Potential Mechanism of Co-cultured Sertolli-Germ Cells Apoptosis Induced by Fluorochloridone
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摘要:目的
观察氟咯草酮（FLC）对共培养大鼠睾丸支持-生精细胞的影响，探究可能的机制。
方法采用0.1%胶原酶和0.1%透明质酸酶两步酶消化法，分离得到原代睾丸支持细胞和生精细胞，共培养24 h后，分别用0.01、0.10、1.00 μmol/L的FLC染毒24 h。生精细胞脱落试验检测FLC对生精细胞脱落的影响；流式细胞仪检测细胞凋亡率；实时荧光定量-聚合酶链反应检测凋亡通路关键信号分子和
p38 MAPK 的mRNA表达。结果FLC染毒可引起支持-生精细胞共培养体系中生精细胞脱落增加，在0.01、0.10和1.00 μmol/L浓度组，生精细胞脱落百分比分别为（238.17±3.78）%，（265.89±9.51）%和（308.73±17.05）%。随着FLC浓度升高，早期凋亡率分别升高至（10.80±1.86）%，（13.52±0.72）%和（16.62±0.35）%；与对照组相比，差异均有统计学意义（
P < 0.05或P < 0.001）。在0.10和1.00 μmol/L浓度下，FLC染毒可明显上调凋亡线粒体通路中Bax 、Cyt -c 、Caspase -9 和Caspase -3 的mRNA表达（P < 0.05或P < 0.001），同时下调Bcl -2 的mRNA表达（P < 0.05）；1.00 μmol/L的FLC可引起FasL 与p38 MAPK 的mRNA表达升高（P < 0.05）。结论FLC染毒可影响大鼠睾丸支持-生精细胞共培养体系中凋亡通路相关信号分子的mRNA表达，p38 MAPK信号通路可能参与了FLC诱导的细胞凋亡。
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关键词:
- 氟咯草酮 /
- 雄性生殖毒性 /
- 支持-生精细胞共培养 /
- 凋亡 /
- 信号通路
Abstract:ObjectiveTo observe the effects and explore potential mechanism of fluorochloridone (FLC) on co-cultured sertolli-germ cells.
MethodsPrimary sertolli-germ cells were isolated after two-step enzyme digestion using 0.1% collagenase and 0.1% hyaluronidase from rat testes and co-cultured for 24 h. The co-cultured cells were treated with 0.01, 0.10, and 1.00 μmol/L FLC for another 24 h. Detached germ cells induced by FLC was detected by detached germ cell trial. Cell apoptosis was detected by flow cytometry. Real-time polymerase chain reaction was used to measure the mRNA expression of apoptosis related pathway key genes and
p38 MAPK .ResultsFLC exposure caused dose-dependent increases of the percentages of detached germ cells up to (238.17±3.78)%, (265.89±9.51)%, and (308.73±17.05)% in the sertolli-germ cell co-cultured systems treated with 0.01, 0.10, and 1.00 μmol/L FLC, respectively. The proportions of early apoptotic cells in above three groups were significantly raised to (10.80±1.86)%, (13.52±0.72)%, and (16.62±0.35)%, respectively, and there were statistical differences compared with the control group (
P < 0.05 orP < 0.001). Up-regulation in the expressions of mitochondrial apoptotic pathway related genes includingBax ,Cyt -c ,Caspase -9 , andCaspase -3 were observed at FLC concentrations of 0.10 and 1.00 μmol/L (P < 0.05 orP < 0.001), while the levels ofBcl -2 mRNA expression were decreased (P < 0.05). FLC also raisedFasL andp38 MAPK mRNA expression levels at the concentrations of 1.00 μmol/L (P < 0.05).ConclusionFLC exposure might affect the mRNA expressions of apoptosis related pathway key genes, and the activation of p38 MAPK signaling pathway is probably involved in FLC induced sertolli-germ cell apoptosis.
