High-intensity intermittent exercise regulates oxidative stress and improves endothelial progenitor cell function in patients with essential hypertension
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摘要:背景
内皮祖细胞功能异常所致血管内皮损伤是导致高血压及其靶器官损害的始动环节，其中氧化应激扮演着关键角色。高强度间歇运动是多种慢性病防治的有效手段，然而其对内皮祖细胞的作用与机制鲜有关注。
目的观察高强度间歇运动对原发性高血压患者内皮祖细胞功能的影响并探讨氧化应激在其间的作用机制。
方法60名原发性高血压患者随机分为对照组和运动组，对照组进行常规药物（包括利尿剂、钙离子阻断剂和β受体阻断剂）治疗，运动组在对照组基础上进行8周（3次·周−1）高强度间歇运动。分别于干预前后，利用肱动脉血流介导的血管舒张（FMD）检测血管内皮功能；取静脉血检测循环内皮祖细胞计数；体外培养内皮祖细胞，分别利用改良Boyden小室实验、Matrigel管腔形成实验检测其迁移和成管能力，超氧化物荧光阴离子探针法检测活性氧水平，脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）染色法检测细胞凋亡，免疫印迹法检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶2、NADPH氧化酶4、超氧化物歧化酶蛋白表达量。
结果本研究中对照组4例（13.3%）、运动组2例（6.7%）脱落；运动组训练计划完成率为94.9%。与干预前比较，干预后运动组血压降低；肱动脉FMD增加；循环内皮祖细胞数量升高，迁移和成管能力增强，活性氧水平和细胞凋亡率降低，NADPH氧化酶2、NADPH氧化酶4蛋白表达下调，超氧化物歧化酶蛋白表达上调，差异均具有统计学意义（
P < 0.05）。对照组上述参数与干预前比较均无统计学意义（P > 0.05）。结论高强度间歇运动调控NADPH氧化酶介导的氧化应激改善原发性高血压患者内皮祖细胞功能并恢复血管内皮功能障碍。
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关键词:
- 高强度间歇运动 /
- 氧化应激 /
- 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 /
- 原发性高血压 /
- 内皮祖细胞
Abstract:BackgroundVascular endothelial damage associated with endothelial progenitor cell dysfunction is considered as an initiating step of hypertension and target organ damage, in which oxidative stress plays a key role. High-intensity intermittent exercise is an effective prevention and treatment method of various chronic diseases; however, little attention has been paid to its effects and mechanisms on endothelial progenitor cells.
ObjectiveTo observe the effect of high-intensity intermittent exercise on the function of endothelial progenitor cells in patients with hypertension and explore the mechanism of oxidative stress.
MethodsA total of 60 patients with essential hypertension were randomly divided into a control group and an exercise group. The control group received conventional drug treatment (including diuretics, calcium blockers, and beta-blockers), and the exercise group performed high-intensity intermittent exercise for 8 weeks (3 times·week−1) in addition to the treatment plan of the control group. Before and after intervention, brachial artery flow-mediated vasodilation (FMD) was used to evaluate vascular endothelial function; venous blood was sampled to perfrom circulating endothelial progenitor cell counts; endothelial progenitor cells were cultured
in vitro , and the modified Boyden chamber assay and Matrigel lumen formation assay were used to detect their migration and tube formation ability, superoxide fluorescent anion probe method to detect reactive oxygen species levels, terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) staining method to detect cell apoptosis, Western blotting to determine protein expression of reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase 2, NADPH oxidase 4, and superoxide dismutase.ResultsFour patients (13.3%) in the control group and 2 patients (6.7%) in the exercise group dropped out; the completion rate of the exercise group's training plan was 94.9%. Compared with the before-intervention indicators, blood pressure decreased, brachial artery FMD increased, number of circulating endothelial progenitor cells increased, their migration and tube formation ability were enhanced, reactive oxygen species levels and cell apoptosis rate were reduced, NADPH oxidase 2 and NADPH oxidase 4 protein expressions were down-regulated, and superoxide dismutase protein expression was up-regulated in the after-intervention exercise group, and the differences were all statistically significant (
P < 0.05). There was no significant difference in the above indicators in the control group between before and after intervention (P > 0.05).ConclusionHigh-intensity intermittent exercise regulates oxidative stress mediated by NADPH oxidase, improves endothelial progenitor cell function, and restores vascular endothelial disorders in patients with essential hypertension.
