Regulation of JNK/AP-1 signaling pathway in paraquat-induced mesenchymal transition of epithelial cells
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摘要:[目的] 探讨c-jun氨基末端激酶（JNK）/转录因子激活蛋白-1（AP-1）信号通路在百草枯致大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞间发生上皮-间充质转变（EMT）中的作用。
[方法] 体外培养大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞RLE-6TN，终浓度0、25、50、100、200、300、400μmol/L百草枯处理细胞24 h，终浓度200 μmol/L百草枯分别处理细胞0、12、24、36、48、60、72 h，倒置相差显微镜观察细胞形态学的改变；四甲基偶氮唑盐（MTT）检测细胞相对存活率，确定剂量和时间-效应关系；流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡；细胞划痕实验检测细胞迁移能力；Transwell小室法检测细胞侵袭能力；免疫荧光、免疫印迹法（Westernblot）分别检测上皮标志蛋白E-cad、ZO-1和间质标志蛋白FSP-1、α-SMA表达水平；Westernblot检测JNK/p-JNK、c-jun/p-c-jun、c-fos/p-c-fos蛋白表达水平；双荧光素酶报告基因实验检测AP-1的转录活性，评估百草枯对JNK信号通路的激活作用。
[结果] 200 μmol/L百草枯诱导细胞由卵圆形或多边形的上皮细胞变成长梭形的间质细胞，细胞间连接消失，且时间越长形态学改变越明显。与对照组相比，100、200、300、400 μmol/L百草枯染毒组的细胞存活率明显降低（P<0.05），200 μmol/L百草枯诱导细胞不同时间（24、36、48、60、72 h）的细胞存活率明显降低（P<0.05）。200 μmol/L百草枯诱导细胞不同时间（12、24、36h）：细胞凋亡率随诱导时间的延长而增加，尤其36h诱导组的细胞凋亡率较对照组明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；细胞迁移指数、侵袭细胞数均明显升高（P<0.05）；上皮细胞标记蛋白E-cad、ZO-1表达下调，且下调的趋势随时间延长更加明显（P<0.05）；间质细胞标记蛋白FSP-1、α-SMA表达随时间的延长逐渐升高（P<0.05）；与对照组相比，100、200、300 μmol/L百草枯染毒可诱导p-JNK、p-c-jun、p-c-fos蛋白表达明显上调；200、300 μmol/L百草枯染毒组较对照组比较，AP-1转录活性明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。
[结论] 百草枯呈剂量和时间依赖方式影响上皮细胞活性。百草枯能够诱导大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞发生EMT，JNK/AP-1信号通路可能参与了百草枯诱导肺泡上皮细胞EMT的发生。
Abstract:[Objective] To explore the role of c-jun N-terminal kinase (JNK)/activated protein-1 (AP-1) signaling pathway in paraquat (PQ)-induced epithelial-mesenchymal transition (EMT) of rat type Ⅱ alveolar epithelial cells.
[Methods] RLE-6TN cells were incubated with designed concentrations of PQ (0, 25, 50, 100, 200, 300, and 400 μmol/L) for 24 h or 200 μmol/L PQ for 0, 12, 24, 36, 48, 60, and 72 h. Cell morphology alteration was observed under phase-contrast microscopy. Cell viability was determined by MTT assay to evaluate dose/time-effect relationship. Cell apoptosis was detected by Annexin V-FITC/PI. The migration and invasion abilities of cells were detected by wound healing and Transwell assays. The protein expressions of epithelial phenotype markers (E-cad and ZO-1) and mesenchymal phenotype markers (FSP-1 and α-SMA) were determined by immunofluorescence and Western blot respectively. The protein expressions of JNK/p-JNK, c-jun/p-c-jun, c-fos/p-c-fos were detected by Western blot. The activity of AP-1 was measured by luciferase reporter assay to evaluate the activation of JNK signaling pathway by PQ.
