Changes in expressions of UDP-glucuronosyltransferases in placenta and fetal liver of rats before birth induced by maternal exposure to bisphenol A during pregnancy
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摘要:背景
母体孕期双酚A（BPA）暴露与胎儿早产、低出生体重等不良生长发育状况密切相关，机制仍不清楚。葡萄糖醛酸转移酶（UGTs）调控BPA结合葡萄糖醛酸经尿液排出体外，是BPA重要的消除途径之一。
目的探讨母体孕期BPA暴露对出生前子代大鼠胎盘及肝脏组织中UGTs表达的影响。
方法30只健康SPF级SD孕鼠随机分为对照组（玉米油）、0.05、0.5、5和50 mg·kg−1的BPA暴露组，于妊娠期第5天（GD 5）—GD 19以灌胃方式暴露于BPA，各剂量BPA均溶于玉米油中。于GD 20麻醉孕鼠后剥离胎盘，取出胎鼠，测量胎鼠体长、尾长及体重，分离胎鼠肝脏组织，称重。采用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）及蛋白免疫印迹法（WB）测定各组胎鼠胎盘及肝脏组织中
UGT1A1 、UGT1A6 、UGT1A9 及UGT2B1 的mRNA及蛋白水平。结果母体孕期BPA暴露未对出生前胎鼠体长及尾长产生明显影响，但5和50 mg·kg−1 BPA组胎鼠体重、胎盘重以及5 mg·kg−1 BPA组胎鼠肝脏重均低于对照组（
P< 0.05）。胎盘组织中各UGTs表达结果显示：与对照组相比，0.5 mg·kg−1及以上的BPA组胎盘组织中UGT1A1 mRNA水平及50 mg·kg−1 BPA组胎盘组织中UGT1A1蛋白水平均升高（P <0.05），各BPA组胎盘组织中UGT1A6 mRNA及蛋白水平无明显变化（P >0.05），50 mg·kg−1 BPA组胎盘组织中UGT1A9 mRNA水平、0.5 mg·kg−1及以上的BPA组UGT1A9蛋白水平降低（P <0.05），0.5 mg·kg−1及以上的BPA组胎盘组织中UGT2B1 mRNA水平降低（P <0.05）。肝脏组织中各UGTs表达结果显示：与对照组相比，各BPA组胎鼠肝脏组织中UGT1A1 、UGT1A6 、UGT1A9 及UGT2B1 mRNA水平均升高（P <0.05），各BPA组胎鼠肝组织中UGT1A6蛋白水平无明显改变（P >0.05），50 mg·kg−1BPA组胎鼠肝组织中UGT1A9蛋白水平升高，0.5 mg·kg−1及以上的BPA组胎鼠肝组织中UGT2B1蛋白水平降低（P <0.05）。结论母体孕期BPA暴露后可促进胎盘组织中
UGT1A1 基因蛋白表达，抑制UGT1A9 基因蛋白及UGT2B1 的基因表达；促进胎鼠肝脏组织中UGT1A1 、UGT1A6 、UGTT1A9 及UGT2B1 的基因表达，并促进UGT1A9的蛋白表达，而抑制UGT2B1的蛋白表达，上述改变很可能是母体孕期BPA暴露所致胎儿发育异常的原因之一。Abstract:BackgroundMaternal exposure to bisphenol A (BPA) during pregnancy is closely related to adverse growth and development conditions such as preterm birth and low birth weight, but the relevant mechanisms are still unclear. UDP-glucuronosyltransferases (UGTs) can regulate the excretion of BPA conjugating with glucuronic acid through urine, which is one of the important pathways for BPA elimination.
ObjectiveTo explore the changes in the expression of UGTs in placenta and fetal liver of rats before birth induced by maternal exposure to BPA during pregnancy.
