Changes in expressions of UDP-glucuronosyltransferases in placenta and fetal liver of rats before birth induced by maternal exposure to bisphenol A during pregnancy
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摘要:背景
母体孕期双酚A（BPA）暴露与胎儿早产、低出生体重等不良生长发育状况密切相关，机制仍不清楚。葡萄糖醛酸转移酶（UGTs）调控BPA结合葡萄糖醛酸经尿液排出体外，是BPA重要的消除途径之一。
目的探讨母体孕期BPA暴露对出生前子代大鼠胎盘及肝脏组织中UGTs表达的影响。
方法30只健康SPF级SD孕鼠随机分为对照组（玉米油）、0.05、0.5、5和50 mg·kg−1的BPA暴露组，于妊娠期第5天（GD 5）—GD 19以灌胃方式暴露于BPA，各剂量BPA均溶于玉米油中。于GD 20麻醉孕鼠后剥离胎盘，取出胎鼠，测量胎鼠体长、尾长及体重，分离胎鼠肝脏组织，称重。采用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）及蛋白免疫印迹法（WB）测定各组胎鼠胎盘及肝脏组织中
UGT1A1 、UGT1A6 、UGT1A9 及UGT2B1 的mRNA及蛋白水平。结果母体孕期BPA暴露未对出生前胎鼠体长及尾长产生明显影响，但5和50 mg·kg−1 BPA组胎鼠体重、胎盘重以及5 mg·kg−1 BPA组胎鼠肝脏重均低于对照组（
P< 0.05）。胎盘组织中各UGTs表达结果显示：与对照组相比，0.5 mg·kg−1及以上的BPA组胎盘组织中UGT1A1 mRNA水平及50 mg·kg−1 BPA组胎盘组织中UGT1A1蛋白水平均升高（P <0.05），各BPA组胎盘组织中UGT1A6 mRNA及蛋白水平无明显变化（P >0.05），50 mg·kg−1 BPA组胎盘组织中UGT1A9 mRNA水平、0.5 mg·kg−1及以上的BPA组UGT1A9蛋白水平降低（P <0.05），0.5 mg·kg−1及以上的BPA组胎盘组织中UGT2B1 mRNA水平降低（P <0.05）。肝脏组织中各UGTs表达结果显示：与对照组相比，各BPA组胎鼠肝脏组织中UGT1A1 、UGT1A6 、UGT1A9 及UGT2B1 mRNA水平均升高（P <0.05），各BPA组胎鼠肝组织中UGT1A6蛋白水平无明显改变（P >0.05），50 mg·kg−1BPA组胎鼠肝组织中UGT1A9蛋白水平升高，0.5 mg·kg−1及以上的BPA组胎鼠肝组织中UGT2B1蛋白水平降低（P <0.05）。结论母体孕期BPA暴露后可促进胎盘组织中
UGT1A1 基因蛋白表达，抑制UGT1A9 基因蛋白及UGT2B1 的基因表达；促进胎鼠肝脏组织中UGT1A1 、UGT1A6 、UGTT1A9 及UGT2B1 的基因表达，并促进UGT1A9的蛋白表达，而抑制UGT2B1的蛋白表达，上述改变很可能是母体孕期BPA暴露所致胎儿发育异常的原因之一。Abstract:BackgroundMaternal exposure to bisphenol A (BPA) during pregnancy is closely related to adverse growth and development conditions such as preterm birth and low birth weight, but the relevant mechanisms are still unclear. UDP-glucuronosyltransferases (UGTs) can regulate the excretion of BPA conjugating with glucuronic acid through urine, which is one of the important pathways for BPA elimination.
ObjectiveTo explore the changes in the expression of UGTs in placenta and fetal liver of rats before birth induced by maternal exposure to BPA during pregnancy.