[Results] An elongated shape and a lack of tight cell-cell adhesions of mesenchymal cells were induced by 200 μmol/L PQ treatment in a time-dependent manner. The cell viability decreased in the cells treated with PQ at 100, 200, 300, and 400 μmol/L (P<0.05) or with 200 μmol/L PQ for 24, 36, 48, 60, and 72 h (P<0.05). After 200 μmol/L PQ treatment for 12, 24, and 36 h, the percentage of apoptosis cells increased with more exposure time, especially in the 36h treatment group as compared with the control group (P<0.05); cell migration index and invasive cells increased; the protein expressions of epithelial phenotype markers (E-cad and ZO-1) significantly decreased while those of mesenchymal phenotype markers (α-SMA and FSP-1) dramatically increased in a time-dependent manner after PQ exposure (P<0.05). Compared with the control group, after exposure to PQ (100, 200, and 300 μmol/L) for 24 h, the protein expressions of p-JNK, p-c-jun, and p-c-fos significantly increased (P<0.05). The PQ treatment at 200 and 300 μmol/L induced a significant increase of AP-1 activity (P<0.05).
[Conclusion] PQ affects cell viability of epithelial cells in a dose-and time-dependent manner. PQ can induce EMT in rat alveolar epithelial cells, in which JNK/AP-1 signaling pathway is involved.
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百草枯(paraquat, PQ), 化学名为1-1-二甲基-4-4-联吡啶阳离子盐, 是全球使用最广泛的除草剂之一[1]。肺脏是PQ急性中毒的主要靶器官, 最具特征的毒性作用是迅速发展的弥漫性肺纤维化, 病死率高达50%~90%[2-3]。但是, 关于PQ中毒致肺纤维化的起源、形成机制仍不清楚。
有研究认为参与组织修复过程的上皮细胞和成纤维细胞与纤维化发生有着直接关系[4]。在组织修复过程中的成纤维细胞有三个来源:自身的成纤维细胞、骨髓间充质干细胞和上皮细胞通过上皮间质转化而来[4]。上皮-间充质转变(epthelial-mesenchymal transiton, EMT)是指上皮细胞转化为具有间质表型细胞的生物学过程, 尤其肺泡Ⅱ型上皮细胞被认为是肺泡上皮的干细胞, 在细胞更新及损伤修复过程中, 它既可以分化为Ⅰ型肺泡上皮细胞, 也可以通过有丝分裂产生子代Ⅱ型肺泡上皮细胞以维持自身的细胞群, 更可以通过EMT转化为间质细胞[5]。E-cad、ZO-1对于维持肺上皮细胞、基底膜的结构完整性和极性起重要作用, 当两者表达被抑制时, 基底膜断裂, 细胞间紧密连接消失[6], 同时, 细胞能够表达成纤维细胞特异标志蛋白FSP-1和肌成纤维细胞特异性标志物α-SMA[7]。EMT过程受多种信号通路的共同调控[8]。其中, c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase, JNK)信号通路作为丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-actvated protein kinase, MAPK)信号通路家族之一, 在细胞的迁移、转化、增殖中起到重要作用[9]。转录因子激活蛋白-1(actvated protein-1, AP-1)作为JNK信号通路的下游转录因子, 活化后可与含有佛波酯应答元件的基因结合, 调控EMT相关基因的转录和表达[10-11]。
本研究通过体外PQ染毒肺泡Ⅱ型上皮细胞, 观察PQ能否诱导肺泡上皮细胞发生EMT及JNK/AP-1信号通路关键分子表达的改变, 探讨PQ诱导EMT过程中可能的分子调控机制, 为PQ中毒致肺纤维化的治疗提供新思路。
1. 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