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氟咯草酮（fluorochloridone，FLC）是原美国施多福公司（Staufer Chemical Co.）20世纪70年代末开发、80年代中期投产的吡咯烷酮类除草剂，可通过干扰类胡萝卜素的生物合成[1-2]，从而选择性防治某些作物中的阔叶类杂草和禾本科杂草，而不影响作物的正常生长，因此在世界范围内得到了广泛应用。欧洲食品安全管理局（European Food Safety Authority，EFSA）在2010年的一项关于FLC的评估报告中指出，FLC可能具有雄性生殖毒性，其毒作用的靶器官为睾丸和附睾，可引起精子数量减少和精子异常；并可引起大鼠睾丸支持细胞空泡化，影响雄性生殖功能相关激素的调控，是可能的内分泌干扰物[3]。雄性SD大鼠28 d灌胃染毒研究发现，FLC染毒可诱导氧化应激，引起大鼠睾丸萎缩，精子数量减少，睾丸组织发生病理变化，包括间质水肿、曲细精管萎缩、生精上皮退行性改变等，并可引起支持细胞空泡化，生精细胞脱落与细胞核损伤[4]。
睾丸支持-生精细胞共培养体系是评价化学物睾丸毒性可靠的体外研究模型之一，有助于探讨化学物的毒作用靶细胞与潜在的毒性机制[5-7]。本研究在整体动物实验所提供线索的基础上，利用原代大鼠睾丸支持-生精细胞共培养体系，观察FLC暴露对生精细胞脱落和细胞凋亡的影响，检测凋亡通路相关基因表达的变化，探讨p38 MAPK信号通路的可能作用，为进一步研究FLC的睾丸毒性机制提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
1.1.1 试剂
杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco’s phosphate buffered saline，DPBS，美国Gibco公司），I型胶原酶、透明质酸酶、DNA酶（均美国Sigma公司），DMEM/F12培养基、胎牛血清、非必需氨基酸（100×）、表皮生长因子、质量分数为0.25%的胰蛋白酶（均美国Gibco公司），FLC（分析纯，美国Sigma公司），二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，美国Sigma公司），AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒（美国BD公司），Tripure RNA提取试剂（美国Roche公司），无RNA酶水（中国天根生化科技有限公司），第一链cDNA合成试剂盒（美国Thermo Scientific公司），引物（中国上海生工生物工程股份有限公司），SYBR® Green聚合酶链反应预混液（美国Applied Biosystems公司）。
1.1.2 仪器
水浴恒温振荡器（中国江苏太仓市实验设备厂），倒置显微镜（日本Olympus公司），Muse细胞计数仪（美国Merck Millipore公司），FACS流式细胞仪（美国BD公司），Microfuge 22R台式微量冷冻离心机（美国Beckman Coulter公司），Nanodrop 2000超微量分光光度计（美国Thermo Scientific公司），循环变温加热器（德国Eppendorf公司），实时荧光定量-聚合酶链反应（RT-PCR）仪（美国Thermo Scientific公司）。
1.2 支持-生精细胞分离、培养与染毒
1.2.1 分离、培养
清洁级健康28日龄雄性SD大鼠[由复旦大学实验动物部提供，使用许可证号：SCXK（沪）2009-0019]，颈椎脱臼处死，用体积分数为75%的乙醇浸泡消毒皮肤，取出大鼠双侧睾丸置于预冷的DPBS中，小心撕开睾丸包膜，挤出睾丸实质，转移到新的DPBS中。小心剔除血管，反复冲洗，转入另一新的DPBS中，用超细尖头镊小心撕开睾丸实质中黏附在一起的曲细精管，精细眼科剪剪碎成1 mm的小段，转移至50 mL离心管中，200×g离心2 min，弃上清。加入消化酶Ⅰ（质量分数为0.1%的胶原酶），于37℃水浴恒温振荡器中60~90 r/min，消化30 min后，等体积DMEM/F12终止消化，200×g离心2 min，弃上清。加入消化酶Ⅱ（质量分数为0.1%的透明质酸酶），于37℃水浴恒温振荡器中60~90 r/min，消化30 min后，等体积DMEM/F12终止消化，200目细胞筛过滤，200×g离心2 min，弃上清，并用5 mL DMEM/F12，小心吹打重悬细胞，洗涤2次。加入DMEM/F12完全培养液（含体积分数为2%的胎牛血清，2.5 ng/mL表皮生长因子和体积分数为2%的非必须氨基酸）重悬细胞，调整细胞密度接种于细胞培养皿或多孔板中，置于饱和湿度、35℃、5%（体积分数）CO2的恒温培养箱内培养，每24 h换液。
1.2.2 染毒