MethodsThirty SPF-grade healthy SD pregnant rats were randomly divided into five groups: control group, 0.05, 0.5, 5, and 50 mg·kg−1 BPA groups. The pregnant rats were exposed to BPA dissolved in corn oil via oral gavage daily from gestational day (GD) 5 to GD 19. After anesthesia, the pregnant rats were sacrificed on GD 20 and the placentas were collected. Body length, tail length, and weight of the fetal rats were measured. Fetal liver tissues were then separated, and organ weights were measured. Real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot (WB) were used to determine the mRNA and protein levels of
UGT1A1 ,UGT1A6 ,UGT1A9 , andUGT2B1 in the placenta and fetal liver tissues in each group.ResultsThere were no differences in body length and tail length of the pups after maternal exposure to BPA during pregnancy. The fetal body weight and placenta weight in the 5 and 50 mg·kg−1 BPA groups and the liver weight in the 5 mg·kg−1 BPA group reduced compared with the control group (
P <0.05). The results of UGTs expressions in placenta showed that compared with the control group, theUGT1A1 mRNA levels in placenta of the BPA groups (exposure dose≥0.5 mg·kg−1) and the UGT1A1 protein level in placenta of the 50 mg·kg−1 BPA group increased (P <0.05); theUGT1A6 mRNA and protein levels in placenta of each BPA group did not change (P >0.05); theUGT1A9 mRNA level in placenta of the 50 mg·kg−1 BPA group and the UGT1A9 protein levels in placenta of the BPA groups (exposure dose≥0.5 mg·kg−1) reduced (P <0.05); while the levels ofUGT2B1 mRNA in placenta of the BPA groups (exposure dose≥0.5 mg·kg−1) reduced (P <0.05). The results of UGTs expressions in fetal liver showed that compared with the control group, theUGT1A1 ,UGT1A6 ,UGT1A9 , andUGT2B1 mRNA levels of each BPA group increased (P <0.05); no obvious alternation was observed in UGT1A6 protein levels in each BPA group (P >0.05); the relative protein levels of UGT1A9 in fetal liver in the 50 mg·kg−1 BPA group increased (P <0.05); conversely, the relative protein levels of UGT2B1 in fetal liver in the BPA groups (exposure dose≥0.5 mg·kg−1) reduced (P <0.05).ConclusionMaternal exposure to BPA during pregnancy can elevate the
UGT1A1 gene and protein expressions, inhibit theUGT1A9 gene and protein expressions andUGT2B1 gene expressions in placenta. Besides, maternal exposure to BPA during pregnancy can raise the gene expressions ofUGT1A1 ,UGT1A6 ,UGT1A9 , andUGT2B1 in fetal liver, as well as the protein expression of UGT1A9, but inhibit the protein expression of UGT2B1. These changes may contribute to fetal developmental abnormalities after maternal exposure to BPA during pregnancy.-
Keywords:
- bisphenol A /
- pregnancy exposure /
- placenta /
- liver /
- UDP-glucuronosyltransferase
