Effects of CREB and miR-132-3p on aluminum-induced abnormal phosphorylation of tau protein in rat hippocampus
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摘要:背景
环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（CREB）与miR-132-3p已被证实与认知功能障碍有关。课题组前期已证明铝的神经毒性与tau蛋白异常磷酸化有关，但关于铝是否通过CREB与miR-132-3p影响tau蛋白异常磷酸化的研究尚未报道。
目的探讨铝致大鼠海马tau蛋白异常磷酸化过程中CREB与miR-132-3p的变化情况。
方法随机将28只体重相近的2月龄SD大鼠均匀划分为4个组，包括对照组（使用生理盐水）和低、中、高剂量的铝染毒组[使用10、20、40 μmol·kg−1麦芽酚铝Al(mal)3]。大鼠隔天称重染毒，染毒周期为3个月。染毒后通过水迷宫行为学实验反应大鼠学习记忆能力的变化情况；运用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术来测定
miR-132-3p 基因的表达水平；使用蛋白免疫印记（WB）技术来测定CREB、磷酸化CREB（p-CREB）（Ser133）、RAS GTP酶激活蛋白1（RASA1）、tau和p-tau（Ser396）蛋白的表达水平。结果Morris水迷宫行为学实验结果：在定位航行实验阶段（第1天至第5天）记录实验动物的逃避潜伏期时长，3种剂量的铝染毒组大鼠的逃避潜伏期较于对照组大鼠均有延长（
P <0.05）；在第6天进行的空间探索实验中，与对照组和低剂量铝染毒组的大鼠相比，中、高剂量铝染毒组大鼠在目标象限的停留时间和穿越平台的次数均减少（P <0.05），且高剂量铝染毒组的大鼠在目标象限的停留时间比中剂量铝染毒组短（P <0.05）。qRT-PCR结果：随着Al(mal)3剂量的升高，大鼠海马miR-132-3p 基因表达水平递减（P <0.05）。WB结果显示，与对照组及低剂量铝染毒组相比，中、高剂量铝染毒组大鼠海马的CREB和p-CREB（Ser133）蛋白表达水平均降低（P <0.05），同时低剂量铝染毒组的p-CREB（Ser133）蛋白表达水平也低于对照组（P <0.05），经方差分析趋势检验和Pearson相关分析后发现铝染毒剂量的进一步升高将导致CREB、p-CREB（Ser133）蛋白表达水平的进一步降低（F =36.429,P <0.001；F =78.672,P <0.001），铝染毒剂量与两种蛋白的表达水平呈负相关（r =−0.848,P <0.001；r =−0.928,P <0.001）；各铝染毒组的RASA1、tau蛋白表达水平均高于对照组（P <0.05）；中剂量铝染毒组大鼠海马tau蛋白磷酸化水平高于对照组（P <0.05），而高剂量组大鼠海马tau蛋白磷酸化水平高于其余各组（P <0.05）。结论铝可能通过影响CREB和miR-132-3p促进tau蛋白异常磷酸化，最终导致学习和记忆能力受损。
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关键词:
- 铝 /
- miR-132-3p /
- 环磷酸腺苷反应元件结合蛋白 /
- tau蛋白磷酸化 /
- 学习记忆
Abstract:BackgroundCyclic AMP response element binding protein (CREB) and miR-132-3p have been proved to be related to many neurodegenerative diseases. Our research group previously has demostrated that the neurotoxicity of aluminum is relevant to abnormal phosphorylation of tau protein, but whether aluminum affects the abnormal phosphorylation of tau protein through GREB and miR-132-3p has not been reported yet .
ObjectiveTo investigate the effect of aluminum on CREB and miR-132-3p during abnormal phosphorylation of tau protein in rat hippocampus.