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高血压是以体循环动脉血压增高为主要特征，可伴有心、脑、肾等器官的功能或器质性损害，是心脑血管疾病最主要的危险因素[1]。高血压早期病程中即可发生血管内皮损伤和功能异常，研究证实，高血压状态引起血管收缩并刺激血管内皮细胞，损伤血管壁，引起机体炎症反应、氧化应激等病理反应，进而造成心、脑、肾、血管等多个器官损害，因此血管内皮损伤所致内皮功能障碍是高血压及其靶器官损害的始动环节[2]。近年来再生医学研究发现了内皮细胞的前体细胞—内皮祖细胞。在生理或病理因素刺激下，内皮祖细胞从骨髓动员至外周血，参与血管内皮生成和修复，在维持血管内皮功能及损伤修复中起关键作用[3]。研究已证实，高血压患者循环内皮祖细胞数量减少，血管内皮修复能力减弱，且与心血管不良事件风险存在负相关[4]。因此，开发安全有效提高内皮祖细胞数量和功能的临床策略，促进血管内皮损伤修复、维持血管内皮结构和功能稳态对于防治高血压具有积极意义[5]。
研究发现，氧化应激是高血压发生发展的关键病理生理基础，其中由血管紧张素II活化的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）氧化酶是心血管系统自由基的主要来源[6]。过量自由基在引发血管内皮损伤同时还造成干/祖细胞恶劣的生存微环境，从而抑制内皮祖细胞动员、归巢并诱导其凋亡，进一步加剧内皮功能失调。药理实验证实，抑制氧化应激有助于提高内皮祖细胞存活并维持内皮稳态[7]。
缺乏体力活动是高血压发病的重要危险因素，而改善生活方式尤其是规律运动能够降低血压水平，纠正心血管危险因素，减轻靶器官损害，提升患者生活质量[8]。有氧运动（即中低强度持续运动）是高血压康复治疗的主要方式。此外，有氧运动还可改善多种心血管疾病患者内皮功能障碍并促进内皮祖细胞动员[9]。《中国高血压防治指南（2018年修订版）》强调生活方式干预应贯穿高血压防治全程，提倡每周进行4~7次中等强度有氧运动[10]。然而由于传统有氧运动形式单调、持续时间较长，患者往往难以长期坚持[11]。“缺乏时间”是影响运动依从性的最大障碍，因此，就运动模式和方案而言，如何花费更少的时间达到同样或更佳的效果成为康复患者追求的目标[11]。
近年来康复医学界新兴一种训练模式—高强度间歇运动，研究发现，高强度间歇运动能够诱导与传统有氧运动相似的生理适应，因此具有明显的时效性特征，在一定程度上是传统有氧运动的有效替代方式[12]。本研究旨在观察高强度间歇运动对高血压患者内皮祖细胞功能的影响并探讨NADPH氧化酶介导的氧化应激在其间的作用机制，为优化康复处方提供理论依据及干预靶点。
1. 对象与方法
1.1 研究对象
选取60例男性原发性高血压患者作为研究对象，要求规律接受过药物治疗至少12个月且至少3个月内无并发症出现，使用降压药时收缩压<140 mmHg，舒张压<90 mmHg。所有患者均签署知情同意书，本研究获得郑州航空工业管理学院伦理委员会批准（批准号ZUA-2023-04-11）。
纳入标准：（1）年龄<65岁；（2）符合《中国高血压防治指南（2018年修订版）》诊断标准[10]；（3）高血压分级为1~2级；（4）一年内无规律运动习惯；（5）无吸烟酗酒史。排除标准：（1）继发性高血压；（2）合并器质性心脏病者，包括心肌病、瓣膜病、心力衰竭等；（3）合并严重肺、肝、肾功能不全者；（4）服用影响血管紧张素系统药物者如血管紧张素II受体阻断剂（如缬沙坦、氯沙坦等）、血管紧张素转化酶抑制剂（如卡托普利、依拉普利等）；（5）存在运动禁忌者；（6）失眠患者。将受试者按照随机数字表法分为对照组和运动组，每组n=30。
1.2 心肺运动试验
采用功率车测功仪（894E，瑞典Monark）进行症状限制运动试验。先以功率车0 W蹬车3 min，在此基础上，根据受试者年龄、性别，选择功率递增速率为20~30 W·min−1，在6~10 min内达到症状限制性极限状态[13–14]。整个过程受试者佩戴便携式运动心肺诊断系统（ULTIMA，美国麦加菲）并在心电监测及专职医生陪同下进行，同时连续收集心电、血压、气体代谢等参数。当患者出现以下症状中的3个或以上即终止试验[15]：（1）受试者自觉严重疲劳而不能继续坚持运动；（2）Borg主观疲劳感觉量表评分≥17；（3）呼吸交换率>1.15；（4）心电图示ST段压低>0.2 mV或弓背抬高>0.1 mV；（5）出现严重心律失常；（6）伴随功率增加，收缩压下降≥10 mmHg；（7）收缩压≥220 mmHg和（或）舒张压≥110 mmHg。由运动心肺诊断系统收集并记录最后一级负荷时的摄氧量，即为最大摄氧量。
1.3 干预方案
对照组给予健康宣教，指导患者改变不良生活方式并常规服用降压药物，运动组在对照组基础上进行8周（3次·周−1）高强度间歇运动。参照Izadi等[16]研究制定的功率车运动方案，即先以85%~90%最大摄氧量强度对应的功率蹬车1 min后间歇2 min，间歇期以50%~55%最大摄氧量继续蹬车，共重复10个循环。运动过程中由医护人员全程监控。记录受试者失访以及运动计划完成情况，用实际完成的运动次数占康复处方计划总次数的百分比表示患者的依从性。记录运动期间以及运动后24 h内发生的不良事件（恶心呕吐、心律失常、头晕、过度疲劳等）。