根据预实验结果，本研究选取未影响细胞活力的0.01 μmol/L作为低浓度，以及细胞活力受到抑制的0.10、1.00 μmol/L作为中、高浓度进行后续实验。FLC溶解于无菌DMSO中，配置成1000、100、10 μmol/L的染毒母液，室温保存。待细胞培养24h后，将染毒母液和DMSO按1:1000稀释于DMEM/F12完全培养液中，分别配制成FLC浓度为1.00、0.10、0.01 μmol/L的染毒培养液和体积分数为0.1%的DMSO溶剂对照培养液，替代原培养液，于饱和湿度、35℃、5%（体积分数）CO2细胞培养箱中染毒。
1.3 生精细胞脱落试验
细胞接种于6孔板后于35℃、5%（体积分数）CO2培养24 h，弃去培养液，加入染毒培养液和溶剂对照培养液处理24 h，收集各孔培养液，250×g离心10 min，弃上清，随后用1 mL DMEM/F12培养液重悬细胞。取10 μL用血球计数板于400倍光学显微镜下计数4个大方格的细胞数，取其平均值，计算脱落细胞数。每个样品重复3次，每组设3个平行孔。各浓度组生精细胞脱落百分比=（各浓度组生精细胞脱落数/对照组生精细胞脱落数）×100%。
1.4 细胞凋亡检测
细胞接种于6孔板中，35℃、5%（体积分数）CO2培养24 h，弃去培养液，加入染毒培养液和溶剂对照培养液处理24 h。用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，预冷DPBS洗涤2次，用1×结合缓冲液制成106/mL的细胞悬液，取100 μL上述细胞悬液，加入5 μL异硫氰酸荧光素（FITC）标记的膜联蛋白V（Annexin V）和10 μL碘化丙啶（PI），室温避光孵育15 min，之后各管分别加入400 μL 1×结合缓冲液。1 h内用流式细胞仪检测。
1.5 RT-PCR
采用Tripure法提取细胞总RNA，取2 μg RNA作为模板，用第一链cDNA合成试剂盒逆转录成cDNA，反应体系包含2 μg RNA、1 μL oligo（dT）18引物、4 μL反应缓冲液（5×）、1 μL Ribolock RNA酶抑制剂（20 U/μL）、2 μL 10 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸预混液和1 μL ReverAid M-MuL V逆转录酶（200 U/μL），加无RNA酶水至20 μL后，于42℃孵育60 min，70℃加热5 min终止反应。之后取2 μL逆转录产物、10 μmol/L上下游引物各0.5 μL、SYBR® Green聚合酶链反应预混液5 μL、水2 μL进行PCR反应。PCR循环参数如下：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火延伸60 s，共40个循环。反应完成后，熔解曲线鉴定扩增产物特异性，采用2-ΔΔct法分析mRNA相对表达水平。每个样品重复测定3次，将对照组mRNA水平设为1，各浓度组mRNA表达水平为与溶剂对照组的比值。引物序列如表 1所示。
表 1 RT-PCR引物序列Table 1. Primer sequences for RT-PCR基因名称
Target gene方向
Orientation引物序列（5’→3’）
Primer sequenceGADPH Forward ATGGAGAAGGCTGGGGCTCACCT Reverse AGCCCTTCCACGATGCCAAAGTTGT Fas Forward GCTGTCCTGCCTCTGGTGCTTGCT Reverse GCAGTTGTTGTCGGTTTCACGAACG FasL Forward TCCACCACCACCTCCATCACCACT Reverse CCATTCCAACCAGAGCCACCAGCAC Bcl-2 Forward CCGGGAGAAVAGGGTATGAT Reverse CAGGTATGCACCCAGAGTGA Bax Forward AGACAGGGGCCTTTTTGTTAC Reverse GAGGAACTCCAGCCACAAAGAT Cyt-c Forward GGCAAGCATAAGACTGGACCAA Reverse TTTCCAAATACTCCATCAGGGTATC Caspase-9 Forward TGAGCCAGATGCTGTCCCTGTGGAG Reverse CCTGGGAAGGTGCAGTAGGACAC Caspase-3 Forward GAACGAACGGACCTGTGGACCT Reverse GCCTCCACTGGTATCTTCTGGCAT p38 MAPK Forward TATCCACTCGGCGGGCATCA Reverse GTGCCCACCACCTCCATGAT 1.6 统计学分析
实验数据用x±s表示。采用SPSS 17.0软件对数据进行单因素方差分析；方差齐者用LSD-t检验进行各组间的两两比较，方差不齐者则用Dunnett’t检验。检验水准α=0.05。
2. 结果
2.1 FLC染毒对共培养支持-生精细胞中生精细胞脱落的影响
染毒24 h后，随着FLC染毒浓度的升高，生精细胞脱落增加，且与对照组相比，差异均具有统计学意义（P < 0.001）。见图 1。