MethodsTwenty-eight two-month-old SD rats with comparable weigh, were randomly assigned to four groups: control group (saline) and low, middle, and high dose exposure groups [10, 20, and 40 μmol·kg−1 Al(mal)3] with each group containing 7 rats, and the exposure period was 3 months by intraperitoneal injection every other day. After rats’ exposure to aluminum, Morris water maze was employed to assess their capabilities of learning and memory. The
miR-132-3p gene expression level was detected by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). The levels of CREB, phosphorylated CREB (p-CREB) (Ser133), RAS p21 protein activator 1 (RASA1) tau, and p-tau (Ser396) proteins were determined by Western blot.ResultsThe results of Morris water maze showed that in the navigation experiment (from first day to the fifth day), the average escape latency of the rats exposed to three doses of aluminum was longer than that of the control rats (
P <0.05). The middle dose group and the high dose group demonstrated shorter duration and lower frequency of platform traversal in the designated quadrant when compared to the control group and the low dose group (P <0.05). Moreover, the duration in the target quadrant of the rats exposed to high dose aluminum was shorter than that of the rats exposed to medium dose aluminum (P <0.05). The results of Morris water maze suggested that aluminum could damage the learning and memory ability of rats. The qRT-PCR findings indicated a decline inmiR-132-3p gene expression in rat hippocampus correlating with higher Al(mal)3 dose (P <0.05). The Western blot test showed that the protein expressions of CREB and p-CREB (Ser133) were reduced in both the middle dose group and the high dose group (P <0.05) when compared to the control group and the low dose group, and likewise, compared to the control group, the group receiving low dose exhibited lower level of p-CREB (Ser133) protein expression (P <0.05). It was found that the further increase of aluminum exposure dose would lead to the further decrease of CREB and p-CREB (Ser133) protein expression levels (F =36.429,P <0.001;F =78.672,P <0.001), aluminum exposure dose was negatively correlated with the expression levels of the two proteins (r =−0.848,P <0.001;r =−0.928,P <0.001). The expression levels of RASA1 protein and tau protein in the aluminum exposure groups surpassed those in the control group (P <0.05). The tau protein