1.4 血管内皮功能
参照Corretti等[17]提供的方法，利用超声诊断仪（EPIQ7C型，荷兰飞利浦）通过肱动脉血流介导的血管舒张（flow-mediated dilation, FMD）反映血管内皮功能。受试者取仰卧位，右肢外展15°掌心向上，以肘关节上3 cm肱动脉段为靶血管，测量静息时的肱动脉舒张末期内径（d0）以及加压（200 mmHg）放气后的肱动脉舒张末期内径（d1）。用反应性充血前后肱动脉内径的变化率计算FMD（%）＝(d1－d0)÷d0×100%。
1.5 外周血内皮祖细胞计数
受试者禁食8 h，于清晨空腹状态下静脉取血30 mL。外周血内皮祖细胞计数：参照Skrzypkowska等[18]的研究方法，取静脉血5 mL，加入红细胞裂解液，
12000 r·min−1离心（离心半径3.55 cm）15 min，弃上清，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline, PBS）洗涤沉淀细胞后加入异硫氰酸荧光素-CD34（fluorescein isothiocyanate-CD34, FITC-CD34）、藻红蛋白-激酶插入域受体（phycoerythrin-kinase insert domain receptor, PE-KDR）、藻蓝蛋白-CD133（allophycocyanin-CD133, APC-CD133）荧光抗体（美国Thermo Fisher Scientific），通过流式细胞仪（EPICS-XL，美国Beckman-Coulter）检测。先以FITC-CD34做门排除FITC-CD34阴性细胞，再以PE-KDR、APC-CD133做门筛选双阳性细胞，FCM软件（Expo32 ADC 4.0）分析CD34、KDR和CD133均阳性（代表外周血内皮祖细胞）的细胞数量。1.6 外周血内皮祖细胞体外培养
参照顾圣玮等[19]的研究方法，取静脉血，密度梯度离心法分离单个核细胞，调整细胞密度为5×106个·mL−1，接种于包被人纤维连接蛋白的培养皿中，在内皮细胞生长培养基-2（endothelial cell growth medium-2, EGM-2）中培养，置37 ℃、5% CO2细胞培养箱（Galaxy 170S，英国New Brunswick）孵育，每3 d更换一次培养基，直至细胞密度达80%后，胰酶消化、传代。选择第3代细胞进行实验。
1.7 内皮祖细胞功能检测
迁移能力：参照刘一炫等[20]的研究方法，采用改良Boyden小室实验检测内皮祖细胞迁移能力。取单细胞悬液，将细胞浓度调整至1×106个·mL−1，加入500 μL培养基199（Medium 199, M199）培养液。将上述混合液注入改良Boyden小室的上室，取25 μL含血管内皮生长因子（50 μg·L−1）的M199培养液注入下室，室温孵育24 h。用消毒棉签刮去滤膜上的未移动细胞，甲醇固定，Giemsa染色，倒置显微镜（DM IL LED，德国徕卡）下随机取5个视野，拍照后利用Image J 1.53图像分析软件计数每个视野下迁移细胞的平均数。
成管能力：参照Wang等[21]的研究方法，通过Matrigel管腔形成实验检测内皮祖细胞体外成管能力。取单细胞悬液，将细胞浓度调整至5×105个·100 μL−1。将融化的Matrigel胶预铺在预冷的96孔板中，置于37 ℃培养箱中30 min使其凝固。取100 μL细胞悬液均匀接种到孔板中，37 ℃孵育24 h。倒置显微镜下随机选取5个视野，拍照后采用Image J 1.53图像分析软件计算血管总长度，取平均值。
1.8 内皮祖细胞活性氧水平检测
参照Xu等[22]的研究方法，利用超氧化物荧光阴离子2,7–二氯荧光素二乙酸酯（2,7–dichlorofluorescein diacetate, DCFH–DA）探针法检测活性氧水平。将第3代细胞消化、收集并铺在EGM-2培养基的6孔板中24 h，调整细胞密度为5×106个·mL−1，取100 μL细胞悬液与等体积DCFH–DA（10 μmol·L−1）于37 ℃孵育3 h。通过倒置荧光显微镜（TCS SP8 X，德国徕卡）观察拍片，采用图像分析软件Image Pro Plus 6.0测量荧光强度。
1.9 内皮祖细胞凋亡检测
参照谭小武等[23]的研究方法，利用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase–mediated dUTP nick end labeling, TUNEL）染色法检测内皮祖细胞凋亡率。收集第3代内皮祖细胞，24孔板细胞爬片后，40 g·L−1多聚甲醛固定细胞30 min，加入含0.1% Triton X–100的PBS冰浴2 min，加入50 μL TUNEL检测液，室温孵育约1 h，4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI）染核，甘油封片。通过倒置荧光显微镜观察拍照。细胞凋亡率＝凋亡细胞数÷视野总细胞数×100%。
