内暗光，手术灯照天花板反射到实验操作区，实验人员远离旷场分析箱。实验前，大鼠在测定房间内适应时间大于10 min[9]。大鼠行为学分析系统中将旷场分析箱平均分为25个大小一样的小格，从左（左上开始）到右顺序用不同颜色编号，其中7、8、9、12、13、14、17、18和19为中央区域，13号格为正中格。每次实验时将大鼠轻放入13号格中，观察其3min内活动情况。实验结束进行视频录像分析，软件统计数据。
1.2.4 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测基因表达
采用RT-qPCR测定CREB、BDNF ERK1及ERK2的mRNA表达，以β-肌动蛋白（β-actn）作为内参基因。用10%水合氯醛麻醉大鼠，断头，冰上分离大脑皮质和海马组织，-80℃冻存备用。Trizol法提取RNA，检测总RNA的质量和浓度，要求D260/D280比值在1.8~2.0之间，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。cDNA合成按照罗氏反转录试剂盒说明书操作，2×SYBRGreen扩增试剂盒进行聚合酶链式反应，PCR反应体系为20 μL，扩增条件为95℃预变性10 min后，变性95℃，10 s；退火60℃，15 s；延伸72℃，10 s，40个循环。用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达水平。目的基因和内参基因mRNA引物序列见表 1。
表 1引物序列及相应产物
基因 引物序列 产物长度（bp） CREB 正向：5’-CTGAGGAGCTTGTACCACCG-3’ 205 反向：5’-GGGCAGCTGCTAAGGTT-3’ BDNF 正向：5’-ACAGCCAGATACTAGAGCAGGGA-3’ 74 反向：5’-TCCACTTAGCCTCCACAGGG-3’ ERK1 正向：5’-GGCCCCCTAACAAGAACAGAC-3’ 223 反向：5’CACTCAGGTCAAGGGGAGATC-3’ ERK2 正向：5’-AGGGAACCGTAGCCTCATCT-3’ 106 反向：5’-ACCTGTGGTACAGGCATTCG-3’ β-actn 正向：5’-CCGCGAGTACAACCTTCTTG-3’ 115 反向：5’-CCCATACCCACCATCACACC-3’ 1.3 统计学分析
采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析，结果以$\bar x \pm s$表示。组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。组间两两比较：若方差齐，采用LSD-t法进行比较；若方差不齐，采用Dunnet’s T3法。大气颗粒物与高脂高糖饮食是否存在交互作用采用析因方差分析判定。检验水准α=0.05。
2. 结果
2.1 大气颗粒物浓度
暴露期间暴露舱内大气颗粒物浓度如图 1所示。本实验共进行90 d，对照舱内PM2.5和PM10浓度一直保持在0~5 µg/m3，暴露舱除了第2个月由于降雪原因PM10和PM2.5浓度降低以外，颗粒物浓度都较高。其中PM2.5浓度超过75µg/m3的天数有46d，PM10浓度超过150µg/m3的天数为33d。
2.2 大鼠认知功能的变化
与CC组相比，HP组大鼠的活动总路程减少，CP组和HP组大鼠跨格次数减少，HP组大鼠在中央区停留时间增加（均P < 0.05），见表 2。大气颗粒物与高脂高糖饮食对于总路程（F=0.001，P=0.997）、跨格次数（F=4.094，P=0.050）、中央区活动时间（F=0.007，P=0.935）的影响均不存在交互作用。
表 2大鼠旷场实验中总路程、跨格次数和中央区活动时间（$\bar x \pm s$，n=12）
组别（高脂高糖饮食，颗粒物） 总路程（m） 跨格次数（次） 中央区活动时间（s） CC（-，-） 210.06±43.24 59.10±13.01 3.00±3.97 HC（+，-） 193.38±49.85 49.60±15.09 4.70±4.56 CP（-，+） 180.70±56.02 46.60±16.55a 6.11±5.87 HP（+，+） 163.17±32.54a 43.40±8.40a 7.58±1.27a [注] a：与CC组相比，P < 0.05。 2.3 CREB、BDNF、ERK1和ERK2 mRNA的表达