MethodsThirty SPF-grade healthy SD pregnant rats were randomly divided into five groups: control group, 0.05, 0.5, 5, and 50 mg·kg−1 BPA groups. The pregnant rats were exposed to BPA dissolved in corn oil via oral gavage daily from gestational day (GD) 5 to GD 19. After anesthesia, the pregnant rats were sacrificed on GD 20 and the placentas were collected. Body length, tail length, and weight of the fetal rats were measured. Fetal liver tissues were then separated, and organ weights were measured. Real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot (WB) were used to determine the mRNA and protein levels of
UGT1A1 ,UGT1A6 ,UGT1A9 , andUGT2B1 in the placenta and fetal liver tissues in each group.ResultsThere were no differences in body length and tail length of the pups after maternal exposure to BPA during pregnancy. The fetal body weight and placenta weight in the 5 and 50 mg·kg−1 BPA groups and the liver weight in the 5 mg·kg−1 BPA group reduced compared with the control group (
P <0.05). The results of UGTs expressions in placenta showed that compared with the control group, theUGT1A1 mRNA levels in placenta of the BPA groups (exposure dose≥0.5 mg·kg−1) and the UGT1A1 protein level in placenta of the 50 mg·kg−1 BPA group increased (P <0.05); theUGT1A6 mRNA and protein levels in placenta of each BPA group did not change (P >0.05); theUGT1A9 mRNA level in placenta of the 50 mg·kg−1 BPA group and the UGT1A9 protein levels in placenta of the BPA groups (exposure dose≥0.5 mg·kg−1) reduced (P <0.05); while the levels ofUGT2B1 mRNA in placenta of the BPA groups (exposure dose≥0.5 mg·kg−1) reduced (P <0.05). The results of UGTs expressions in fetal liver showed that compared with the control group, theUGT1A1 ,UGT1A6 ,UGT1A9 , andUGT2B1 mRNA levels of each BPA group increased (P <0.05); no obvious alternation was observed in UGT1A6 protein levels in each BPA group (P >0.05); the relative protein levels of UGT1A9 in fetal liver in the 50 mg·kg−1 BPA group increased (P <0.05); conversely, the relative protein levels of UGT2B1 in fetal liver in the BPA groups (exposure dose≥0.5 mg·kg−1) reduced (P <0.05).ConclusionMaternal exposure to BPA during pregnancy can elevate the