1.10 内皮祖细胞蛋白表达量测定
免疫印迹法检测内皮祖细胞NADPH氧化酶2（1∶
1000 ）、NADPH氧化酶4（1∶1000 ）、超氧化物歧化酶（1∶2000）蛋白表达量。收集细胞，提取总蛋白，二喹啉甲酸试剂盒进行蛋白定量。十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离，转移至聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂牛奶37 ℃封闭1 h。一抗4 ℃孵育过夜，二抗（1∶5000 ）室温孵育1 h。洗膜后电化学发光试剂显影，凝胶成像仪采集图像，Image Pro Plus 6.0图像软件分析蛋白条带光密度值，以β–tubulin为内参蛋白，计算目的蛋白的相对表达量。1.11 统计学分析
采用SPSS 20.0统计软件包进行统计处理和分析。计数资料以百分比表示，组间比较采用卡方检验；计量资料以均数±标准差表示，组间比较使用单因素方差分析；组内干预前后比较采用配对t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 基本情况
试验过程中，对照组4例（13.3%）、运动组2例（6.7%）脱落（即由于各种原因不能完成试验规定的全部流程的病例），最终样本量n=54。两组患者基线资料比较差异均无统计学意义（P>0.05），组间具有可比性。见表1。
表 1 一般资料比较Table 1. Comparison of general information变量（Variable） 对照组
(Control
group)
(n=26)运动组
(Exercise
group)
(n=28)t/χ2 P 人口统计学参数(Demographic parameter) 年龄/岁(Age/years)，$ {{\bar x}} $±s 45.0±10.1 48.1±8.1 −1.222 0.227 病程/年(Course of disease/years)，
$ {{\bar x}} $±s7.6±3.0 8.3±2.7 −0.934 0.355 高血压分级(Hypertension
classification)，I/II20/6 23/5 0.226 0.634 高血压家族史(Family history of
hypertension)，n(%)23(88.5) 26(92.9) 0.310 0.578 身体形态学参数(Body morphological parameter) 身高(Height)/m，$ {{\bar x}} $±s 1.71±0.06 1.73±0.05 −1.255 0.215 体质量(Body mass)/kg，$ {{\bar x}} $±s 74.9±11.0 79.0±8.8 −1.480 0.145 体质量指数(Body mass
index)/(kg·m−2)，$ {{\bar x}} $±s25.6±4.3 26.3±3.3 −0.696 0.489 血液动力学参数(Hemodynamic parameter) 收缩压(Systolic blood
pressure)/mmHg，$ {{\bar x}} $±s130.0±8.7 127.9±8.3 0.962 0.359 舒张压(Diastolic blood
pressure)/mmHg，$ {{\bar x}} $±s79.3±5.5 81.5±5.2 −1.537 0.130 心率(Heart rate)/(次·分−1) ，$ {{\bar x}} $±s 75.9±6.4 77.3±5.8 −0.847 0.401 服用药物种类(Type of medication) 利尿剂(Diuretic)，n(%) 24(92.3) 25(89.3) 0.147 0.702 钙离子阻断剂(Calcium blocker)，
n(%)10(38.5) 15(53.6) 1.238 0.266 β受体阻断剂(Beta-blocker)，n(%) 12(46.2) 16(57.1) 0.652 0.419 8周运动干预过程中，运动组训练计划完成率为94.9%［638/（8×3×28）]，未完成的原因包括个人事务、旅游和无故失联等。患者运动期间以及运动后仅出现肌肉酸痛、气喘、咳嗽等症状，所有不良症状均较轻微，可继续进行运动或在停止运动经休息后完全缓解，无严重不良反应事件或心血管相关事件发生。
2.2 血压和血管内皮功能比较
与干预前比较，干预后运动组收缩压和舒张压降低，肱动脉FMD增加；与对照组比较，运动组收缩压和舒张压下降，肱动脉FMD升高（P 均< 0.05）。见表2和图1。
表 2 血压水平比较Table 2. Comparison of blood pressure血压(Blood pressure) 对照组
(Control group)
(n=26)运动组
(Exercise group)
(n=28)t/Χ2 P 收缩压