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图 1 FLC各浓度组生精细胞脱落百分比[注]*：与对照组比较，P < 0.001。Figure 1. Percentage of detached germ cells in each FLC concentration group[Note]*:Compared with the control group, P < 0.001.2.2 FLC染毒对共培养支持-生精细胞凋亡的影响
由表 2可见，当FLC浓度为0.01、0.10和1.00 μmol/L时，支持-生精细胞共培养体系中早期凋亡细胞百分比分别增加至（10.80±1.86）%，（13.52±0.72）%和（16.62±0.35）%；与溶剂对照组相比，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.001）。各FLC浓度组与对照组之间晚期凋亡/坏死细胞百分比的差异无统计学意义（P > 0.05）。
表 2 FLC各浓度组共培养支持-生精细胞凋亡率Table 2. Apoptosis rate of co-cultured sertoli-germ cells in each FLC concentration groupFLC浓度（μmol/L）
FLC concentration早期凋亡（%）
Early apoptosis晚期凋亡/坏死（%）
Late apoptosis/necrosis0.00 7.66±0.56 4.80±0.37 0.01 10.80±1.86* 4.01±0.07 0.10 13.52±0.72** 3.47±1.03 1.00 16.62±0.35** 4.80±0.37 [注]与对照组比较，*：P < 0.05；**：P < 0.001。[Note]Compared with the control group，*：P < 0.05；**：P < 0.001. 2.3 FLC染毒对共培养支持-生精细胞凋亡通路相关基因mRNA表达水平的影响
2.3.1 死亡受体通路
图 2可见，FLC染毒未引起共培养支持-生精细胞凋亡的死亡受体通路相关基因mRNA表达发生改变，仅高浓度组Fas L的mRNA表达升高（P < 0.05）。
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图 2 FLC各浓度组细胞凋亡死亡受体通路相关基因mRNA表达水平[注]*：与对照组比较，P < 0.05。Figure 2. mRNA expression of death receptor pathway related genes in each FLC concentration group[Note]*:Compared with the control group, P < 0.05.2.3.2 线粒体通路
与对照组相比，各FLC染毒组大鼠睾丸支持-生精共培养细胞中Bax的mRNA表达均升高（P <0.05或P< 0.001）。中、高浓度FLC染毒可引起Cyt-c、Caspase-9和Caspase-3的mRNA表达升高，同时引起Bcl-2的mRNA表达降低，与对照组相比，差异具有统计学意义（P < 0.05或P < 0.001）。见图 3。
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图 3 FLC各浓度组凋亡线粒体通路相关基因mRNA表达水平[注]与对照组比较，*：P < 0.05；**：P < 0.001。Figure 3. mRNA expression of mitochondrial apoptotic pathway related genes in each FLC concentration group[Note]Compared with the control group, *:P < 0.05;**:P < 0.001.2.4 FLC染毒对共培养支持-生精细胞p38 MAPK的mRNA表达水平的影响
图 4可见，FLC处理后，p38 MAPK的mRNA表达水平升高，高浓度FLC染毒组可上调p38 MAPK的mRNA表达水平至对照组的1.59倍（P < 0.05）。
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图 4 FLC各浓度组p38 MAPK基因mRNA表达水平[注]*：与对照组比较，P < 0.05。Figure 4. mRNA expression of p38 MAPK in each FLC concentration group[Note]*:Compared with the control group, P < 0.05.3. 讨论