PQ (纯度≥ 98.0%)、二甲基亚砜(DMSO, 分析纯)购自美国Sigma公司; RLE-6TN大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞株购自美国ATCC公司; 胰蛋白酶、RPMI-1640培养基、青链霉素购自北京索莱宝科技有限公司; 0.3% triton-x购自北京雷根生物技术有限公司; DAPI购自北京中杉金桥生物科技有限公司; opt-MEM购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司; 胎牛血清(FBS)购自美国BI公司; 24孔Transwell小室购自美国Corning公司; 四甲基偶氮唑盐(MTT)、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、全蛋白提取试剂盒购自江苏凯基生物有限公司; 小鼠抗E-cad单克隆抗体、兔抗FSP-1单克隆抗体、羊抗ZO-1多克隆抗体、Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG (H+L)购自美国Cell Signaling Technology公司; 兔抗α-SMA单克隆抗体、兔抗p-JNK/JNK抗体、兔抗p-c-jun/c-jun单克隆抗体、兔抗p-c-fos、c-fos单克隆抗体购自美国Abcam公司; DAPI封片剂、小鼠抗β-actn单克隆抗体、碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物科技有限公司; pAP1-luc (报告基因质粒)、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司。
全波长读数仪(Multskan GO)(Thermo, 美国), 倒置相差显微镜(CK40)、倒置荧光显微镜(图像采集系统IX-71)(Olympus, 日本), 蛋白垂直电泳仪、印迹转膜仪和凝胶成像系统(Gel Doc XR)(Bio-Rad, 美国), 流式细胞仪(CyFlow Cube8)(Sysmex Corporaton, 日本), 96微孔板发光检测仪(GloMax)(Promega, 美国)。
1.2 RLE-6TN细胞培养和增殖活性测定
RLE-6TN细胞置于含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的RPMI-1640培养基中, 5% CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养, 隔天更换培养液, 待细胞长至70%~80%单层后, 用0.25%胰蛋白酶消化, 1:3传代培养。
细胞以1×105个/mL接种于96孔板中, 用终浓度0、25、50、100、200、300、400 µmol/L PQ处理细胞24 h, 200 µmol/L PQ处理细胞至156 h, MTT法检测细胞增殖活性。每组设5个复孔, 染毒结束后每孔加入MTT溶液10μL, 继续孵育4h。弃上清, 每孔加入DMSO 150 μL, 震荡至结晶完全溶解。酶标仪(λ=560 nm)测量光密度(D)值, 计算细胞相对存活率。细胞相对存活率=[(D染毒-D背景)/(D对照-D背景)]×100%。
1.3 Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡
细胞以4×104个/mL接种于6孔板中, 用终浓度200 μmol/L PQ处理细胞12、24、36 h。使用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞, 制成单细胞悬液, 2 000 r/min, 离心半径8.4 cm, 离心5 min, 弃上清液。加入1 mL预冷PBS, 轻轻吹打使细胞悬浮, 1 000 r/min离心5 min, 弃上清液。加入400 μL结合缓冲液(0.1 mol/L磷酸钾缓冲液, pH=7.0)重悬细胞, 加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI, 混匀后置室温避光孵育15 min。通过流式细胞仪(Ex=488 nm, Em=530 nm)的FL1通道检测Annexin V-FITC荧光信号, FL2通道检测PI荧光信号。
1.4 划痕修复实验检测细胞迁移能力
用马克笔在6孔板背面每隔0.5~1.0cm垂直于横轴划痕做标记, 每个孔至少穿过划痕5条线。细胞以5× 104个/mL接种于6孔板中, 当细胞融合至85%~90%, 用100 μL枪头在单层细胞表面沿预先标记好的"—"字型划痕, PBS漂洗2次。200 µmol/L PQ分别处理细胞12、24、36 h, 分别在划痕后0、12、24、36 h拍照观察, 测量细胞向划痕区域迁移的距离。细胞迁移指数=(迁移前两侧细胞层距离-迁移后两侧细胞层距离)/迁移前两侧细胞层距离。
1.5 Transwell小室法测定细胞侵袭能力
细胞分为对照组和200 μmol/L PQ染毒组2组。取对数生长期的RLE-6TN细胞常规消化, 用完全培养基(含1% FBS)重悬细胞, 调整细胞密度为5×105个/mL, 加100 μL悬浮细胞于Transwell上室。用完全培养基(含5% FBS)重悬细胞, 加400μL悬浮细胞于下室, 加入PQ染毒液, 使得上室和下室的PQ终浓度均为200μmol/L。每组设3个复孔, 分别诱导12、24、36 h, 取出小室, 弃去培养基, 棉签擦去位于上室的细胞, PBS漂洗2次, 每孔加入400 μL龙胆紫溶液, 染色10 min, PBS漂洗3次, 显微镜下随机选取5个视野, 拍照并统计小室底部迁移细胞数量。