(Systolic blood pressure)/mmHg干预前(Before intervention) 130.0±8.7 127.9±8.3 0.926 0.359 干预后(After intervention) 132.5±7.6 122.7±7.0ab 4.917 <0.001 t −1.149 2.404 P 0.261 0.023 舒张压
(Diastolic blood pressure)/mmHg干预前(Before intervention) 79.3±5.5 81.5±5.2 −1.537 0.130 干预后(After intervention) 81.3±5.4 77.4±4.7ab 2.781 0.008 t −1.221 3.067 P 0.233 0.005 [注]a：与干预前比较，P<0.05；b：与对照组比较，P<0.05。[Note] a: Compared with the before-intervention indicator, P < 0.05; b: Compared with the control group, P < 0.05. ![]()
图 1 血管内皮功能比较a：与干预前比较，P < 0.05；b：与对照组比较，P < 0.05。Figure 1. Comparison of vascular endothelial functiona: Compared with the before-intervention indicator, P < 0.05; b: Compared with the control group, P < 0.05.2.3 外周血内皮祖细胞计数比较
与干预前比较，干预后运动组内皮祖细胞计数升高（P < 0.05）；与对照组比较，运动组内皮祖细胞计数增加（P < 0.05）。见图2。
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图 2 外周血内皮祖细胞计数比较a：与干预前比较，P < 0.05；b：与对照组比较，P < 0.05。Figure 2. Comparison of peripheral blood endothelial progenitor cell countsa: Compared with the before-intervention indicator, P < 0.05; b: Compared with the control group, P < 0.05.2.4 内皮祖细胞功能比较
与干预前比较，干预后运动组内皮祖细胞迁移和成管能力改善（P<0.05）；与对照组比较，运动组内皮祖细胞迁移和成管能力提高（P<0.05）。见图3。
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图 3 内皮祖细胞功能比较A：内皮祖细胞迁移图（Giemsa染色，×200，标尺＝50 μm）；B：内皮祖细胞迁移功能定量分析（视野内细胞数量）；C：血管总长度比较；D：内皮祖细胞体外成管图（×100，标尺＝100 μm）；a：与干预前比较，P<0.05；b：与对照组比较，P <0.05。Figure 3. Comparison of endothelial progenitor cell functionA: Migration diagram of endothelial progenitor cells (Giemsa staining, ×200, scale bar=50 μm); B: Quantitative analysis of migration function of endothelial progenitor cells; C: Comparison of total length of blood vessels; D: Tube formation diagram of endothelial progenitor cells in vitro (×100, scale bar=100 μm); a: Compared with the before-intervention indicator, P < 0.05; b: Compared with the control group, P < 0.05.2.5 内皮祖细胞活性氧含量和细胞凋亡率比较
与干预前比较，干预后运动组内皮祖细胞活性氧含量和细胞凋亡率降低（P<0.05）；与对照组比较，运动组内皮祖细胞活性氧含量和细胞凋亡率下降（P<0.05）。见图4。