完整的精子发生是一个复杂而有序的过程，精原细胞经过分化、有丝分裂产生前细线期精母细胞，继而穿过血睾屏障经过DNA复制与两次减数分裂形成精子细胞，最后完成一系列变态发育成为精子。干扰内分泌功能，影响与雄性生殖功能相关激素的合成与释放[8]；破坏血睾屏障的完整性，丧失生精所需的免疫环境[9]；改变支持-生精细胞间连接的有序拆解和重建，影响成熟精子的正常释放[10]，都会干扰正常的生精过程，造成生育力降低。本研究根据前期细胞毒性实验结果，最终选择0.01、0.10、1.00 μmol/L作为染毒浓度，希望在无明显细胞毒性的浓度范围内观察各指标的变化，为机制探索给出初步的线索和提示。研究结果显示，各浓度FLC均引起生精细胞脱落增加，一方面可能由于FLC影响了支持-生精细胞间粘着连接的完整性，造成精细胞的过度释放；另一方面则可能与FLC诱导的生精细胞凋亡有关。
细胞凋亡是由基因控制的细胞程序性死亡。生理状态下，生精细胞选择性凋亡可避免细胞过度增殖，维持其与支持细胞的平衡状态；而应激状态下凋亡过度则会造成精子生成不足[11]。细胞凋亡的发生由多种信号通路介导，主要包括死亡受体通路和线粒体通路[12]。凋亡的死亡受体通路依赖TNF与细胞膜上相应受体TNF-R的结合而触发。以Fas/Fas L信号通路为例，当支持细胞受到凋亡信号刺激分泌Fas L与位于生精细胞膜上的Fas结合，可启动生精细胞内死亡域蛋白FADD表达，继而结合Caspase-8形成死亡诱导信号复合体（death-inducing signaling complex，DISC），引起Caspase-8交联活化，激活下游caspase介导细胞凋亡[12]。Li等[13]研究发现，双酚A暴露可通过激活Fas/Fas L信号通路诱导小鼠睾丸间质细胞和生精细胞凋亡。本研究中，高浓度FLC可引起Fas L的mRNA表达升高，而不影响Fas的mRNA表达水平，可能是由于FLC染毒的细胞共培养体系内存在某种反馈机制，抑制Fas L与生精细胞膜上的Fas结合，或者干扰Fas/Fas L信号通路介导的细胞凋亡事件所致。
Bcl-2蛋白家族是被广泛认可的一组凋亡相关调节蛋白[14]，包括促凋亡分子（Bax，Bak和Bad等）和抑制凋亡分子（Bcl-2，Bcl-xL和Bcl-w等），各成员间的相互作用控制线粒体凋亡通路启动与否[12]。凋亡刺激因素可通过Bcl-2蛋白家族改变线粒体内膜通透性，继而引起线粒体Cyt-C释放至细胞质。研究表明，Cyt-C从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤[15]。本研究中，FLC染毒可降低大鼠支持-生精细胞内Bcl-2的mRNA表达，上调Bax mRNA表达，从而启动线粒体凋亡通路，并且这种促凋亡效应具有剂量依赖性。释放到胞浆的Cyt-c与凋亡相关因子1（Apaf-1）结合后，能募集Caspase-9与其结合形成凋亡小体，使Caspase-9发生同源活化，继而激活下游的Caspase-3等效应caspase，诱导细胞凋亡。在本研究中，Cyt-C、Caspase-9和Caspase-3的mRNA表达水平随FLC染毒浓度升高而升高，由此提示，FLC染毒所导致的大鼠睾丸支持-生精细胞凋亡可能与凋亡线粒体途径密切相关。
MAPK信号通路是真核生物信号传递网络中的重要途径之一，在细胞增殖、分化、存活与凋亡过程中发挥重要作用[16]。p38 MAPK是MAPK亚族之一，可被渗透压变化、紫外线、炎症因子和生长因子等多种细胞压力所激活[17]，又称为p38 MAPK应激信号通路。在过氧化氢诱导的细胞凋亡模型中，细胞内高表达的ROS可通过一系列级联反应使p38 MAPK发生磷酸化而激活，继而可能调控某些凋亡相关核转录因子的转录活性；而选择性抑制p38 MAPK又能反过来影响细胞的氧化应激水平，抑制细胞凋亡的发生[18]。有研究发现，GnRH拮抗剂处理的大鼠中，p38 MAPK可活化线粒体信号通路，使Bcl-2蛋白磷酸化，使其失去抗凋亡能力，造成Bax/Bcl-2发生偏移，促使生精细胞凋亡。本研究结果显示，高浓度FLC染毒组p38 MAPK基因表达明显增加，由此推测，p38 MAPK可能直接参与或通过线粒体通路介导细胞凋亡。
综上所述，本研究利用睾丸支持-生精细胞共培养体系为探讨FLC睾丸毒性及其可能机制提供了线索，利用该体外共培养体系，FLC致生精细胞凋亡作用首先得到确认。在进一步探讨FLC诱导细胞凋亡机制中，线粒体通路可能是其主要机制之一，FLC抑制Bcl-2基因表达，上调Bax基因表达，从而可能促使线粒体通路介导的凋亡发生。然而，FLC是否通过Cyt-c启动凋亡级联反应，引起下游caspase家族的激活，仍需通过检测线粒体与胞浆中Cyt-c的相对水平，以及胞浆中活化caspase含量加以论证。同时FLC染毒引起的p38 MAPK mRNA表达水平改变提示，p38 MAPK信号通路也可能参与了细胞凋亡的发生。本研究的各项观察终点均随FLC浓度变化显示出一定的剂量-反应关系，而各项基因的结果中，差异具有统计学意义的浓度不尽相同，各指标随浓度升高或降低的幅度也有所差异，这可能是由于各指标对于FLC引起改变的敏感性不同所致。生精细胞凋亡受多因素共同调节，例如，环境刺激可作用于支持细胞，破坏BTB结构[19]，使生精细胞遭受免疫损伤，或干扰支持细胞的激素分泌[20]和代谢供能[21]，影响正常的生精过程。因此，FLC对支持-生精细胞共培养体系的损伤机制仍有待于进一步探讨。
·作者声明本文无实际或潜在的利益冲突
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图 1 FLC各浓度组生精细胞脱落百分比