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帕金森病（Parkinson's disease, PD）是一种常见于中老年人群的神经退行性疾病，在基因和环境因素的共同作用下，具有复杂的病因和病理生理机制[1]。然而，由于PD往往隐匿起病、缓慢恶化，尚无法在疾病早期阶段进行诊断和治疗；此外，因发病过程的不可逆性，PD的预防已逐渐转向其疾病前期阶段——帕金森病前驱期（prodromal Parkinson's disease, pPD）。pPD是个体向PD临床期进展的高危时期，指个体出现便秘、嗅觉减退、情绪障碍或快动眼睡眠行为障碍等非运动症状或轻微运动症状，但尚未达到PD的临床诊断标准[2]。膳食营养作为影响神经系统氧化平衡的重要可调节因素，探讨特定食物种类或营养素与神经系统退行性疾病的研究日益受到关注[3-4]。
多项流行病学研究提示，乳制品摄入可能与PD发生或进展相关，但研究结果不一致。Kyrozis等[5]在希腊人群开展的队列研究发现，牛奶摄入量（≥200 g·d−1）与PD风险呈正相关（HR=1.34，95%CI：1.14~1.58），而奶酪或酸奶摄入量与之无关。另外，Chen等[6]对美国47331名40~75岁卫生专业男性和88563名30~55岁女性护士随访了12年发现，与每天摄入<1份乳制品人群相比，较高的乳制品摄入量（每天摄入≥2.9份乳制品）可能仅增加男性患PD的风险（RRQ4 vs Q1=1.80，95%CI：1.20~2.80）。相反，一项在日本开展的249名患者和368名对照的病例-对照研究结果表明，与低摄入量（<58.7 g·d−1）相比，乳制品高摄入量（58.7~132.5 g·d−1、132.5~208.4 g·d−1、≥208.4 g·d−1）与PD风险无关，且不存在性别差异[7]。以上研究结果提示PD风险可能与各种族人群乳类摄入量的差异有关。虽然乳制品作为潜在的可干预膳食因素已引起了广泛的关注，但目前国外研究主要聚焦乳制品与PD发生风险的关联，缺乏对其前期阶段pPD的探索；国内尚无有关乳制品摄入量与pPD关联的人群研究。
因此，本研究拟利用“神经系统疾病专病社区队列研究”2018年基线和2020年随访调查数据开展55岁及以上人群乳制品摄入与pPD风险关联的前瞻性研究，研究结果将为防控pPD提供相关的膳食指导建议和一定的科学依据。
1. 对象和方法
1.1 研究对象
本研究基于“神经系统疾病专病社区队列研究”项目，该项目根据神经系统疾病的地域（东、中、西部）和城乡分布差异，采用分层多阶段整群随机抽样方法，在陕西、河北、浙江和湖南省建立阿尔茨海默病、PD和癫痫社区人群队列并开展调查，以探索神经系统疾病的相关危险因素，具体的抽样方法、调查方案及质量控制参见文献[8-10]。该项目于分别2018年和2020年完成了基线和第一轮随访调查，随访率为95.5%。本研究选取参与了这两轮调查，并具有完整的基线人口学基本信息、膳食调查及两轮PD风险因素筛查数据者，最终纳入9984名研究对象。
该项目已通过中国疾病预防控制中心营养与健康所伦理审查委员会审查（编号：2017-020），所有调查对象在调查前均签署了知情同意书。
1.2 研究方法
1.2.1 基线乳制品摄入量的评价
经培训合格的调查员携带食物图谱、食物秤等协助工具入户，根据包含10类81种食物的食物频率问卷（Food Frequency Questionnaire, FFQ）面对面询问获得调查对象2018年过去12个月的膳食摄入信息，并随即录入平板电脑。根据FFQ的选项设置“是否摄入”“摄入次数（次·d−1、次·周−1、次·月−1和次·年−1）”和“每次摄入量”计算被调查者每日各种食物的摄入量（每周按7 d，每月按30 d，每年按365 d计算）。该FFQ问卷中乳类包括全脂液体牛奶、低脂/脱脂液体牛奶、全脂奶粉、低脂/脱脂奶粉、酸奶、奶酪6种乳制品，查询第6版中国食物成分表[11]，根据各类乳制品每100 g可食部的蛋白质含量与每100 g牛乳可食部的蛋白质含量的比值，将各类乳制品换算成牛乳的摄入当量[12]。本研究中乳制品摄入量为平均每天各类乳制品的摄入当量之和（g·d−1）。由于本研究中55岁及以上人群未摄入乳制品的比例较高，其摄入水平分组为未摄入组和摄入量三等分组（从低到高分别为T1、T2、T3）。新鲜蔬菜、新鲜水果、红肉和加工肉制品摄入计算为平均每天摄入量（g·d−1）。
此外，调查员采用问卷调查询问家庭食用油和调味品平均每月消费量和通常在家就餐人数，并将其换算成平均每人每天的食用油和调味品消费量。依据《中国食物成分表》[11，13-14]将各类食物、食用油和调味品的摄入量计算出每日能量摄入（kJ·d−1）。
1.2.2 pPD的评估
培训合格的调查员或医务工作者使用PD风险因素筛查问卷、生活方式和疾病史问卷、血生化检测，收集2019年国际运动障碍病协会（International Parkinson and Movement Disorder Society, MDS）更新的pPD诊断研究标准的相关变量[15]：（1）疾病风险标志，包括男性、杀虫剂暴露、职业溶剂暴露、无咖啡因摄入史（包括咖啡和茶叶）、无吸烟史、2型糖尿病（空腹血糖浓度≥7.0 mmol·L−1[16]或自报糖尿病疾病史、目前有胰岛素注射、口服降糖药者）、低身体活动水平（<1.0 Met·h·周-1，包括休闲性、职业性、交通性和家务性身体活动）[17-18]和低血尿酸水平（男性：<297 μmol·L −1），（2）前驱标志，包括嗅觉减退、便秘、过度日间嗜睡、症状性低血压、勃起功能障碍（男性）、泌尿功能障碍和抑郁（采用老年抑郁量表[19]筛查）。两轮调查中都进行了pPD的评估。
根据上述可获得的风险/前驱标志计算研究对象处于pPD的概率，具体计算步骤参见文献[20]。本研究将后验概率作为连续变量并定义为pPD风险水平；将风险/前驱标志的数量作为计数资料并进一步划分为≤2、3~5和≥6个三组。
1.2.3 协变量和分组
本研究纳入的相关基线协变量由培训合格的调查员通过问卷调查和现场体格测量进行收集，具体包括：文化程度（文盲、小学及以下、初中及以上）、家庭人均月收入（<1000、1000~3999、≥4000元）、居住地（农村、城市）、工作（有，包含退休返聘；无，包含离、退休）、饮酒（是或否）、高血压（有或无）、非甾体抗炎药使用史（有或无）、体重指数（body mass index, BMI）（kg·m−2）、膳食能量摄入量（kJ·d−1）、新鲜蔬菜/水果摄入量（g·d−1）、红肉及加工肉制品摄入量（g·d−1）。