phosphorylation level was higher in the middle dose group than in the control group (P <0.05), while the high dose group showed elevated phosphorylation level relative to the control group, the low dose group, and the middle dose group (P <0.05).ConclusionAluminum may promote abnormal phosphorylation of tau protein by affecting CREB and miR-132-3p, which eventually leads to the impairment of learning and memory ability.
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铝具有诸多良好的性能，广泛应用于生活与工业，然而，已有不少研究证实了铝的神经毒性。一些导致学习记忆能力受损的病理表现与铝有关，其中包括tau蛋白异常磷酸化[1]。课题组前期研究发现，急性铝暴露后，大鼠海马RAS蛋白活性显著降低，并且随着染毒剂量的递增而递减，呈现出一定的剂量依赖性[2]。RAS蛋白是环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cyclic AMP response element binding protein, CREB）的上游，它能够正向调控CREB，课题组前期研究也证实了铝可以下调CREB的表达[3]。CREB是一种重要的转录因子，p-CREB（Ser133）是CREB的活化形式，调控多种基因的转录和蛋白的表达，已有研究指出CREB的失调与tau蛋白异常磷酸化有关[4]。
微小RNA（microRNA, miRNA）是一类非编码单链RNA分子，它与多种神经退行性疾病有关[5]。Wanet等[6]指出，CREB在多种生物学过程中直接参与miR-132-3p转录。miR-132-3p是脑中含量最丰富的miRNA之一，并且具有强神经保护活性，它可靶向调节多种导致tau蛋白异常磷酸化的激酶，如双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶（dual-specificity tyrosine phosphorylation regulated kinase 2, DYRK2）、糖原合成激酶-3β（glycogen synthase kinase-3 beta, GSK3β）[7]。有研究表明，miR-132-3p能够上调CREB表达，CREB与miR-132-3p之间可形成正反馈环路[8]，其中的机制可能是由于miR-132-3p靶向调节RAS GTP酶激活蛋白1（RAS p21 protein activator 1, RASA1）进而降低RASA1对RAS活性的抑制作用[9]。
本研究假设铝会通过CREB与miR-132-3p影响tau蛋白异常磷酸化。本实验拟通过检测不同铝染毒剂量大鼠海马中CREB和miR-132-3p正反馈环路上相关基因、蛋白的表达差异，进一步探究这条环路在铝诱发大鼠海马tau蛋白异常磷酸化过程中的作用。
1. 对象与方法
1.1 动物及分组
本次实验选取的28只成年（2月龄）SD大鼠系山西医科大学动物医学中心提供，动物许可证编号为[SCXK（晋）2019-0004]。大鼠饲养于劳动卫生学教研室动物房，环境温度在18~26 ℃范围内，湿度控制在40%~70%之间，昼夜的光照时长都是12 h。实验期间，大鼠自由饮食饮水。
随机将28只体重相近的2月龄SD大鼠均匀划分为四个组别，分别是对照组（使用生理盐水）和低、中、高剂量的铝染毒组，根据课题组前期研究经验[10]将低、中、高剂量铝染毒组的Al(mal)3浓度定为10、20、40 μmol·kg−1。大鼠隔天称重染毒，染毒周期为3个月。本实验已通过伦理审批，审查批准编号为DWLL-2004-008。
1.2 主要仪器与试剂
TECAN全波长酶标仪（INFINITE E PLEX，瑞士TECAN），实时荧光定量PCR仪（Quant StudioTM 3，美国Life Technologies），三氯化铝、氢氧化钠（中国天津风船化学试剂），麦芽酚（美国Sigma），二辛宁可酸（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒（中国北京康为世纪），CREB抗体（中国沈阳万类生物），p-CREB（Ser133）抗体（中国武汉三鹰），tau、p-tau（Ser396）抗体（英国Abcam）、RASA1抗体（美国Santa Cruz），miR-132-3p、U6引物（中国广州复能基因）。
麦芽酚铝[Al(mal)3]染毒溶液的配制：按宋珊珊等[11]的方法配制不同剂量组的Al(mal)3染毒溶液，后用10%的NaOH调节pH值至7.4左右，现配现用。
1.3 Morris水迷宫行为学实验检测大鼠学习记忆能力
3个月染毒期结束后进行水迷宫实验。在正式开始水迷宫实验前1天，让大鼠在水池中自由游行2 min以适应实验环境。正式实验开始的第1天至第5天为定位航行实验，记录每只大鼠的逃避潜伏期；在第6天的空间探索实验中，记录每只大鼠的平台穿越次数和在目标象限的停留时长。
1.4 实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR）测定miR-132-3p基因表达水平