1.6 间接免疫荧光法测定E-cad和FSP-1蛋白表达
细胞以5×105个/mL密度接种于24孔板, 用终浓度200 μmol/L PQ分别处理12、24、36 h。预冷PBS漂洗3×5min。每孔加入预冷4%多聚甲醛固定10min, 预冷PBS漂洗3×5 min。每孔加入400 μL 0.3% triton-x孵育10 min, 预冷PBS漂洗3×5 min。400 μL 1% BSA封闭液, 4℃封闭1 h, 预冷PBS漂洗3×5 min。一抗E-cad (1: 100)、FSP-1(1:100), 4℃孵育过夜, 荧光二抗(1: 1 000), 4℃避光孵育1 h。预冷PBS漂洗3×5 min。取出细胞爬片, 制成切片, 在载玻片上滴加DAPI染液, 反应5min, 制成切片, 于荧光倒置显微镜下观察并拍照。
1.7 Western blot检测JNK/p-JNK、c-jun/p-c-jun、c-fos/ p-c-fos、ZO-1、α-SMA蛋白表达
细胞以5×105个/mL接种于100 mm培养皿, 用终浓度0、100、200、300 µmol/L PQ处理细胞24 h, PBS清洗2次, 刮下贴壁细胞, 800×g离心10 min, 收获细胞, PBS清洗2次, 800×g离心10 min, 加入细胞裂解液, 剧烈震荡30 s, 冰上孵育4 min, 重复5次。收集上清即为细胞总蛋白, 用BCA法测定总蛋白表达, 样品变性处理并于-80℃保存。取各组细胞蛋白(20 μg)进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳, 300 mA、90 min水浴电转移法将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用质量分数5%脱脂奶粉室温封闭1 h, 分别加入JNK (1:1 000)、p-JNK (1:1 000)、c-jun (1:1 000)、p-c-jun (1:1000)、c-fos (1:1000)、p-c-fos (1:1000)、GAPDH (1:1000)、ZO-1(1:1000)、α-SMA (1:1 000)一抗, 4℃孵育过夜, TBST液洗膜3×20 min, 分别加入相应的二抗(1:2 000)室温孵育1 h, TBST液洗膜3×10 min, ECL试剂盒显影, 全自动化学发光检测仪拍照, Image-J软件分析目的蛋白表达灰度值, 目的条带灰度值与内参条带灰度值之比作为相对表达量。
1.8 双荧光素酶报告基因检测AP-1转录活性
细胞以5×104个/mL接种96孔板, 培养24 h, 弃旧培养基, 加入新鲜培养基。配制opt-MEM培养基转染液, 按照AP-1报告基因表达质粒与内参质粒SV-40海肾荧光素酶以2:1质量比共转染细胞。转染6 h, 吸出上清液, 加入新鲜培养基继续培养24 h, 用终浓度0、100、200、300 µmol/L PQ处理细胞24 h。弃上清, 每孔加入100 μL细胞裂解液, 轻柔吹打收集细胞, 10 000×g, 离心5 min, 取离心上清液并转移到专用96孔板上。分别加入萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶检测试剂, 分别测出二者相对荧光强度。AP-1活性=报告质粒荧光素酶相对荧光强度/内参质粒海肾荧光素酶相对荧光强度。
1.9 统计学分析
计量资料以均数±标准差表示。用SPSS 15.0统计软件处理。多组均数采用单因素方差分析(One-way ANOVA), 组间两两比较采用LSD检验或Dunnet T检验, 检验水准α=0.05。
2. 结果
2.1 PQ诱导RLE-6TN细胞形态特征改变
RLE-6TN细胞生长曲线显示, 0~36 h细胞增殖缓慢, 48~108 h进入指数增长期, 108 h之后到达平台期, 细胞死亡数量逐渐增加, 144 h时细胞出现接触抑制现象。RLE-6TN细胞传代后, 1~2 h贴壁, 培养24 h后细胞呈椭圆形或铺路石样生长, 正在分裂中的细胞呈双分裂象, 48 h可见细胞相互融合, 细胞间隙减小, 细胞呈单层并铺满瓶底的70%~80%(图 1A)。200 µmol/L PQ诱导能够使Ⅱ型肺泡上皮细胞形态发生改变, 表现为由卵圆形、连接紧密的上皮细胞向纺锤状梭形、连接松散的间质细胞转变, 且时间越长形态学改变越明显(图 1B~D)。
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图 1PQ诱导后RLE-6TN细胞形态变化
[注] A: 24 h正常RLE-6TN细胞形态(×100); B: 200µmol/L PQ染毒12 h细胞形态(×200); C: 200µmol/L PQ染毒24h细胞形态(×200); D: 200µmol/L PQ染毒36h细胞形态(×200)。Figure 1.Morphologies of PQ-treated RLE-6TN cells
[Note] A: Cell morphology of normal RLE-6TN cells at 24 h (×100); B: Cell morphology of PQ-treated RLE-6TN cells at 12 h (×200); C: Cell morphology of PQ-treated RLE-6TN cells at 24 h (×200); D: Cell morphology of PQ-treated RLE-6TN cells at 36 h (×200).2.2 PQ诱导RLE-6TN细胞活性降低