1.3 统计学分析
应用SAS 9.4进行数据清理和分析。分类变量用例数和百分比表示，比较采用卡方检验；连续性变量采用M（P25，P75）表示，比较采用Kruskal-Wallis秩和检验。因pPD后验概率的人群分布呈偏态分布，故将后验概率取自然对数后再进行相应的回归分析。采用多重线性回归分析基线乳制品摄入量与随访pPD风险水平（取自然对数）的关联，采用Poisson回归和多项logit回归分析基线乳制品摄入量与随访pPD风险/前驱标志数的关联，应用多因素logistic回归分析基线乳制品摄入与随访pPD各个风险/前驱标志的关联。检验水准α=0.05。
2. 结果
2.1 2018年研究对象的基线特征
本研究共纳入9984名55岁及以上人群，其中男性4296人，女性5688人。年龄构成以55~64岁和65~74岁为主，分别占41.67%和41.16%；农村人群占比（52.60%）高于城市（47.40%）。小学及以上文化程度（83.56%）、家庭人均月收入为1000~3999元（61.33%）、无工作（82.36%）的研究对象居多。过去一年饮酒的人群占比16.41%，有非甾体抗炎药使用史的人群占比4.92%，54.42%的研究对象患有高血压。基线后验概率中位数为0.74%，风险/前驱标志数的中位数为3（表1）。
表 1 2018年乳制品不同摄入水平的中国四省55岁及以上人群的特征分布[M（P25，P75）或n（%）]Table 1. Baseline characteristics of Chinese adults aged 55 and above by intake levels of dairy products in four provinces of China in 2018 [M(P25, P75) or n(%)]特征(Characteristic) 全体(Total)
(n=9984)未摄入组(Non-consumer)
(n=5793)T1(n=1397) T2(n=1397) T3(n=1397) P 乳制品摄入量
(Dairy products intake)/(g·d−1)0.00(0.00，65.45) 0.00(0.00，0.00) 21.43(8.72，32.88) 90.91(71.43，115.58) 250.00(212.12，334.85) <0.001 性别(Gender) 0.035 男(Male) 4296(43.03) 2562(44.23) 569(40.73) 588(42.09) 577(41.30) 女(Female) 5688(56.97) 3231(55.77) 828(59.27) 809(57.91) 820(58.70) 年龄/岁(Age/years) <0.001 55~64 4160(41.67) 2430(41.95) 650(46.53) 575(41.16) 505(36.15) 65~74 4109(41.16) 2419(41.76) 536(38.37) 558(39.94) 596(42.66) ≥75 1715(17.18) 944(16.30) 211(15.10) 264(18.90) 296(21.19) 文化程度(Education) <0.001 文盲(Illiteracy) 1642(16.45) 1184(20.44) 173(12.38) 110(7.87) 175(12.53) 小学及以下
(Primary school and below)4258(42.65) 2685(46.35) 638(45.67) 483(34.57) 452(32.36) 初中及以上
(Middle school and above)4084(40.91) 1924(33.21) 586(41.95) 804(57.55) 770(55.12) 家庭人均月收入/元(Monthly household income per capita/yuan) <0.001 <1000 2348(23.52) 1647(28.43) 300(21.47) 204(14.60) 197(14.10) 1000~3999 6123(61.33) 3405(58.78) 901(64.50) 926(66.28) 891(63.78) ≥4000 1513(15.15) 741(12.79) 196(14.03) 267(19.11) 309(22.12) 居住地(Residential area) <0.001 农村(Rural) 5252(52.60) 3436(59.31) 626(44.81) 618(44.24) 572(40.94) 城市(Urban) 4732(47.40) 2357(40.69) 771(55.19) 779(55.76) 825(59.06) 工作(Active employment) <0.001 无(No) 8223(82.36) 4536(78.30) 1190(85.18) 1229(87.97) 1268(90.77) 有(Yes) 1761(17.64) 1257(21.70) 207(14.82) 168(12.03) 129(9.23) 饮酒(Drinking) 0.002 否(No) 8346(83.59) 4892(84.45) 1174(84.04) 1159(82.96) 1121(80.24) 是(Yes) 1638(16.41) 901(15.55) 223(15.96) 238(17.04) 276(19.76) BMI/kg·m−2 24.06(21.79，26.37) 23.94(21.61，26.30) 24.21(21.68，26.43) 24.26(22.31，26.55) 24.18(22.03，26.56) <0.001 高血压(Hypertension) <0.001 无(No) 4551(45.58) 2640(45.57) 698(49.96) 626(44.81) 587(42.02) 有(Yes) 5433(54.42) 3153(54.43) 699(50.04) 771(55.19) 810(57.98) 非甾体抗炎药使用史(Use of non-steroidal anti-inflammatory drugs) <0.001 无(No) 9493(95.08) 5612(96.88) 1330(95.20) 1269(90.84) 1282(91.77) 有(Yes) 491(4.92) 181(3.12) 67(4.80) 128(9.16) 115(8.23) 膳食能量摄入量