UGT1A1 gene and protein expressions, inhibit theUGT1A9 gene and protein expressions andUGT2B1 gene expressions in placenta. Besides, maternal exposure to BPA during pregnancy can raise the gene expressions ofUGT1A1 ,UGT1A6 ,UGT1A9 , andUGT2B1 in fetal liver, as well as the protein expression of UGT1A9, but inhibit the protein expression of UGT2B1. These changes may contribute to fetal developmental abnormalities after maternal exposure to BPA during pregnancy.-
Keywords:
- bisphenol A /
- pregnancy exposure /
- placenta /
- liver /
- UDP-glucuronosyltransferase
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双酚A（bisphenol A, BPA）作为增塑剂在全世界范围内已广泛使用数年，已逐步成为食品、空气、灰尘和土壤中普遍存在的污染物，可对机体诸多系统产生毒性效应[1–3]。流行病学研究表明，孕期是BPA暴露的一个特别敏感的窗口期，在羊水、母乳、脐带血、孕妇尿液中均检测到了BPA的存在[4–6]；并且，出生前的BPA暴露与早产[7–8]、低出生体重[9]及出生后早期神经行为异常[10]等不良生长发育状况密切相关。此外，动物实验及体外研究结果也显示，BPA暴露可扰乱啮齿类动物、人类细胞系的胚胎发育和胎盘功能[11–12]，然而相关机制尚未明确，仍需进一步研究。
BPA可在肝微粒体内通过葡萄糖醛酸转移酶（UDP-glucuronosyltransferases, UGTs）作用下进行葡萄糖醛酸化，随后经粪便和尿液排出体外是目前认为BPA的主要代谢途径之一[6，13]。前期研究显示BPA可透过胎盘屏障，进入子代体内，UGTs在母体与胎儿体内的BPA穿梭中同样发挥重要作用[14]。UGTs是一类II相反应代谢酶，在动物和人类肝脏、肾脏、子宫和胎盘等各组织中广泛存在，并且各亚型的表达具有组织差异性，肝脏中UGTs各亚型普遍存在，其中UGT1A和UGT2B是最重要的亚型。胎盘组织中同样具有UGTs的表达[15]，虽然活性低于成年期肝脏组织中的UGTs，但仍具有一定的代谢能力。
胎盘作为联系母体与胎儿之间的重要纽带，体内重要的屏障之一，能够在一定程度上阻隔外源有害物质进入胎儿体内，然而BPA能够透过胎盘屏障，进入胎儿体内，并对发育中的胎儿产生不利影响。此外，肝脏作为体内最重要的代谢器官，无论是在胎儿期还是出生后各个阶段，对于外源化学物的代谢均具有不可替代的作用。当胎盘及肝脏组织中UGTs表达改变时，可能会干扰BPA的代谢、排泄过程，加强BPA的毒性效应，影响胎儿发育过程；而母体孕期BPA暴露后是否可引起胎盘及肝脏组中UGTs的表达改变，尚未见相关报道。本研究拟建立母体孕期BPA暴露模型，从BPA对胎盘组织及胎鼠肝脏组织中UGT1A家族UGT1A1、UGT1A6、UGT1A9及UGT2B家族UGT2B1各亚型表达影响的角度出发，探讨母体孕期BPA暴露所致胎儿生长发育异常的可能机制，为后续BPA毒性的防治研究提供基础数据。
1. 对象与方法
1.1 主要仪器与试剂
全屏数显游标卡尺（MNT919910，中国美耐特），高通量组织研磨仪（Tissuelyser-48，中国净信），荧光定量PCR仪（7500 Fast，美国ABI），蛋白质电泳和电转印装置（PowerPac Basic，美国Bio-Rad），全自动凝胶成像分析系统（Tanon-5200Multi，中国Tanon）。
玉米油（中国阿拉丁），BPA（日本Tokyo），引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]，Trizol、Evo M-MLV反转录试剂预混液、SYBR Green Pro Taq HS预混型实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescence-based quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR）试剂盒（中国艾科瑞），比辛可宁酸（bicinchoninic acid, BCA）试剂盒、放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay, RIPA）裂解液（中国雅酶），UGT1A1一抗抗体（中国Boster），UGT1A6一抗抗体（中国Bioworld），UGT1A9一抗抗体（中国ABclonal），UGT2B1一抗抗体（中国Affbiotech），β-actin一抗抗体（美国Santa Cruz），辣根酶标记山羊抗兔IgG（中国中杉金桥），聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride membrane, PVDF）。
1.2 实验动物及处理