MTT结果显示, 不同终浓度PQ (0、25、50、100、200、300、400 µmol/L)处理细胞24 h, 细胞相对存活率呈现随着染毒浓度的增加而下降的趋势, 与对照组比较, 50、100、200、300、400µmol/L PQ染毒组的细胞相对存活率下降, 差异有统计学意义(P < 0.05)(图 2A); 且PQ对RLE-6TN细胞的损伤具有剂量依赖性(r=-0.953)。另, 以200 µmol/L PQ处理细胞不同时间(12、24、36、48、60、72 h), 细胞相对存活率随染毒时间的增加而下降, 与对照组比较, PQ染毒24、36、48、60、72h的细胞相对存活率下降(P < 0.05)。随着染毒时间的延长, PQ对RLE-6TN细胞的毒性增强(r=-0.921)(图 2B)。鉴于EMT的发生与化学物的诱导时间密切相关[6], 结合上述MTT实验结果, 后续试验选择200 µmol/L PQ分别处理RLE-6TN细胞12、24、36h。
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图 2PQ对RLE-6TN细胞活力的影响
[注] A:不同浓度PQ诱导24 h的RLE-6TN细胞相对存活率(n =5); B: 200 µmol/L PQ诱导不同时间的RLE-6TN细胞相对存活率(n =5)。*:与对照组比较, P < 0.05。Figure 2.Cell viability of RLE-6TN cells afer PQ treatment
[Note] A: Relative cell viabilities of RLE-6TN cells induced by different concentratons of PQ for 24 h (n =5); B: Relatve cell viabilites of RLE-6TN cells induced by 200 µmol/L PQ for different tme (n =5).*: Compared with the control group, P < 0.05.2.3 PQ诱导RLE-6TN细胞凋亡率升高
终浓度200µmol/L PQ处理细胞不同时间(12、24、36 h), 根据细胞凋亡的双变量图可以看出, 200 µmol/L PQ诱导24 h后, 细胞凋亡开始明显增加, 尤其是晚期凋亡细胞(图 3A)。随着PQ诱导时间的延长, 发生凋亡的细胞百分比相应增加, 尤其是36 h诱导组细胞的凋亡比例达14.7%, 较对照组升高, 差异有统计学意义(P < 0.05)(图 3B)。
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图 3PQ对RLE-6TN细胞凋亡的影响
[注] A：流式细胞仪检测细胞凋亡双变量图；B：PQ诱导不同时间的细胞凋亡率（n =3）。*：与对照组比较，P < 0.05。Figure 3.Apoptosis of RLE-6TN cells afer PQ treatment
[Note] A: The apoptosis of RLE-6TN cells detected by flow cytometry; B: RLE-6TN cell apoptosis rate afer PQ treatment for different tme(n =3). *: Compared with the control group,P < 0.05.2.4 PQ诱导RLE-6TN细胞迁移能力增强
与对照组比较, 200μmol/L PQ诱导组的细胞迁移能力明显增强, 尤其是24h诱导组的细胞划痕明显变窄、36h诱导组的细胞划痕基本被迁移过来的细胞所覆盖, 而对照组的划痕则明显存在, 见图 4A。与对照组相比, 24、36h时细胞迁移指数明显升高(P < 0.05), 见图 4B。
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图 4PQ对RLE-6TN细胞迁移能力的影响
[注] A：划痕实验（×200）；B：细胞迁移指数线图（n =3）。*：与对照组比较，P < 0.05。Figure 4.Migraton of RLE-6TN cells afer PQ treatment
[Note] A: Wound healing assay; B: The line chart of cell migraton index(n =3). *: Compared with the control group,P < 0.05.2.5 PQ诱导RLE-6TN细胞侵袭能力增强
Transwell侵袭实验结果显示:与同时段的对照组比较, PQ诱导后穿过Transwell膜的细胞数明显增多(图 5A); PQ诱导12、24、36 h后的侵袭细胞数较对照组明显增多(P < 0.05)(图 5B)。
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图 5PQ对RLE-6TN细胞侵袭能力的影响
[注] A: Transwell小室侵袭实验, 各处理组细胞穿Transwell膜后经结晶紫染色, 蓝紫色的为细胞(×200);B:细胞侵袭数量线图(n =3)。*:与对照组比较,P < 0.05。Figure 5.Cell invasion of RLE-6TN cells afer PQ treatment