(Total energy intake)/(kJ·d−1)6270.64
(4845.74，8104.07)6188.09
(4754.82，7949.52)5747.10
(4385.29，7666.01)6093.45
(4948.25，7871.40)7216.69
(5740.32，9357.64)<0.001 新鲜蔬菜摄入量
(Fresh vegetables intake)/(g·d−1)169.86
(85.05，294.45)158.00
(78.33，278.14)142.86
(63.57，259.62)181.67
(102.16，311.14)225.62
(124.29，355.95)<0.001 新鲜水果摄入量
(Fresh fruits intake)/(g·d−1)40.76(16.08，85.71) 33.67(13.33，67.67) 31.87(14.33，75.00) 60.91(25.99，114.29) 71.43(31.43，143.35) <0.001 红肉和加工肉制品摄入量
(Red meat and processed
meat intake)/(g·d−1)28.57(11.43，60.48) 28.57(11.37，69.23) 24.52(8.81，51.67) 28.57(14.00，51.19) 29.43(13.33，61.17) <0.001 后验概率(Post-test probability)/% 0.74(0.40，1.57) 0.74(0.39，1.49) 0.65(0.37，1.36) 0.74(0.40，1.57) 0.80(0.42，2.04) <0.001 风险/前驱标志数
(Number of risk/
prodromal markers)3(2，4) 3(3，4) 3(2，4) 3(2，4) 3(2，5) 0.090 由表1可见，基线时，有58.02%（5793/9984）的55岁及以上人群在过去的一年中没有摄入乳制品；在摄入乳制品的人群中，女性、55~74岁、初中及以上文化程度、家庭人均月收入≥1000元、居住在城市、无工作人群乳制品摄入量较高（P<0.05）；不同乳制品摄入水平下的性别、年龄、文化程度、家庭人均月收入、居住地、工作状态、饮酒、高血压、非甾体抗炎药使用史、BMI、膳食能量摄入量、新鲜蔬菜摄入量、新鲜水果摄入量及红肉和加工肉制品摄入量分布差异均具有统计学意义（P<0.05）。
2.2 基线不同乳制品摄入水平人群的随访pPD情况
由表2可见，研究对象的风险/前驱标志数的中位数为3，66.74%的研究对象有3~5个风险/前驱标志，pPD后验概率的M（P25，P75）为0.74%（0.42%，1.46%）。
表 2 基线乳制品不同摄入水平的中国四省55岁及以上人群的随访pPD情况分布[M（P25，P75）或n（%）]Table 2. Distribution of pPD at follow-up by intake levels of dairy products among Chinese adults aged 55 and above in four provinces of China in 2020 [M(P25, P75) or n(%)]变量(Variable) 合计(Total) 未摄入组(Non-consumer) T1(n=1397) T2(n=1397) T3(n=1397) P 先验概率(Prior probability)/% 2.00(1.25，2.50) 2.00(1.25，2.50) 2.00(1.25，2.50) 2.00(1.25，2.50) 2.00(1.25，2.50) 0.389 风险/前驱标志数(Number of risk/prodromal markers) 3(2，4) 3(2，4) 3(2，4) 3(2，4) 3(2，4) 0.052 ≤2 2621(26.25) 1476(25.48) 379(27.13) 386(27.63) 380(27.20) 0.173 3~5 6663(66.74) 3906(67.43) 931(66.64) 922(66.00) 904(64.71) ≥6 700(7.01) 411(7.09) 87(6.23) 89(6.37) 113(8.09) 后验概率(Post-test probability)/% 0.74(0.42，1.46) 0.74(0.41，1.47) 0.74(0.42，1.38) 0.74(0.42，1.49) 0.74(0.42，1.57) 0.602 [注] 乳制品摄入T1、T2、T3组同表1。[Note] The dairy intake T1, T2 and T3 groups are the same as in Table 1. 2.3 乳制品摄入量与pPD风险水平的关联
多重线性回归分析显示，研究对象基线乳制品摄入量与随访pPD风险水平不存在关联（b=0.001，P=0.896），结果见表3。
表 3 中国四省55岁及以上人群乳制品摄入与pPD风险水平关联的多重线性回归分析Table 3. Multiple linear regression analysis on the relationship between dairy products intake and risk levels of pPD among Chinese adults aged 55 and above in four provinces of China模型(Model) b P 模型1(Model 1) −0.005 0.626 模型2(Model 2) 0.001 0.955 模型3(Model 3) 0.001 0.917 模型4(Model 4) 0.001 0.896 [注]使用取自然对数的后验概率进行线性回归分析。模型1调整了基线教育程度、收入水平、居住地和工作状况；模型2进一步调整了基线饮酒、BMI、膳食能量摄入量、新鲜蔬菜和水果摄入量、红肉和加工肉制品摄入量；模型3进一步调整了基线高血压、非甾体抗炎药的使用；模型4进一步调整了取自然对数的基线后验概率。