大鼠处死后，称取约30 mg大鼠海马组织后采用TRIzol法来提取RNA，随后检测RNA的浓度。利用RNA浓度计算出各组样本在逆转录体系中的用量，在一定条件下进行逆转录与基因扩增（引物序列见表1）。miR-132-3p的内参为U6。
表 1 qRT-PCR引物序列Table 1. The qRT-PCR primer sequence基因 上游引物 下游引物 miR-132-3p 5’CATTGTACAGGGCTATGAAAA3’ — 1.5 蛋白免疫印记（Western blot, WB）测定通路蛋白的相对表达水平
称取适量大鼠海马组织，加入预先配制好的蛋白提取液，再通过超声技术将组织粉碎，然后在冰上静置30 min，
12000 r·min−1离心10 min取上清，再用BCA蛋白定量法来测定蛋白的浓度。依蛋白性质调整分离胶浓度以及电泳、转膜条件，以5%的脱脂奶粉或5%的牛血清白蛋白标准品（bovine serum albumin standard, BSA）作为封闭液，后于一定条件下孵育一抗、二抗[CREB，1∶1000 ；p-CREB（Ser133），1∶4000 ；tau，1∶5000 ；p-tau（Ser396），1∶5000 ；RASA1，1∶200），洗膜后显影。1.6 统计学分析
使用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析，以均数±标准差的形式描述数据处理结果。数据满足方差齐性条件时，运用单因素方差分析进行组间比较，事后比较采用LSD-t检验；数据不满足方差齐性条件时，运用Kruskal-Wallis检验进行组间比较，事后比较采用Bonferroni检验。当P<0.05时，认为差异存在统计学意义。
2. 结果
2.1 亚慢性铝染毒对大鼠一般生理情况的影响
染毒期间，对照组、10、20 μmol·kg−1 Al(mal)3组大鼠毛发色泽及密度良好，正常饮水、进食，精神状态、活动度无明显差异；40 μmol·kg−1 Al(mal)3组大鼠毛发粗糙且略有脱落，精神状态欠佳，活动较为迟缓，其他方面均正常。另外，各组大鼠的体重均正常增长，不同组间大鼠的体重在染毒前和染毒后均无统计学差异（P>0.05）。见图1。
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图 1 铝染毒前后各组大鼠体重（n=7）Figure 1. Body weight of rats in each group before and after aluminum exposure (n=7)2.2 亚慢性铝染毒对大鼠学习记忆能力的影响
水迷宫实验第1天至第5天进行定位航行实验，该阶段需要记录实验动物的逃避潜伏期时长。由表2、图2A可见，第1、2天，大鼠逃避潜伏期长短在四组之间的差别无统计学意义（P>0.05）；第3天，与对照组相比，中、高剂量铝染毒组的逃避潜伏期增加（P<0.05），此外，高剂量铝染毒组逃避潜伏期长于低剂量铝染毒组（P<0.05）；第4、5天，与对照组相比，三种剂量的铝染毒组大鼠较于对照组大鼠逃避潜伏期时长均增加（P<0.05），其中，中、高剂量铝染毒组的逃避潜伏期长于低剂量铝染毒组（P<0.05），高剂量铝染毒组的逃避潜伏期也长于中剂量铝染毒组（P<0.05）。在第6天进行的空间探索实验中，与对照组和低剂量铝染毒组的大鼠相比，中、高剂量铝染毒组的大鼠在目标象限的停留时间和穿越平台的次数减少（P<0.05），高剂量铝染毒组的大鼠在目标象限的停留时间比中剂量铝染毒组短（P<0.05），见图2B、2C。
表 2 各组大鼠的逃避潜伏期（n=7）Table 2. Escape latency of rats in each group (n=7)单位：s 组别 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 对照组 50.54±26.04 23.56±11.42 18.01±0.94 13.05±1.26 9.79±0.35 10 μmol·kg−1 Al(mal)3 52.08±32.67 23.94±14.54 21.61±5.04 14.40±0.53a 11.78±0.77a 20 μmol·kg−1 Al(mal)3 52.44±36.84 25.31±6.77 25.05±2.23a 16.20±1.04ab 14.62±1.23ab 40 μmol·kg−1 Al(mal)3 53.58±27.00 26.67±14.94 26.81±5.46ab 18.66±1.74abc 17.56±1.54abc F 0.011 0.092 6.808 24.063 70.223 P 0.998 0.964 0.002 <0.001 <0.001 [注]a：与对照组相比，P<0.05；b：与10 μmol·kg−1 Al(mal)3组相比，P<0.05；c：与20 μmol·kg−1 Al(mal)3组相比，P<0.05。 ![]()
图 2 各组大鼠的逃避潜伏期（A）、穿越平台次数（B）和目标象限停留时间（C）（n=7）a：与对照组相比，P<0.05；b：与10 μmol·kg−1 Al(mal)3组相比，P<0.05；c：与20 μmol·kg−1 Al(mal)3组相比，P<0.05。Figure 2. Escape latency (A), times of crossing platform (B), and retention time in target quadrant (C) of rats in each group (n=7)2.3 亚慢性铝染毒对大鼠海马miR-132-3p基因表达水平的影响