2.3.1 大脑皮质
与CC组比较，HC组和CP组大鼠大脑皮质组织中CREB、ERK2的mRNA水平降低，HP组CREB、ERK1、ERK2和BDNF的mRNA水平降低（P < 0.05）；与HC组比较，HP组大鼠大脑皮质组织中CREB、BDNF的mRNA水平降低（P < 0.05）；与CP组比较，HP组CREB、ERK1、BDNF的mRNA水平降低（P < 0.05），见表 3。大气颗粒物与高脂高糖饮食对于大脑皮质中CREB（F=22.277，P=0.454）、ERK1（F=4.013，P=0.058）、ERK2（F=0.030，P=0.864）以及BDNF（F=66.713，P=0.524）的影响均不存在交互作用。
表 3大鼠大脑皮质、海马组织CREB、ERK1、ERK2和BDNF的mRNA水平（$\bar x \pm s$，n=12）
组别（高脂高糖饮食，颗粒物） 大脑皮质 海马组织 CREB ERK1 ERK2 BDNF CREB ERK1 ERK2 BDNF CC（-，-） 1.17±0.08 1.00±0.19 1.26±0.39 1.02±0.09 0.99±0.10 1.05±0.26 1.02±0.09 1.02±0.08 HC（+，-） 1.06±0.16a 0.94±0.14 1.01±0.27a 1.02±0.12 0.95±0.11 1.03±0.32 0.96±0.06a 1.03±0.11 CP（-，+） 0.79±0.11ab 0.97±0.13 1.02±0.28a 0.99±0.07 0.89±0.12a 1.04±0.25 0.91±0.05ab 0.98±0.09 HP（+，+） 0.68±0.07abc 0.86±0.14ac 0.91±0.25a 0.92±0.10abc 0.87±0.04ab 0.80±0.27abc 0.88±0.04ab 0.92±0.09abc [注] a：与CC组相比，P < 0.05；b：与HC组相比，P < 0.05；c：与CP组相比，P < 0.05。 2.3.2 海马组织
与CC组比较，HC组大鼠大脑海马组织中ERK2的mRNA水平降低，CP组CREB、ERK2的mRNA水平降低，HP组CREB、ERK1、ERK2和BDNF的mRNA水平降低（均P < 0.05）；与HC组比较，HP组大鼠大脑海马组织中CREB、ERK1、ERK2和BDNF的mRNA水平降低（P < 0.05）；与CP组比较，HP组ERK1和BDNF的mRNA水平降低（P < 0.05），见表 3。大气颗粒物与高脂高糖饮食对海马组织中CREB（F=0.227，P=0.635）、ERK1（F=3.226，P=0.076）、ERK2（F=2.582，P=0.112）以及BDNF（F=3.650，P=0.059）的影响均不存在交互作用。
3. 讨论
旷场实验中跨格次数反映大鼠的兴奋性和活动度[10]，其与活动总路程成正比[11]；中央区活动时间可反映大鼠的认知能力，正常大鼠在活动时会本能地避开中央区域，沿着边缘区域活动[12]。本实验中，与CC组比较，CP组大鼠跨格次数减少，HC组跨格次数及中央区活动时间没有差异。Zhang等[13]研究发现SD大鼠长期气管滴注20 mg/kg PM2.5混悬液后，旷场实验跨格次数减少，中央区活动时间增加。张可欣[14]亦发现C57BL/6小鼠暴露12个月后，与清洁空气组（饲养于经IVC笼盒过滤的空气）比较，常规空气组（饲养于日常空气环境中）及高脂饮食组小鼠跨格次数减少。本实验中与CC组比较，HP组大鼠活动总路程和跨格次数减少，进入中央区活动时间增加，但析因分析结果显示大气颗粒物与高脂高糖饮食对活动总路程、跨格次数、进入中央区活动时间均没有交互作用，说明大气颗粒物与高脂高糖饮食同时暴露与单独暴露比较，并没有增加对大鼠认知功能的影响。