[Note] Results from linear regression analyses use log-transformed data for post-test probability of pPD. Model 1 adjusts education, income level, residential area, and employment at baseline. Model 2 adjusts baseline drinking, BMI, total energy intake, fresh vegetables and fruits intakes, and red meat and processed meat intake on the basis of Model 1 . Model 3 additionally adjusts hypertension, and use of non-steroidal anti-inflammatory drugs at baseline. Model 4 further adjusts the log-transformed post-test probability at baseline. 2.4 乳制品摄入量与pPD风险/前驱标志的关联
由表4可见，Poisson回归分析结果显示，在调整了所有相关协变量后，基线乳制品摄入第3三分位组（T3）在随访时存在风险/前驱标志的可能性是未摄入组的1.159（95%CI：1.065~1.261）倍（P趋势<0.001）。将风险/前驱标志数分组后进行多项logit回归分析，结果未显示出统计学意义的关联。以各风险/前驱标志是否出现作为应变量，进一步分析乳制品摄入与之的关联结果见补充材料表S1，结果显示，与基线乳制品未摄入组相比，基线乳制品摄入较高水平与随访经常杀虫剂暴露风险标志（ORT3=3.370，95%CI：2.310~4.918；P趋势<0.001）及泌尿功能障碍前驱标志（ORT3=2.380，95%CI：1.450~3.905；P趋势<0.001）相关；此外，乳制品摄入较高水平的人群是男性（ORT3=0.754，95%CI：0.655~0.868；P趋势<0.001）和低身体活动水平（ORT3=0.790，95%CI：0.696~0.897；P趋势<0.001）的可能性较低。
表 4 中国四省55岁及以上人群乳制品摄入与pPD标志数的关联Table 4. Associations between dairy products intake and number of pPD markers among Chinese adults aged 55 and above in four provinces of China模型(Model) pPD风险/前驱标志数(Number of risk/prodromal markers) 总体(Total)a 3~5 vs.≤2b ≥6 vs. ≤2b 模型1(Model 1) 未摄入组(Non-consumer) 1 1 1 T1 0.981(0.909~1.059) 0.932(0.815~1.067) 0.811(0.625~1.051) T2 1.019(0.942~1.102) 0.907(0.791~1.040) 0.811(0.624~1.053) T3 1.140(1.050~1.238)* 0.892(0.777~1.024) 1.028(0.805~1.313) P趋势(Ptrend) 0.001 0.102 0.792 模型2(Model 2) 未摄入组(Non-consumer) 1 1 1 T1 0.985(0.912~1.063) 0.964(0.842~1.105) 0.842(0.648~1.093) T2 1.022(0.944~1.107) 0.946(0.824~1.086) 0.848(0.651~1.104) T3 1.155(1.062~1.256)* 0.917(0.795~1.056) 1.094(0.850~1.407) P趋势(Ptrend) <0.001 0.227 0.462 模型3(Model 3) 未摄入组(Non-consumer) 1 1 1 T1 0.990(0.917~1.069) 0.964(0.841~1.105) 0.842(0.648~1.093) T2 1.027(0.948~1.111) 0.946(0.823~1.086) 0.847(0.650~1.104) T3 1.154(1.061~1.255)* 0.917(0.795~1.057) 1.093(0.849~1.407) P趋势(Ptrend) <0.001 0.230 0.463 模型4(Model 4) 未摄入组(Non-consumer) 1 1 1 T1 0.994(0.921~1.073) 0.964(0.841~1.104) 0.839(0.646~1.090) T2 1.033(0.954~1.118) 0.945(0.823~1.086) 0.844(0.648~1.101) T3 1.159(1.065~1.261)* 0.916(0.795~1.057) 1.091(0.847~1.405) P趋势(Ptrend) <0.001 0.229 0.471 [注]模型1调整了基线教育程度、收入水平、城乡和工作状况；模型2进一步调整了基线饮酒、BMI、膳食能量摄入量、新鲜蔬菜和水果摄入量、红肉和加工肉制品摄入量；模型3进一步调整了基线高血压、非甾体抗炎药的使用；模型4进一步调整了基线标志数。a：Poisson回归分析，RR（95%CI）；b：多项logit回归分析，OR（95%CI）。*：P<0.05。[Note] Model 1 adjusts education, income level, residential area, and employment at baseline. Model 2 adjusts baseline drinking, BMI, total energy intake, fresh vegetables and fruits intakes, and red meat and processed meat intake on the basis of Model 1. Model 3 additionally adjusts hypertension, and use of non-steroidal anti-inflammatory drugs at baseline. Model 4 further adjusts number of markers at baseline. a: Poisson regression analysis, RR (95%CI); b: Multinomial logit regression, OR(95%CI). *: P<0.05. 3. 讨论