选用45只SPF级10周龄健康SD大鼠（雌性30只，雄性15只），购自辽宁长生生物，实验动物生产许可证号[SCXK(辽)2020-0001］。大鼠饲养在清洁级动物环境中[温度（23±2）℃，湿度60%~70%，光照/黑暗交替12 h/12 h]，自由进食、饮水。适应性饲养一周后，按雌雄比为2：1比例合笼，以阴道涂片检测到精子之日为妊娠期第0天（gestational 0, GD 0）。确定妊娠后的孕鼠随机分为5组，分别为对照组、0.05、0.5、5和50 mg·kg−1 BPA染毒组，每组6只。各染毒剂量依据如下：0.05 mg·kg−1为每日允许摄入量（tolerable daily intake, TDI)；0.5 mg·kg−1为TDI的10倍；5 mg·kg−1为未观察到有害作用的水平（no observed adverse effect level, NOAEL）以及50 mg·kg−1为观察到有害作用的最低水平（lowest observed adverse effect level, LOAEL）[16–17]。各剂量BPA均溶于玉米油中，于GD 5至GD 19，对照组孕鼠灌胃玉米油，其余各组孕鼠同样采用灌胃方式暴露于BPA，1次·d−1。孕鼠于出生前（GD 20），经麻醉后剖取胎鼠，采用全屏数显游标卡尺测量体长及尾长，称量体重，随后取肝脏组织并称重，并保留相应胎盘组织称重，胎盘、肝脏组织迅速冻于液氮中，后保存于-80 ℃冰箱，后续进行相关指标检测。本研究已通过沈阳医学院实验动物福利伦理委员会审批（审批号：SYYXY2020091501）。
1.3 检测指标及方法
1.3.1 胎鼠体长、尾长的测定
取各组出生前GD 20孕鼠，麻醉后处死实验动物，取胎鼠，通过游标卡尺测量胎鼠的体长与尾长。
1.3.2 胎鼠体重、肝脏、胎盘重量测定
称量胎鼠体重、肝脏和胎盘重量。
1.3.3 实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR）检测胎盘及胎鼠肝脏组织中各UGTs的mRNA表达
分别取各组胎鼠胎盘及肝脏组织约30 mg，每组各6只，按照Trizol试剂盒的操作求提取总RNA，测定总RNA的浓度与纯度。依据Evo M-MLV反转录试剂盒要求操作，将各样本中的mRNA反转录为cDNA。采用RT-PCR试剂盒通过荧光定量PCR仪测定各实验样本中靶基因的循环指数（cycelthrehsold, Ct）值，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）的Ct值为内参，应用2−ΔΔCt方法计算靶基因的相对表达含量。UGT各亚型及GAPDH的引物序列见表1。
表 1 各基因引物序列Table 1. Primer sequences of genes基因名称 正向引物 反向引物 UGT1A1 TGTCCTACGTGCCCAAGAGTT GTCAGGACTAAGAAGGTCCTTG UGT1A6 GATGGCTCCTCTAAGAGAGTA GATCACACCACAGGGCATGG UGT1A9 CTGTGGAGGATATGGACCGTG ACACAGCATCAAAAGAAGACTGC UGT2B1 AAAGGAGCTGCTGTTAGAGTTG GAACCAGCTAAGGTCATGCAG GAPDH GCAAGAGAGAGGCCCTCAG TGTGAGGGAGATGCTCAGTG 1.3.4 蛋白质印迹（Western blot, WB）检测胎盘及胎鼠肝脏组织中各UGTs的蛋白表达
取各组胎盘及胎鼠肝脏组织约30 mg，每组各6只，于PBS内剪碎、清洗后加入预冷的RIPA裂解液，低温下应用高通量组织研磨仪破碎组织，提取蛋白，随后经
12000 r·min−1离心20 min，吸取上清。采用BCA试剂盒测定各样本上清液中蛋白浓度并定至统一质量（30 μg），加入相应体积电泳上样缓冲液，在恒温加热器内加热至100 ℃变性。选择10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，分离蛋白，电泳后将蛋白转印至PVDF膜，封闭1.5 h后，按如下比例加入一抗：UGT1A1(1∶500）、UGT1A6（1∶500）、UGT1A9（1∶500）、UGT2B1（1∶500）及β-actin（1∶2000），4 ℃孵育过夜。次日，漂洗后加入二抗（1:3000 ），孵育2 h后，采用超敏型化学发光液显影后，全自动凝胶成像分析系统采集图像。定量分析结果以所测目标蛋白条带灰度值与内参条带（β-actin）灰度值的比值表示。1.4 统计学方法
采用SPSS 22.0软件进行数据统计与分析，各组数据均以$ \overline x $±s表示，多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用LSD检验。检验水准以P<0.05认为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 母体孕期BPA暴露对胎鼠一般生长情况的影响
由表2可见，母体孕期BPA暴露未对出生前胎鼠体长、尾长产生明显影响（P>0.05）。与对照组相比，5和50 mg·kg−1 BPA组体重、胎盘重低于对照组，5 mg·kg−1 BPA组肝脏重低于对照组（P均<0.05）；与0.05 mg·kg−1 BPA组相比，5和50 mg·kg−1 BPA组体重低于0.05 mg·kg−1 BPA组（P均<0.05）；与0.5 mg·kg−1 BPA组相比，50 mg·kg−1 BPA组体重低于0.5 mg·kg−1 BPA组（P<0.05）。