[注]*：与对照组比较，P < 0.001。
Figure 1. Percentage of detached germ cells in each FLC concentration group
[Note]*:Compared with the control group, P < 0.001.
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图 2 FLC各浓度组细胞凋亡死亡受体通路相关基因mRNA表达水平
[注]*：与对照组比较，P < 0.05。
Figure 2. mRNA expression of death receptor pathway related genes in each FLC concentration group
[Note]*:Compared with the control group, P < 0.05.
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图 3 FLC各浓度组凋亡线粒体通路相关基因mRNA表达水平
[注]与对照组比较，*：P < 0.05；**：P < 0.001。
Figure 3. mRNA expression of mitochondrial apoptotic pathway related genes in each FLC concentration group
[Note]Compared with the control group, *:P < 0.05;**:P < 0.001.
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图 4 FLC各浓度组p38 MAPK基因mRNA表达水平
[注]*：与对照组比较，P < 0.05。
Figure 4. mRNA expression of p38 MAPK in each FLC concentration group
[Note]*:Compared with the control group, P < 0.05.
表 1 RT-PCR引物序列
Table 1 Primer sequences for RT-PCR
基因名称
Target gene方向
Orientation引物序列（5’→3’）
Primer sequenceGADPH Forward ATGGAGAAGGCTGGGGCTCACCT Reverse AGCCCTTCCACGATGCCAAAGTTGT Fas Forward GCTGTCCTGCCTCTGGTGCTTGCT Reverse GCAGTTGTTGTCGGTTTCACGAACG FasL Forward TCCACCACCACCTCCATCACCACT Reverse CCATTCCAACCAGAGCCACCAGCAC Bcl-2 Forward CCGGGAGAAVAGGGTATGAT Reverse CAGGTATGCACCCAGAGTGA Bax Forward AGACAGGGGCCTTTTTGTTAC Reverse GAGGAACTCCAGCCACAAAGAT Cyt-c Forward GGCAAGCATAAGACTGGACCAA Reverse TTTCCAAATACTCCATCAGGGTATC Caspase-9 Forward TGAGCCAGATGCTGTCCCTGTGGAG Reverse CCTGGGAAGGTGCAGTAGGACAC Caspase-3 Forward GAACGAACGGACCTGTGGACCT Reverse GCCTCCACTGGTATCTTCTGGCAT p38 MAPK Forward TATCCACTCGGCGGGCATCA Reverse GTGCCCACCACCTCCATGAT 
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表 2 FLC各浓度组共培养支持-生精细胞凋亡率
Table 2 Apoptosis rate of co-cultured sertoli-germ cells in each FLC concentration group
FLC浓度（μmol/L）
FLC concentration早期凋亡（%）
Early apoptosis晚期凋亡/坏死（%）
Late apoptosis/necrosis0.00 7.66±0.56 4.80±0.37 0.01 10.80±1.86* 4.01±0.07 0.10 13.52±0.72** 3.47±1.03 1.00 16.62±0.35** 4.80±0.37 [注]与对照组比较，*：P < 0.05；**：P < 0.001。[Note]Compared with the control group，*：P < 0.05；**：P < 0.001.
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