本研究利用“神经系统疾病专病社区队列研究”2018年基线和2020年随访调查数据，开展了乳制品摄入与55岁及以上人群pPD风险的前瞻性研究。结果显示，2018年过去的一年中约有58%的55岁及以上居民没有摄入乳制品，女性、55~74岁、初中及以上文化程度、家庭月收入≥1000元、居住在城市及无工作人群乳制品摄入较多；基线乳制品摄入与随访pPD风险水平无关联性；基线乳制品摄入较高水平组（T3）在随访时存在pPD风险/前驱标志的可能性是未摄入组的1.159倍；而将标志数量分组后，多项logit回归分析未发现统计学意义的关联。
Jiang等[21]基于7项前瞻性队列研究开展的meta分析发现，牛奶摄入量每增加200 g·d−1，PD风险增加17%（RR=1.17，95%CI：1.06~1.30，非线性P=0.22），而奶酪（RR=1.26，95%CI：0.99~1.60）、酸奶（RR=0.95，95%CI：0.76~1.20）、黄油（RR=0.76，95%CI：0.0.51~1.13）与之无关。有部分研究认为，牛奶中可能存在的农药污染物通过介导神经毒性作用从而影响PD风险水平[22-23]，这提示需要进一步关注乳制品生产和加工过程中农药残留等食品安全问题。本研究结果提示乳制品摄入与杀虫剂暴露（主要来源于长期农药接触）有关，但目前观察到的关联是否完全或部分源于乳制品摄入仍需要进一步研究。此外，Hughes等[24]对美国卫生专业男性队列和女性护士队列分别随访了24和26年，发现摄入低脂乳制品与PD风险相关，与从不食用低脂乳制品的人群相比，每天至少食用3份低脂乳制品人群的PD风险增加（HR=1.34，95%CI：1.01~1.79）。在相同的队列中，Chen等[6]进一步分析表明，乳制品中的钙（RR=1.5，P趋势=0.02）、维生素D（RR=1.6，P趋势=0.004）、乳蛋白（RR=1.6，P趋势=0.01）和乳糖（RR=1.8，P趋势=0.002）与PD患病风险呈正相关，但与乳脂肪（RR=1.1，P趋势=0.4）无关。然而，无论目前流行病学观察到的影响是通过神经毒性污染物还是小分子营养物质介导的，都值得进一步研究。因为乳制品可以提供优质蛋白质、多种维生素，尤其是钙的良好来源，是一种营养成分丰富、组成比例适宜、易消化吸收的天然食物，牛奶及其制品与人群骨密度的增加相关，对中老年人群来说，乳制品是一种营养素密度和生物利用率均较高的食物[25]，限制乳制品摄入并非当前预防PD发生发展的合理策略。
本研究Poisson回归模型结果显示，较高的乳制品摄入量可能与存在较多的pPD风险/前驱标志相关，但多重线性回归结果未发现乳制品摄入与pPD风险水平存在关联，可能的原因有：第一，本研究聚焦的结局为pPD风险水平和相关标志数量，而乳制品的摄入量可能尚不足以影响人群疾病前期阶段pPD的风险水平；第二，研究对象乳制品摄入水平整体偏低，超过一半的55岁及以上人群过去一年未摄入乳制品，《中国居民膳食指南（2022）》推荐每天饮奶300 g或相当量的奶制品[26]，而本研究中乳制品摄入最高三分位组的中位数仅为250 g·d−1，低于国外同类研究的乳制品摄入水平[6-7，26-27]，由于摄入乳制品的人群比例较少且摄入量较低，可能尚未达到引起pPD风险水平变化的阈值量；第三，年龄是影响pPD风险水平的最主要因素[20]，本研究中≥75岁人群仅占17.18%，研究对象的整体年龄偏低，且随访时间较短，基线和随访的后验概率中位数均为0.74%，可能未能体现基线乳制品摄入与随访pPD风险水平的关联，统计效能较低。
本研究首次探索我国55岁及以上人群乳制品摄入量与pPD相关结局的关系，存在一些局限性。首先，本研究采用半定量的FFQ询问调查对象过去一年的各类食物摄入情况，存在膳食信息的回忆偏倚，进而在准确评估乳制品摄入量上存在一定的缺陷；其次，本研究未涉及膳食补充剂（如钙）的摄入情况，膳食因素间复杂的相互作用可能影响pPD的相关结局；再次，由于中西方饮食习惯的差异，相当比例的研究对象不食用乳制品，消费者的摄入水平也较低，无法在关联分析中明确量效关系；另外，本研究虽然在数据分析过程中调整了社会人口经济因素、生活方式、膳食因素等协变量，但观察性研究的本质仍存在残差混杂（如脑外伤、复视、流涎等）；此外，本研究缺少MDS研究标准中高度特异的标志评估，如快动眼睡眠行为障碍、基因或影像学检查等，这可能会低估研究对象的后验概率水平；还有，虽然本研究发现乳制品摄入与经常杀虫剂暴露（主要来源于长期农药接触）和泌尿功能障碍（自报）标志有关，但上述标志均基于PD风险因素筛查相关问题询问所得，而未聚焦乳制品进行客观的检测或诊断，目前观察到的关联是否完全或部分源于乳制品摄入仍需要进一步研究；最后，由于随访时间短，基线招募的调查对象整体年龄偏低，出现“可能或极可能的pPD”结局的人数很少，本研究仅探索了pPD风险水平和相关标志数量与乳制品的关联，对于乳制品与“可能或极可能的pPD”的关系仍需要进一步的前瞻性研究进行探究和验证。
综上，虽然我国四省55岁及以上人群中较高的乳制品摄入水平可能与存在pPD风险/前驱标志相关，但本研究未发现乳制品摄入与pPD风险水平直接相关。目前，无论观察到的潜在影响是通过神经毒性污染物还是小分子营养物质介导的，都值得进一步研究。
（志谢：感谢“神经系统疾病专病社区队列研究”项目组所有参与的工作人员和调查对象对本项目工作的支持与配合。）
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图 1 母体孕期BPA暴露后胎盘组织中UGTs各亚型mRNA水平的比较（$ \bar x \pm s $，n=6）
A~D：胎盘组织中UGTs各亚型基因相对表达水平。a：与对照组相比，P<0.05；b：与0.05 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05；c：与0.5 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05；d：与5 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05。