表 2 各组胎鼠一般生长情况的比较（$ \bar x \pm s$, n=6）Table 2. Comparisons of general growth of fetal rats by groups ($\bar x \pm s $, n=6)BPA/(mg·kg−1) 体长/mm 尾长/mm 体重/g 胎盘重/g 肝脏重/g 0 34.56±1.72 12.56±0.76 2.81±0.09 0.50±0.03 0.25±0.02 0.05 34.30±0.89 13.10±0.52 2.80±0.10 0.48±0.02 0.22±0.02 0.5 34.02±2.46 13.17±0.22 2.79±0.16 0.46±0.04 0.23±0.04 5 34.93±1.42 12.89±0.74 2.61±0.19ab 0.44±0.03a 0.20±0.03a 50 35.30±1.72 12.95±0.32 2.60±0.17abc 0.45±0.03a 0.22±0.03 [注] a：与对照组相比，P<0.05；b：与0.05 mg·kg−1 BPA组相比，P<0.05；c：与0.5 mg·kg−1 BPA组相比，P<0.05。 2.2 母体孕期BPA暴露对胎盘组织中UGTs各亚型基因表达的影响
由图1A-D可见，与对照组和0.05 mg·kg−1 BPA组相比，0.5至50 mg·kg−1 BPA组UGT1A1基因高于对照组和0.05 mg·kg−1 BPA组，50 mg·kg−1 BPA组UGT1A9基因、0.5至50 mg·kg−1 BPA组UGT2B1基因低于对照组和0.05 mg·kg−1 BPA组（P均<0.05）；与0.5 mg·kg−1 BPA组相比，5 mg·kg−1 BPA组UGT1A1基因、50 mg·kg−1 BPA组UGT1A9基因低于0.5 mg·kg−1 BPA组，50 mg·kg−1 BPA组UGT2B1基因高于0.5 mg·kg−1 BPA组（P均<0.05）；与5 mg·kg−1 BPA组相比，50 mg·kg−1 BPA组UGT1A9基因低于5 mg·kg−1 BPA组，50 mg·kg−1 BPA组UGT2B1基因高于5 mg·kg−1 BPA组（P均<0.05）。
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图 1 母体孕期BPA暴露后胎盘组织中UGTs各亚型mRNA水平的比较（$ \bar x \pm s $，n=6）A~D：胎盘组织中UGTs各亚型基因相对表达水平。a：与对照组相比，P<0.05；b：与0.05 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05；c：与0.5 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05；d：与5 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05。Figure 1. Comparison of relative mRNA levels of UGTs subtypes in placenta after maternal exposure to BPA during pregnancy ($ \bar x \pm s$, n=6)2.3 母体孕期BPA暴露对胎盘组织中UGTs各亚型蛋白表达的影响
由图2A-D可见，与对照组和0.05 mg·kg−1 BPA组相比，50 mg·kg−1 BPA组UGT1A1蛋白高于对照组和0.05 mg·kg−1 BPA组，0.5至50 mg·kg−1 BPA组UGT1A9蛋白低于对照组和0.05 mg·kg−1 BPA组（P均<0.05）；与0.5 mg·kg−1 BPA组相比，50 mg·kg−1 BPA组UGT1A1蛋白高于0.5 mg·kg−1 BPA组、5和50 mg·kg−1 BPA组UGT1A9蛋白低于0.5 mg·kg−1 BPA组（P均<0.05）；与5 mg·kg−1 BPA组相比，50 mg·kg−1 BPA组UGT1A1蛋白高于5 mg·kg−1 BPA组（P<0.05）。
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图 2 母体孕期BPA暴露后胎盘组织中UGTs各亚型蛋白相对水平的比较（$ \bar x \pm s$，n=6）A：WB电泳代表图；B~D：胎鼠胎盘组织中UGTs各亚型蛋白相对表达水平。a：与对照组相比，P<0.05；b：与0.05 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05；c：与0.5 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05；d：与5 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05。Figure 2. Comparison of relative protein levels of UGTs subtypes in placenta after maternal exposure to BPA during pregnancy ($ \bar x \pm s$, n=6)2.4 母体孕期BPA暴露对胎鼠肝脏组织中UGTs各亚型基因表达的影响
由图3A-D可见，与对照组相比，除0.05和0.5 mg·kg−1 BPA组UGT2B1基因外，各BPA组UGT1A1基因、UGT1A6基因、UGT1A9基因及UGT2B1基因高于对照组（P均<0.05）；与0.05 mg·kg−1 BPA组相比，5和50 mg·kg−1 BPA组UGT1A1基因、0.5至50 mg·kg−1 BPA组UGT1A6和UGT2B1基因高于 0.05 mg·kg-1BPA 组（P均<0.05）；与0.5 mg·kg−1 BPA组相比，50 mg·kg−1 BPA组UGT1A1和UGT2B1基因、5和50 mg·kg−1 BPA组UGT1A6基因高于0.5 mg·kg−1 BPA组（P均<0.05）；与5 mg·kg−1 BPA组相比，50 mg·kg−1 BPA组UGT2B1基因高于5 mg·kg−1 BPA组（P<0.05）。