Samuels等[15]研究发现，ERK基因缺失的患者，其子女ERK基因水平下降，导致认知功能损害、发育迟缓。有研究发现，生长因子等多种信息分子可通过Ras-ERK通路激活CREB，表明CREB是Ras-ERK信号通路的重要作用靶点[16-18]。CREB激活后通过调节相关的靶基因发挥多种生物学效应，与学习记忆的形成和维持密切相关[19]。其中，BDNF是CREB调节的重要靶基因之一，对学习记忆起重要的促进作用[20]。刘颖等[21]发现大气颗粒物单独暴露以及大气颗粒物与高脂高糖饮食联合暴露的大鼠学习记忆能力降低。本实验中，单独暴露大气颗粒物的大鼠大脑皮质和海马组织中CREB、ERK2 mRNA表达水平降低；同样，单独暴露高脂高糖饮食的大鼠大脑皮质CREB、ERK2和海马组织ERK2 mRNA表达水平也明显降低。田亚涛[22]发现高脂高糖饲料下调小鼠大脑皮质中BDNF mRNA的表达，但本实验中未发现单独暴露高脂高糖饮食的大鼠BDNF mRNA的表达有差异。析因分析结果显示大气颗粒物和高脂高糖饮食联合暴露对大脑皮质及海马组织中CREB、ERK1、ERK2、BDNF mRNA水平的影响没有交互作用，因此，尚不能认为大气颗粒物和高脂高糖饮食联合暴露比单独暴露更容易对大鼠大脑皮质和海马组织中CREB、BDNF、ERK1和ERK2的水平产生影响。本研究大鼠自然吸入室外环境中的大气颗粒物，暴露方法和暴露过程与人群相似，较好地模拟了人群大气颗粒物暴露途径，从一定程度上为评估大气颗粒物对人类神经系统危害提供了实验依据。本研究结果没有发现大气颗粒物与高脂高糖饮食联合作用会加重对雄性大鼠认知功能和大脑皮质、海马组织中CREB、BDNF、ERK1和ERK2基因表达的影响。
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表 1
引物序列及相应产物
基因 引物序列 产物长度（bp） CREB 正向：5’-CTGAGGAGCTTGTACCACCG-3’ 205 反向：5’-GGGCAGCTGCTAAGGTT-3’ BDNF 正向：5’-ACAGCCAGATACTAGAGCAGGGA-3’ 74 反向：5’-TCCACTTAGCCTCCACAGGG-3’ ERK1 正向：5’-GGCCCCCTAACAAGAACAGAC-3’ 223 反向：5’CACTCAGGTCAAGGGGAGATC-3’ ERK2 正向：5’-AGGGAACCGTAGCCTCATCT-3’ 106 反向：5’-ACCTGTGGTACAGGCATTCG-3’ β-actn 正向：5’-CCGCGAGTACAACCTTCTTG-3’ 115 反向：5’-CCCATACCCACCATCACACC-3’ 
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表 2
大鼠旷场实验中总路程、跨格次数和中央区活动时间（$\bar x \pm s$，n=12）
组别（高脂高糖饮食，颗粒物） 总路程（m） 跨格次数（次） 中央区活动时间（s） CC（-，-） 210.06±43.24 59.10±13.01 3.00±3.97 HC（+，-） 193.38±49.85 49.60±15.09 4.70±4.56 CP（-，+） 180.70±56.02 46.60±16.55a 6.11±5.87 HP（+，+） 163.17±32.54a 43.40±8.40a 7.58±1.27a [注] a：与CC组相比，P < 0.05。
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表 3
大鼠大脑皮质、海马组织CREB、ERK1、ERK2和BDNF的mRNA水平（
$\bar x \pm s$ ，n=12）组别（高脂高糖饮食，颗粒物） 大脑皮质 海马组织 CREB ERK1 ERK2 BDNF CREB ERK1 ERK2 BDNF CC（-，-） 1.17±0.08 1.00±0.19 1.26±0.39 1.02±0.09 0.99±0.10 1.05±0.26 1.02±0.09 1.02±0.08 HC（+，-） 1.06±0.16a 0.94±0.14 1.01±0.27a 1.02±0.12 0.95±0.11 1.03±0.32 0.96±0.06a 1.03±0.11 CP（-，+） 0.79±0.11ab 0.97±0.13 1.02±0.28a 0.99±0.07 0.89±0.12a 1.04±0.25 0.91±0.05ab 0.98±0.09 HP（+，+） 0.68±0.07abc 0.86±0.14ac 0.91±0.25a 0.92±0.10abc 0.87±0.04ab 0.80±0.27abc 0.88±0.04ab 0.92±0.09abc [注] a：与CC组相比，P < 0.05；b：与HC组相比，P < 0.05；c：与CP组相比，P < 0.05。
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