Figure 1. Comparison of relative mRNA levels of UGTs subtypes in placenta after maternal exposure to BPA during pregnancy ($ \bar x \pm s$, n=6)
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图 2 母体孕期BPA暴露后胎盘组织中UGTs各亚型蛋白相对水平的比较（$ \bar x \pm s$，n=6）
A：WB电泳代表图；B~D：胎鼠胎盘组织中UGTs各亚型蛋白相对表达水平。a：与对照组相比，P<0.05；b：与0.05 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05；c：与0.5 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05；d：与5 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05。
Figure 2. Comparison of relative protein levels of UGTs subtypes in placenta after maternal exposure to BPA during pregnancy ($ \bar x \pm s$, n=6)
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图 3 母体孕期BPA暴露后胎鼠肝脏组织中UGTs各亚型mRNA相对水平的比较（$\bar x \pm s$，n=6）
A~D：胎鼠肝脏组织中UGTs各亚型基因相对表达水平。a：与对照组相比，P<0.05；b：与0.05 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05；c：与0.5 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05；d：与5 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05。
Figure 3. Comparison of relative mRNA levels of UGTs subtypes in liver of fetal rats after maternal exposure to BPA during pregnancy ($\bar x \pm s$, n=6)
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图 4 母体孕期BPA暴露后胎鼠肝脏组织中UGTs各亚型蛋白相对水平的比较（$ \bar x \pm s $，n=6）
A：WB电泳代表图，B~D：胎鼠肝脏中UGTs各亚型蛋白相对表达水平。a：与对照组相比，P<0.05；b：与0.05 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05；c：与0.5 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05；d：与5 mg·kg−1BPA组相比，P<0.05。
Figure 4. Comparison of relative protein levels of UGTs subtypes in liver of fetal rats after maternal exposure to BPA during pregnancy ($ \bar x \pm s$, n=6)
表 1 各基因引物序列
Table 1 Primer sequences of genes
基因名称 正向引物 反向引物 UGT1A1 TGTCCTACGTGCCCAAGAGTT GTCAGGACTAAGAAGGTCCTTG UGT1A6 GATGGCTCCTCTAAGAGAGTA GATCACACCACAGGGCATGG UGT1A9 CTGTGGAGGATATGGACCGTG ACACAGCATCAAAAGAAGACTGC UGT2B1 AAAGGAGCTGCTGTTAGAGTTG GAACCAGCTAAGGTCATGCAG GAPDH GCAAGAGAGAGGCCCTCAG TGTGAGGGAGATGCTCAGTG 
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表 2 各组胎鼠一般生长情况的比较（$ \bar x \pm s$, n=6）
Table 2 Comparisons of general growth of fetal rats by groups ($\bar x \pm s $, n=6)
BPA/(mg·kg−1) 体长/mm 尾长/mm 体重/g 胎盘重/g 肝脏重/g 0 34.56±1.72 12.56±0.76 2.81±0.09 0.50±0.03 0.25±0.02 0.05 34.30±0.89 13.10±0.52 2.80±0.10 0.48±0.02 0.22±0.02 0.5 34.02±2.46 13.17±0.22 2.79±0.16 0.46±0.04 0.23±0.04 5 34.93±1.42 12.89±0.74 2.61±0.19ab 0.44±0.03a 0.20±0.03a 50 35.30±1.72 12.95±0.32 2.60±0.17abc 0.45±0.03a 0.22±0.03 [注] a：与对照组相比，P<0.05；b：与0.05 mg·kg−1 BPA组相比，P<0.05；c：与0.5 mg·kg−1 BPA组相比，P<0.05。
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2. 王志宏，王惠君，张兵，丁钢强. 关注膳食营养与帕金森病前驱期，主动应对老龄化挑战. 环境与职业医学. 2023(02): 119-121 . 本站查看
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