[Note] A: In Transwell invasion assay, cells in treatment groups were stained with crystal violet afer passing through Transwell membrane (×200); B: The line chart of cell invasion number (n =3).*: Compared with the control group,P < 0.05.2.6 PQ诱导上皮/间质细胞表型蛋白表达的改变
免疫荧光结果显示, 红色荧光标示的分别为上皮细胞标志物E-cad、间质细胞标志物FSP-1, 蓝色荧光标示的为DAPI, 表示细胞核。与对照组比较, 随着200 µmol/L PQ诱导细胞时间的延长(12、24、36 h), E-cad荧光强度逐渐减弱, FSP-1荧光强度逐渐增强(图 6A)。Western blot结果显示, 与对照组比较, 随着PQ诱导剂量的升高, 上皮细胞标志物ZO-1蛋白表达逐渐降低, 间质细胞标志物α-SMA蛋白表达逐渐升高, 差异有统计学意义(P < 0.05)(图 6B、C)。
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图 6PQ对上皮/间质细胞表型蛋白表达的影响
[注] A:上皮/间质细胞标记蛋白E-cad和FSP-1免疫荧光染色结果(×200); B:上皮/间质细胞标记蛋白ZO-1和α-SMA免疫印迹结果; C:ZO-1和α-SMA的蛋白相对表达量。*:与对照组比较,P < 0.05。Figure 6.Expressions of EMT phenotype markers afer PQ treatment
[Note] A: EMT markers E-cad and FSP-1 detected by immunofluorescence (×200); B: EMT markers of ZO-1 and α-SMA detected by Western blot; C:Relatve intensity of ZO-1 and α-SMA. *: Compared with the control group,P < 0.05.2.7 PQ诱导RLE-6TN细胞JNK信号通路关键蛋白表达的变化
结果显示, 与对照组比较, PQ能够诱导p-JNK、p-c-jun、p-c-fos蛋白表达明显上调, 差异具有统计学意义(P < 0.05)(图 7)。
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图 7PQ对JNK/p-JNK、c-jun/p-c-jun、c-fos/p-c-fos蛋白表达的影响
[注]*:与对照组比较,P < 0.05。Figure 7.Protein expressions of JNK/p-JNK, c-jun/p-c-jun, and c-fos/p-c-fos afer PQ treatment
[Note]*: Compared with the control group,P < 0.05.2.8 PQ诱导AP-1转录活性升高
结果显示, 终浓度0、100、200、300 µmol/L PQ诱导RLE-6TN细胞24 h, 200、300 µmol/L PQ染毒组的AP-1活性较对照组增强, 差异有统计学意义(P < 0.05), 见图 8。
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图 8PQ对AP-1转录活性的影响(n=3)
[注]*:与对照组比较,P < 0.05。Figure 8.Transcriptonal actvity of AP-1 afer PQ treatment
[Note]*: Compared with the control group,P < 0.05.3. 讨论
PQ中毒致肺纤维化机制迄今不明, 故缺乏特异性治疗方法。肺纤维化的主要病理改变为弥漫性肺泡炎症、细胞外基质的反复破坏、修复、重建和过度沉积[12]。既往观点认为, 肺纤维化是肺部炎症刺激肺组织固有的肺间质细胞继发激活和增殖的结果[12]。而近年来的研究显示, 组织修复过程中的间充质细胞有三个来源:自身的成纤维细胞、骨髓间充质干细胞和上皮细胞通过上皮间质转化而来[13]。这就意味着, 上皮细胞并不是一类终端分化的细胞, 而是在某些病理情况下, 可以失去其原有的极性, 细胞间的紧密连接逐渐丢失, 使得细胞间的关联降低, 最终获得一定的迁移和游走能力。这一类具有迁移游走能力的细胞与间充质细胞类似, 因此将上皮的这种形态学和生理特性的改变称为EMT。通过EMT, 肺泡上皮细胞获得了间质细胞的表型, 成为成纤维细胞、肌成纤维细胞的重要来源[14]。因此, 肺泡上皮细胞可被看作是纤维化的关键参与者, 尤其是Ⅱ型肺泡上皮细胞具有干细胞特征, 可塑性极强, 体外培养的Ⅱ型肺泡上皮细胞在转化生长因子(transforming growth factor, TGF)-β1诱导下能够表达并获得所有Ⅰ型肺泡上皮细胞的表型标志, 向Ⅰ型肺泡上皮细胞转化[15]。那么, 在外来的炎症损伤等某些特定条件下, 当Ⅱ型肺泡上皮细胞发生损伤或者向Ⅰ型肺泡上皮细胞表型转化受抑制时, Ⅱ型肺泡上皮细胞是否能够转变成成纤维细胞和肌成纤维细胞?