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图 4 内皮祖细胞活性氧含量和细胞凋亡率比较A：活性氧免疫荧光染色（×100，标尺＝100 μm）；B：内皮祖细胞活性氧含量比较；C：内皮祖细胞凋亡率比较；D：TUNEL免疫荧光染色（×200，标尺＝50 μm），阳性细胞呈现绿色荧光；a：与干预前比较，P<0.05；b：与对照组比较，P<0.05。Figure 4. Comparison of reactive oxygen species and apoptosis of endothelial progenitor cellsA: Reactive oxygen species immunofluorescence staining (×100, scale bar=100 μm); B: Comparison of reactive oxygen species content in endothelial progenitor cells;C: Apoptosis rate of endothelial progenitor cells; D: TUNEL immunofluorescence staining (×200, scale bar=50 μm); a: Compared with the before-intervention indicator, P < 0.05; b: Compared with the control group, P < 0.05.2.6 内皮祖细胞蛋白表达量比较
与干预前比较，干预后运动组内皮祖细胞NADPH氧化酶2、NADPH氧化酶4蛋白表达下调（P<0.05），超氧化物歧化酶表达上调（P<0.05）；与对照组比较，运动组内皮祖细胞NADPH氧化酶2、NADPH氧化酶4蛋白表达下降（P<0.05），超氧化物歧化酶表达升高（P<0.05）。见图5。
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图 5 内皮祖细胞蛋白表达量比较A：蛋白电泳图；B：NADPH氧化酶2蛋白表达量；C：NADPH氧化酶4蛋白表达量；D：超氧化物歧化酶蛋白表达量；a：与干预前比较，P<0.05；b：与对照组比较，P<0.05。Figure 5. Comparison of protein expression levels in endothelial progenitor cellsA: Protein electrophoresis; B: NADPH oxidase 2 protein expression; C: NADPH oxidase 4 protein expression; D: Superoxide dismutase protein expression; a: Compared with the before-intervention indicator, P < 0.05; b: Compared with the control group, P < 0.05.3. 讨论
高血压患者治疗的获益主要来自血压降低本身，研究证实，收缩压每降低10 mmHg、舒张压降低4 mmHg，可使脑卒中和缺血性心脏病的风险分别降低30%和23%[24]。在本研究中，运动组干预后血压分别下降5.2 mmHg（收缩压）和4.1 mmHg（舒张压），与最近的一项meta分析（收缩压下降4.7 mmHg；舒张压下降4.4 mmHg）结果一致[12]。另外一项meta分析指出，传统有氧运动可使血压分别下降4.49 mmHg和2.53 mmHg[25]。结合本研究结果，相较于有氧运动，高强度间歇运动下调舒张压的效果更为明显。由于外周阻力是影响舒张压的主要因素，因此推测高强度间歇运动可能对血管功能产生更为积极的作用，运动组肱动脉FMD显著增加也印证了这一点。
内皮祖细胞作为循环内皮细胞的前体细胞，从骨髓动员后进入血循环，特异性归巢于损伤或缺血部位，参与血管新生和再内皮化[3]。研究指出，内皮祖细胞可间接反映血管内皮功能，同时也是心血管疾病患者相关靶器官损害以及预后的独立危险因素[26]。因此，提高内皮祖细胞数量有利于高血压防治[5]。高血压发病初期，内皮功能障碍在一定程度上刺激内皮祖细胞动员，然而伴随高血压进展，骨髓干细胞活性被抑制，从而限制内皮祖细胞释放入血[6]。最终，内皮祖细胞储备量枯竭，数量明显下降，进一步加剧内皮功能失调，导致靶器官损害并增加心血管不良事件的发生风险[5]。作为高血压康复治疗的重要手段，有氧运动能够改善高血压患者内皮祖细胞数量和功能[9]。本研究利用高强度间歇运动方式同样证实，干预后运动组内皮祖细胞计数明显升高，同时体外迁移和成管功能增强，提示不同运动方式对内皮祖细胞动员和功能的促进作用效果类似，然而其机制尚未明确。
氧化应激是高血压的病理生理基础，同时也是诱导内皮祖细胞和血管内皮功能障碍的关键因素[6]。正常状况下，适量自由基通过对内皮祖细胞中多种信号途径的调节维持其生理功能，但自由基的过度产生则对内皮祖细胞动员和生存、血管内皮功能以及血管修复产生负面影响[6]。研究发现，用过氧化氢处理内皮祖细胞后细胞凋亡明显增加。NADPH氧化酶是心血管系统自由基的主要来源[27]。高血压时血管收缩促进肾素分泌，诱导血管紧张素II合成增加，进而通过磷酸化修饰活化NADPH氧化酶胞浆亚基p47phox，后者与p67phox结合并向胞膜转位，与胞膜亚基结合组成具有氧化活性的复合体，最终催化底物NADPH/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide, NADH）产生超氧阴离子[28]。