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图 3 母体孕期BPA暴露后胎鼠肝脏组织中UGTs各亚型mRNA相对水平的比较（$\bar x \pm s$，n=6）A~D：胎鼠肝脏组织中UGTs各亚型基因相对表达水平。a：与对照组相比，P<0.05；b：与0.05 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05；c：与0.5 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05；d：与5 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05。Figure 3. Comparison of relative mRNA levels of UGTs subtypes in liver of fetal rats after maternal exposure to BPA during pregnancy ($\bar x \pm s$, n=6)2.5 母体孕期BPA暴露对胎鼠肝脏组织中UGTs各亚型蛋白表达的影响
由图4A-D可见，与对照组和0.05 mg·kg−1 BPA组相比，50 mg·kg−1 BPA组UGT1A9蛋白高于对照组和0.05 mg·kg−1 BPA组，0.5至50 mg·kg−1 BPA组UGT2B1蛋白低于对照组和0.05 mg·kg−1 BPA组（P均<0.05）；与0.5和5 mg·kg−1 BPA组相比，50 mg·kg−1 BPA组UGT1A9蛋白高于0.5和5 mg·kg−1 BPA组（P均<0.05）。
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图 4 母体孕期BPA暴露后胎鼠肝脏组织中UGTs各亚型蛋白相对水平的比较（$ \bar x \pm s $，n=6）A：WB电泳代表图，B~D：胎鼠肝脏中UGTs各亚型蛋白相对表达水平。a：与对照组相比，P<0.05；b：与0.05 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05；c：与0.5 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05；d：与5 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05。Figure 4. Comparison of relative protein levels of UGTs subtypes in liver of fetal rats after maternal exposure to BPA during pregnancy ($ \bar x \pm s$, n=6)3. 讨论
据报道，孕妇尿液[18–21]、血液和血清[22–23]样本中游离BPA和总BPA（即结合和非结合总和）平均水平高于非怀孕成年人，并且BPA暴露与人类流产、妊娠并发症、胎儿生长发育受限等密切相关[24]。哺乳动物胎盘组织的正常发育对于妊娠的成功建立与维持以及胚胎发育都具有重要影响。SD大鼠一般于GD 5~GD 6受精卵着床，妊娠期一般为22~25 d，为探讨母体BPA暴露对子代发育以及胎盘的影响，本研究选择了GD 5~GD 19（自受精卵着床至妊娠期结束前1天）给予孕鼠BPA暴露。结果显示，5 mg·kg−1及以上剂量的母体孕期BPA暴露会使出生前胎大鼠体重下降并伴随着胎盘以及胎鼠肝脏重量减轻，可见母体孕期BPA暴露会导致胎大鼠生长发育受限，而前期流行病学研究显示母体孕期BPA暴露会增加婴儿低出生体重风险[25–27]，此外，另一项研究提示孕前30 d至孕后20 d给予大鼠2.5及250 µg·kg−1的BPA暴露（饮水染毒方式）同样观察到了胎盘重量降低的现象[28]，可见围产期BPA暴露能够导致胎盘重量减轻，并导致子代生长发育异常。
UGTs是体内重要II相反应代谢酶，具有多种同工酶，其中UGT1A和UGT2B家族成员承担了大部分外源化学物质的代谢解毒过程，也是BPA暴露引起毒性效应需要着重考虑的UGTs亚型。如果母体孕期BPA暴露后引起上述UGTs各亚型表达改变，会干扰BPA在胎儿体内的代谢、排泄过程，加强BPA毒性效应，从而影响胎儿的生长发育过程。母体孕期暴露的外源化学物首先需要透过胎盘屏障，进入胎儿体内，所以为探究母体孕期BPA暴露所致胎盘发育异常的可能分子机制，本研究以UGTs在胎盘组织中的表达情况为研究内容，结果显示：母体孕期BPA暴露可促进胎盘组织中UGT1A1的基因蛋白表达，而对UGT1A6的基因蛋白表达无显著影响；与UGT1A1改变相反的是，孕期BPA暴露可抑制胎盘组织中的UGT1A9基因蛋白表达以及UGT2B1的基因表达；对比其他UGT亚型，UGT2B1基因表达的下降最显著。前期一项关于全氟辛烷磺酸（perfluorooctane sulfonic acid, PFOS）的研究结果显示母体孕期PFOS暴露可促进雄性子代大鼠胎盘组织中UGT1A1基因的表达，而对雌性大鼠胎盘中UGT1A1基因无显著影响，侧面证实了UGT1A1基因在胎盘中的表达与重要作用[15]。国内外有关BPA暴露对胎盘组织中UGT表达影响的研究极少，Nishikawa等[14]于2010年发表于Environ Health Perspect的研究提出了关于BPA透过胎盘屏障在母体及胎儿内传递的科学假说，该假说提出BPA在母体肝脏UGT的用下形成结合型BPA-GA，该结合型BPA-GA可透过胎盘屏障传递至胎儿体内，认为是BPA在母体与胎儿体内穿梭的可能机制，并观察到了胎盘组织及胎儿肝脏内的UGT2B1基因表达量较母体肝脏低很多，认为UGT2B1的低表达与母体妊娠期BPA暴露所致胎儿发育异常有关。本研究所示的上述胎盘组织中UGTs表达的改变很可能是BPA所致胎盘毒性的原因之一。