鉴于肺泡Ⅱ型肺泡上皮细胞不能传代培养, 分离高纯度的细胞有较大困难, 本研究选择的永生化大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞RLE-6TN, 其在肺纤维化发生过程中的增殖、分化及修复损伤等方面具备Ⅱ型肺泡上皮细胞的重要特征[16]。肺泡上皮损伤是肺纤维化形成及间质细胞增殖的核心。MTT实验结果显示, 随着PQ诱导浓度升高和时间延长, 细胞存活率明显降低, 呈剂量/时间-效应关系。这说明PQ可诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖活性降低; 同时, 随着诱导时间的延长, 上皮细胞凋亡率明显升高。
PQ诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤的同时, 细胞形态也发生了改变, 由卵圆形、连接紧密的上皮细胞向纺锤状梭形、松散的间质细胞转变, 且这种改变与诱导时间密切相关。免疫荧光和Western blot结果显示, 随诱导时间的延长, 上皮细胞标志蛋白E-cad、ZO-1表达降低, 间质细胞标志蛋白α-SMA、FSP-1表达升高。由此提示, PQ能够诱导肺泡上皮细胞向间质细胞转化。这个过程中, 不仅细胞形态学和分子标志物发生了相应的改变, 继而也引发大量分泌细胞外基质、侵袭和转移等一系列生物学活性的变化。通过细胞划痕、Transwell小室实验发现, 200 μmol/L PQ处理不同时间后的细胞迁移、侵袭能力明显增强。这说明肺泡Ⅱ型上皮细胞发生EMT并最终获取成纤维细胞的形态及生理学、生物学行为的重要特征。
EMT是受信号通路网络调控的复杂过程。JNK作为MAPK信号通路的分支之一, 在细胞迁移、增殖、转化方面有重要作用[9]。c-jun氨基末端活性区Ser63和Ser73是其磷酸化位点, 当上游刺激因素通过磷酸化c-Jun的Ser63/Ser73两个位点, JNK可以使c-jun蛋白的N末端磷酸化, 进而增强c-jun的转录活性, 与此同时促进c-jun/c-fos异二聚体及c-jun同二聚体的形成[9]。AP-1作为可被JNK信号通路激活的下游转录因子, 活化后可与含有佛波酯应答元件的基因结合, 调控EMT密切相关基因的表达[10-11]。用不同浓度PQ诱导细胞24 h, 发现PQ能够诱导p-JNK、p-c-jun、p-c-fos蛋白表达明显上调, 核转录因子AP-1活性升高, 提示PQ可以激活JNK/AP-1信号通路。Alcorn等[17]在实验中证实, JNK在TGF-β1诱导的气道上皮细胞EMT及纤维化相关基因的表达中起着不可或缺的作用。Chen等[18]使用JNK的抑制剂SP-600125及发卡RNA JNK可减少A549细胞α-SMA等间质表型蛋白表达, 增加E-cad等上皮表型蛋白的表达, 从而抑制TGF-β1诱导A549细胞的EMT。
综上, PQ诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞通过EMT转变为间质细胞, 成为成纤维细胞和肌成纤维细胞的一个重要来源; JNK/AP-1信号通路的激活可能参与了PQ诱导EMT的发生。但是, 本研究没有应用JNK抑制剂或发卡RNA干扰JNK基因表达, 进一步验证JNK/AP-1信号通路在PQ诱导肺泡上皮细胞EMT的调控作用, 如何通过上述信号通路上的关键靶点进行干预, 阻止和逆转EMT的过程, 是下一步的研究内容。
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图 1
PQ诱导后RLE-6TN细胞形态变化
[注] A: 24 h正常RLE-6TN细胞形态(×100); B: 200µmol/L PQ染毒12 h细胞形态(×200); C: 200µmol/L PQ染毒24h细胞形态(×200); D: 200µmol/L PQ染毒36h细胞形态(×200)。
Figure 1.