在本研究中，干预后，运动组内皮祖细胞活性氧和凋亡水平以及NADPH氧化酶2和4蛋白表达量下降，提示高强度间歇运动通过抑制NADPH氧化酶活性减少自由基产生并抑制细胞凋亡，内皮祖细胞数量增多、功能增强。这在使用血管紧张素受体阻断剂类降压药氯沙坦以及NADPH氧化酶抑制剂的研究中同样得到证实[7，29]。研究发现，高血压大鼠NADPH氧化酶来源的活性氧可诱导内皮祖细胞衰老、凋亡甚至坏死，使用NADPH氧化酶抑制剂Apocynin能够下调Bax/Bcl–2值，降低内皮祖细胞凋亡率[29]。然而，NADPH氧化酶基因敲除实验则显示，活性氧显著下降同时外周血中内皮祖细胞数量减少、内皮修复能力减退，提示活性氧过低同样影响内皮祖细胞动员和功能[30–31]。此外，干预后运动组内皮祖细胞超氧化物歧化酶（清除超氧阴离子的特异酶）表达上调，说明运动能够调控内皮祖细胞氧化－抗氧化系统稳态平衡并将自由基维持在生理水平，从而维持内皮祖细胞数量和功能。
值得注意的是，目前《中国高血压防治指南（2018年修订版）》以及美国运动医学学会关于发展或维持心血管健康的运动处方指南建议高血压患者每周至少进行150~300 min中等强度运动[8，10]。本研究中运动组训练时间（90 min·周−1）明显低于美国运动医学学会推荐的最低剂量，但仍能诱导产生心血管系统的有益适应。此外，运动组较低的总体失访率（2名患者，6.7%）、较高的运动计划完成率（94.9%），加之运动过程中未发生运动相关的心血管事件，因此本研究制定的训练方案对于原发性高血压患者是可行的，具有较高的安全性、有效性、依从性和可持续性。然而，高强度间歇运动是否能够成为传统有氧运动的替代模式，尚需多中心、大样本随机对照临床试验证实，以形成基于证据等级和推荐强度的循证运动指南。
高强度间歇运动调控NADPH氧化酶介导的氧化应激促进原发性高血压患者内皮祖细胞动员并提升其功能，进而恢复血管内皮紊乱、降低血压水平。本研究提示，氧化应激是高强度间歇运动发挥内皮祖细胞和血管内皮功能保护效应的重要靶点，因此，运动训练作为高血压二级预防的重要手段，患者应长期坚持。今后的研究应进一步研究不同运动方式（有氧运动、高强度间歇运动、抗阻运动、静力性运动等）联合抗氧化剂对内皮祖细胞的作用及机制，以形成针对高血压患者的最佳康复治疗策略。
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图 1 血管内皮功能比较
a：与干预前比较，P < 0.05；b：与对照组比较，P < 0.05。
Figure 1. Comparison of vascular endothelial function
a: Compared with the before-intervention indicator, P < 0.05; b: Compared with the control group, P < 0.05.
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图 2 外周血内皮祖细胞计数比较
a：与干预前比较，P < 0.05；b：与对照组比较，P < 0.05。
Figure 2. Comparison of peripheral blood endothelial progenitor cell counts
a: Compared with the before-intervention indicator, P < 0.05; b: Compared with the control group, P < 0.05.
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图 3 内皮祖细胞功能比较
A：内皮祖细胞迁移图（Giemsa染色，×200，标尺＝50 μm）；B：内皮祖细胞迁移功能定量分析（视野内细胞数量）；C：血管总长度比较；D：内皮祖细胞体外成管图（×100，标尺＝100 μm）；a：与干预前比较，P<0.05；b：与对照组比较，P <0.05。
Figure 3. Comparison of endothelial progenitor cell function
A: Migration diagram of endothelial progenitor cells (Giemsa staining, ×200, scale bar=50 μm); B: Quantitative analysis of migration function of endothelial progenitor cells; C: Comparison of total length of blood vessels; D: Tube formation diagram of endothelial progenitor cells in vitro (×100, scale bar=100 μm); a: Compared with the before-intervention indicator, P < 0.05; b: Compared with the control group, P < 0.05.