肝脏无论是在成年阶段还是胎儿期，都是代谢外源化学物的最重要器官之一，所以本研究同样探讨了胎鼠肝脏中UGTs表达的改变。结果显示，0.05 mg·kg−1的母体孕期BPA暴露可促进胎鼠肝脏组织中UGT1A1、UGT1A6、UGT1A9及UGT2B1的基因表达；但蛋白表达变化与各亚型基因表达结果不完全一致，母体孕期BPA暴露未对胎鼠肝脏组织中UGT1A6蛋白表达产生影响，但在高剂量的BPA暴露（50 mg·kg−1）后可促进胎鼠肝脏组织中UGT1A9的蛋白表达，提示BPA对UGT1A9基因的促进作用要比蛋白的促进作用更为强烈；值得注意的是，母体孕期BPA暴露对UGT2B1蛋白表达的影响不同于其他亚型，表现为即使低剂量BPA暴露后UGT2B1基因表达上升的情况下仍出现了蛋白表达降低的现象；此外，在研究过程中，同样进行了胎鼠肝脏组织中UGT1A1蛋白表达情况的检测，然而在相同实验条件下未检查到其蛋白调条带的明显显影，前期研究显示UGT1A1在胎儿期表达极低，但UGT1A1的表达在宫内发育较快，可在出生后能迅速达到成年水平[29]，这可能是本研究未检测到UGT1A1蛋白表达的原因。UGT1A1具有代谢17β-雌二醇等雌激素的功能[30]，而BPA作为一种类雌激素化合物而被熟知，结合本研究中呈现的胎盘及肝脏组织中UGT1A1的基因及蛋白表达上调的结果，认为UGT1A1表达的增加可能是为代谢出过多的BPA而呈现的代偿性增加效应。针对UGT1A6亚型，在BPA暴露后仅在胎鼠肝脏中出现基因水平的显著改变，而肝脏中的蛋白以及胎盘中的基因蛋白表达均未出现显著改变，可见UGT1A6并不是母体孕期BPA暴露所致两种组织中UGTs改变的关键亚型。此外，Tian等[31]研究发现，野生型小鼠暴露于BPA可引起肝组织稳态失调并引起损伤效应，但UGT1A9敲除减弱了BPA引起的这些不良反应，提示UGT1A9表达升高与BPA暴露诱导的肝脏损伤密切相关，本研究结果显示母体孕期BPA暴露后可引起肝组织中UGT1A9表达的上升，很可能是BPA诱导胎鼠肝脏损伤的重要因子，然而对于胎盘组织中UGT1A9表达降低所呈现的与胎鼠肝脏中UGT1A9表达不同的变化趋势，认为很可能是不同组织中UGT1A9对于BPA响应不同所致，其具体机制仍需后续深入探讨。前期有关BPA暴露对啮齿类动物肝脏中UGTs表达的影响主要关注成年阶段，本研究团队前期研究显示100 mg·kg−1的BPA染毒3周后促进了成年雄性大鼠肝脏中UGT1A1基因表达，而对其蛋白无显著影响，相同剂量BPA暴露未对UGT2B1基因表达产生影响，但促进了UGT2B1的蛋白表达[32]，提示BPA暴露可对UGTs的基因及蛋白表达产生不同效应。此外，另一项研究显示给予成年雄性大鼠50 mg·kg−1的BPA染毒5 d，可促进其肝脏组织中UGT2B1的基因表达，但该研究未进行蛋白水平的检测[33]；大鼠肝脏中UGT2B1（相当于人UGT2B7）被认为是负责BPA葡萄糖醛酸化的主要亚型，上述UGT2B1表达的改变很可能是BPA肝脏毒性作用的重要原因。综合可见，多数UGTs亚型基因改变对BPA的敏感性高于蛋白（较低剂量即出现效应），而针对部分UGTs亚型蛋白变化敏感性更高，可能是由于BPA不仅影响了其转录过程，还可能干预了蛋白质的翻译或促进了其分解，具体机制还需后续深入验证。前期关于母体孕期BPA暴露对胎盘组织及胎鼠肝脏中UGTs的研究较少，本研究所获结果可为相关研究提供一定的研究基础。
综上所述，母体孕期BPA暴露后可促进胎盘组织中UGT1A1基因蛋白表达，抑制UGT1A9基因蛋白及UGT2B1的基因表达；促进胎鼠肝脏中UGT1A1、UGT1A6、UGTT1A9及UGT2B1基因表达，并促进UGT1A9的蛋白表达，而抑制UGT2B1的蛋白表达，上述改变很可能是母体孕期BPA暴露所致胎儿发育异常的原因之一。
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图 1 母体孕期BPA暴露后胎盘组织中UGTs各亚型mRNA水平的比较（$ \bar x \pm s $，n=6）
A~D：胎盘组织中UGTs各亚型基因相对表达水平。a：与对照组相比，P<0.05；b：与0.05 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05；c：与0.5 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05；d：与5 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05。
Figure 1. Comparison of relative mRNA levels of UGTs subtypes in placenta after maternal exposure to BPA during pregnancy ($ \bar x \pm s$, n=6)