Morphologies of PQ-treated RLE-6TN cells
[Note] A: Cell morphology of normal RLE-6TN cells at 24 h (×100); B: Cell morphology of PQ-treated RLE-6TN cells at 12 h (×200); C: Cell morphology of PQ-treated RLE-6TN cells at 24 h (×200); D: Cell morphology of PQ-treated RLE-6TN cells at 36 h (×200).
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图 2
PQ对RLE-6TN细胞活力的影响
[注] A:不同浓度PQ诱导24 h的RLE-6TN细胞相对存活率(
n =5); B: 200 µmol/L PQ诱导不同时间的RLE-6TN细胞相对存活率(n =5)。*:与对照组比较, P < 0.05。Figure 2.
Cell viability of RLE-6TN cells afer PQ treatment
[Note] A: Relative cell viabilities of RLE-6TN cells induced by different concentratons of PQ for 24 h (
n =5); B: Relatve cell viabilites of RLE-6TN cells induced by 200 µmol/L PQ for different tme (n =5).*: Compared with the control group, P < 0.05.![]()
图 3
PQ对RLE-6TN细胞凋亡的影响
[注] A：流式细胞仪检测细胞凋亡双变量图；B：PQ诱导不同时间的细胞凋亡率（
n =3）。*：与对照组比较，P < 0.05。Figure 3.
Apoptosis of RLE-6TN cells afer PQ treatment
[Note] A: The apoptosis of RLE-6TN cells detected by flow cytometry; B: RLE-6TN cell apoptosis rate afer PQ treatment for different tme(
n =3). *: Compared with the control group,P < 0.05.![]()
图 4
PQ对RLE-6TN细胞迁移能力的影响
[注] A：划痕实验（×200）；B：细胞迁移指数线图（
n =3）。*：与对照组比较，P < 0.05。Figure 4.
Migraton of RLE-6TN cells afer PQ treatment
[Note] A: Wound healing assay; B: The line chart of cell migraton index(
n =3). *: Compared with the control group,P < 0.05.![]()
图 5
PQ对RLE-6TN细胞侵袭能力的影响
[注] A: Transwell小室侵袭实验, 各处理组细胞穿Transwell膜后经结晶紫染色, 蓝紫色的为细胞(×200);B:细胞侵袭数量线图(
n =3)。*:与对照组比较,P < 0.05。Figure 5.
Cell invasion of RLE-6TN cells afer PQ treatment
[Note] A: In Transwell invasion assay, cells in treatment groups were stained with crystal violet afer passing through Transwell membrane (×200); B: The line chart of cell invasion number (
n =3).*: Compared with the control group,P < 0.05.![]()
图 6
PQ对上皮/间质细胞表型蛋白表达的影响
[注] A:上皮/间质细胞标记蛋白E-cad和FSP-1免疫荧光染色结果(×200); B:上皮/间质细胞标记蛋白ZO-1和α-SMA免疫印迹结果; C:ZO-1和α-SMA的蛋白相对表达量。*:与对照组比较,
P < 0.05。Figure 6.
Expressions of EMT phenotype markers afer PQ treatment
[Note] A: EMT markers E-cad and FSP-1 detected by immunofluorescence (×200); B: EMT markers of ZO-1 and α-SMA detected by Western blot; C:Relatve intensity of ZO-1 and α-SMA. *: Compared with the control group,
P < 0.05.![]()
图 7
PQ对JNK/p-JNK、c-jun/p-c-jun、c-fos/p-c-fos蛋白表达的影响
[注]*:与对照组比较,
P < 0.05。Figure 7.
Protein expressions of JNK/p-JNK, c-jun/p-c-jun, and c-fos/p-c-fos afer PQ treatment
[Note]*: Compared with the control group,
P < 0.05. -
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