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图 4 内皮祖细胞活性氧含量和细胞凋亡率比较
A：活性氧免疫荧光染色（×100，标尺＝100 μm）；B：内皮祖细胞活性氧含量比较；C：内皮祖细胞凋亡率比较；D：TUNEL免疫荧光染色（×200，标尺＝50 μm），阳性细胞呈现绿色荧光；a：与干预前比较，P<0.05；b：与对照组比较，P<0.05。
Figure 4. Comparison of reactive oxygen species and apoptosis of endothelial progenitor cells
A: Reactive oxygen species immunofluorescence staining (×100, scale bar=100 μm); B: Comparison of reactive oxygen species content in endothelial progenitor cells;C: Apoptosis rate of endothelial progenitor cells; D: TUNEL immunofluorescence staining (×200, scale bar=50 μm); a: Compared with the before-intervention indicator, P < 0.05; b: Compared with the control group, P < 0.05.
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图 5 内皮祖细胞蛋白表达量比较
A：蛋白电泳图；B：NADPH氧化酶2蛋白表达量；C：NADPH氧化酶4蛋白表达量；D：超氧化物歧化酶蛋白表达量；a：与干预前比较，P<0.05；b：与对照组比较，P<0.05。
Figure 5. Comparison of protein expression levels in endothelial progenitor cells
A: Protein electrophoresis; B: NADPH oxidase 2 protein expression; C: NADPH oxidase 4 protein expression; D: Superoxide dismutase protein expression; a: Compared with the before-intervention indicator, P < 0.05; b: Compared with the control group, P < 0.05.
表 1 一般资料比较
Table 1 Comparison of general information
变量（Variable） 对照组
(Control
group)
(n=26)运动组
(Exercise
group)
(n=28)t/χ2 P 人口统计学参数(Demographic parameter) 年龄/岁(Age/years)，$ {{\bar x}} $±s 45.0±10.1 48.1±8.1 −1.222 0.227 病程/年(Course of disease/years)，
$ {{\bar x}} $±s7.6±3.0 8.3±2.7 −0.934 0.355 高血压分级(Hypertension
classification)，I/II20/6 23/5 0.226 0.634 高血压家族史(Family history of
hypertension)，n(%)23(88.5) 26(92.9) 0.310 0.578 身体形态学参数(Body morphological parameter) 身高(Height)/m，$ {{\bar x}} $±s 1.71±0.06 1.73±0.05 −1.255 0.215 体质量(Body mass)/kg，$ {{\bar x}} $±s 74.9±11.0 79.0±8.8 −1.480 0.145 体质量指数(Body mass
index)/(kg·m−2)，$ {{\bar x}} $±s25.6±4.3 26.3±3.3 −0.696 0.489 血液动力学参数(Hemodynamic parameter) 收缩压(Systolic blood
pressure)/mmHg，$ {{\bar x}} $±s130.0±8.7 127.9±8.3 0.962 0.359 舒张压(Diastolic blood
pressure)/mmHg，$ {{\bar x}} $±s79.3±5.5 81.5±5.2 −1.537 0.130 心率(Heart rate)/(次·分−1) ，$ {{\bar x}} $±s 75.9±6.4 77.3±5.8 −0.847 0.401 服用药物种类(Type of medication) 利尿剂(Diuretic)，n(%) 24(92.3) 25(89.3) 0.147 0.702 钙离子阻断剂(Calcium blocker)，
n(%)10(38.5) 15(53.6) 1.238 0.266 β受体阻断剂(Beta-blocker)，n(%) 12(46.2) 16(57.1) 0.652 0.419 
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表 2 血压水平比较
Table 2 Comparison of blood pressure
血压(Blood pressure) 对照组
(Control group)
(n=26)运动组
(Exercise group)
(n=28)t/Χ2 P 收缩压
(Systolic blood pressure)/mmHg干预前(Before intervention) 130.0±8.7 127.9±8.3 0.926 0.359 干预后(After intervention) 132.5±7.6 122.7±7.0ab 4.917 <0.001 t −1.149 2.404 P 0.261 0.023 舒张压
(Diastolic blood pressure)/mmHg干预前(Before intervention) 79.3±5.5 81.5±5.2 −1.537 0.130 干预后(After intervention) 81.3±5.4 77.4±4.7ab 2.781 0.008 t −1.221 3.067 P 0.233 0.005 [注]a：与干预前比较，P<0.05；b：与对照组比较，P<0.05。[Note] a: Compared with the before-intervention indicator, P < 0.05; b: Compared with the control group, P < 0.05.
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