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图 2 母体孕期BPA暴露后胎盘组织中UGTs各亚型蛋白相对水平的比较（$ \bar x \pm s$，n=6）
A：WB电泳代表图；B~D：胎鼠胎盘组织中UGTs各亚型蛋白相对表达水平。a：与对照组相比，P<0.05；b：与0.05 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05；c：与0.5 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05；d：与5 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05。
Figure 2. Comparison of relative protein levels of UGTs subtypes in placenta after maternal exposure to BPA during pregnancy ($ \bar x \pm s$, n=6)
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图 3 母体孕期BPA暴露后胎鼠肝脏组织中UGTs各亚型mRNA相对水平的比较（$\bar x \pm s$，n=6）
A~D：胎鼠肝脏组织中UGTs各亚型基因相对表达水平。a：与对照组相比，P<0.05；b：与0.05 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05；c：与0.5 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05；d：与5 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05。
Figure 3. Comparison of relative mRNA levels of UGTs subtypes in liver of fetal rats after maternal exposure to BPA during pregnancy ($\bar x \pm s$, n=6)
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图 4 母体孕期BPA暴露后胎鼠肝脏组织中UGTs各亚型蛋白相对水平的比较（$ \bar x \pm s $，n=6）
A：WB电泳代表图，B~D：胎鼠肝脏中UGTs各亚型蛋白相对表达水平。a：与对照组相比，P<0.05；b：与0.05 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05；c：与0.5 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05；d：与5 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05。
Figure 4. Comparison of relative protein levels of UGTs subtypes in liver of fetal rats after maternal exposure to BPA during pregnancy ($ \bar x \pm s$, n=6)
表 1 各基因引物序列
Table 1 Primer sequences of genes
基因名称 正向引物 反向引物 UGT1A1 TGTCCTACGTGCCCAAGAGTT GTCAGGACTAAGAAGGTCCTTG UGT1A6 GATGGCTCCTCTAAGAGAGTA GATCACACCACAGGGCATGG UGT1A9 CTGTGGAGGATATGGACCGTG ACACAGCATCAAAAGAAGACTGC UGT2B1 AAAGGAGCTGCTGTTAGAGTTG GAACCAGCTAAGGTCATGCAG GAPDH GCAAGAGAGAGGCCCTCAG TGTGAGGGAGATGCTCAGTG 
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表 2 各组胎鼠一般生长情况的比较（$ \bar x \pm s$, n=6）
Table 2 Comparisons of general growth of fetal rats by groups ($\bar x \pm s $, n=6)
BPA/(mg·kg−1) 体长/mm 尾长/mm 体重/g 胎盘重/g 肝脏重/g 0 34.56±1.72 12.56±0.76 2.81±0.09 0.50±0.03 0.25±0.02 0.05 34.30±0.89 13.10±0.52 2.80±0.10 0.48±0.02 0.22±0.02 0.5 34.02±2.46 13.17±0.22 2.79±0.16 0.46±0.04 0.23±0.04 5 34.93±1.42 12.89±0.74 2.61±0.19ab 0.44±0.03a 0.20±0.03a 50 35.30±1.72 12.95±0.32 2.60±0.17abc 0.45±0.03a 0.22±0.03 [注] a：与对照组相比，P<0.05；b：与0.05 mg·kg−1 BPA组相比，P<0.05；c：与0.5 mg·kg−1 BPA组相比，P<0.05。
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