从图3可看出，随着Al(mal)3剂量的升高，大鼠海马miR-132-3p基因表达水平呈现出递减的趋势（P<0.05）。与对照组相比，所有铝染毒组的miR-132-3p基因表达水平都有所下降（P<0.05）；中、高剂量铝染毒组的miR-132-3p基因表达水平低于低剂量铝染毒组（P<0.05）；同时，高剂量铝染毒组的miR-132-3p基因表达水平低于中剂量铝染毒组（P<0.05）。
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图 3 亚慢性铝染毒对各组大鼠海马miR-132-3p基因表达水平的影响（n=3）a：与对照组相比，P<0.05；b：与10 μmol·kg−1 Al(mal)3组相比，P<0.05；c：与20 μmol·kg−1 Al(mal)3组相比，P<0.05。Figure 3. The impact of subchronic exposure to aluminum on the miR-132-3p gene expression in the hippocampus of rats of each group (n=3)2.4 亚慢性铝染毒对大鼠海马CREB和p-CREB（Ser133）蛋白表达水平的影响
由图4可知，与对照组和低剂量铝染毒组相比，中、高剂量铝染毒组的CREB和p-CREB（Ser133）蛋白的表达水平都显著降低（P<0.05），另外，低剂量铝染毒组的p-CREB（Ser133）蛋白表达水平也低于对照组（P<0.05）。方差分析趋势检验的结果表明，大鼠海马CREB和p-CREB（Ser133）蛋白表达水平均随着铝染毒剂量的升高而降低（F=36.429，P<0.001；F=78.672，P<0.001）；Pearson相关分析的结果也提示了铝染毒剂量与两种蛋白的表达水平呈负相关（r=−0.848，P<0.001；r=−0.928，P<0.001）。
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图 4 亚慢性铝染毒对大鼠海马CREB、p-CREB（Ser133）蛋白表达水平的影响（n=4）a：与对照组相比，P<0.05；b：与10 μmol·kg−1 Al(mal)3组相比，P<0.05。Figure 4. The impact of subchronic exposure to aluminum on the expression levels of CREB and p-CREB (Ser133) proteins in the hippocampus of rats (n=4)2.5 亚慢性铝染毒对大鼠海马RASA1蛋白表达水平的影响
四组的RASA1蛋白表达水平见图5，可以看出，与低、中、高剂量铝染毒组相比，对照组的RASA1蛋白表达水平较低（P<0.05）；此外，与低剂量铝染毒组相比，高剂量铝染毒组的RASA1蛋白表达也呈现出上升的趋势（P<0.05）。
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图 5 亚慢性铝染毒对各组大鼠海马RASA1蛋白表达水平的影响（n=4）a：与对照组相比，P<0.05；b：与10 μmol·kg−1 Al(mal)3组相比，P<0.05。Figure 5. The impact of subchronic exposure to aluminum on the expression levels of RASA1 protein in the hippocampus of rats of each group (n=4)2.6 亚慢性铝染毒对大鼠海马tau和p-tau（Ser396）蛋白表达水平的影响
通过图6可看出，随着铝染毒剂量升高，tau蛋白以及tau蛋白的磷酸化水平升高。较之对照组，各铝染毒组大鼠海马tau蛋白表达水平均升高（P<0.05），相较于低剂量铝染毒组，高剂量铝染毒组的tau蛋白表达水平更高（P<0.05）；中剂量铝染毒组大鼠海马的tau蛋白磷酸化水平[p-tau（Ser396）]高于对照组（P<0.05），高剂量铝染毒组的tau蛋白磷酸化水平[p-tau（Ser396）]高于对照组及低、中剂量铝染毒组（P<0.05）。
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图 6 亚慢性铝染毒对各组大鼠海马tau和p-tau（Ser396）蛋白表达水平的影响（n=4）a：与对照组相比，P<0.05；b：与10 μmol·kg−1 Al(mal)3组相比，P<0.05；c：与20 μmol·kg−1 Al(mal)3组相比，P<0.05。Figure 6. The impact of subchronic exposure to aluminum on the expression levels of tau and p-tau（Ser396） proteins in the hippocampus of rats (n=4)3. 讨论
铝具有多种良好性能，从工业到生活都涉及铝的应用。然而，已有研究证实铝具有神经毒性和强蓄积性，随着时间的推移，铝能够在中枢神经系统中不断积累[12]。铝与多种神经退行性疾病有关[13]，在人类相关疾病的病灶上，学者们发现了较高浓度的铝并证明了铝与疾病之间存在联系[14]，Liang等[15]的动物实验结果表明麦芽酚铝会损害学习和记忆能力。本次实验的水迷宫结果显示，经过3个月的铝染毒处理，大鼠的学习记忆能力受到影响，随着铝染毒剂量的升高，大鼠的学习记忆能力进一步下降，这种影响具有一定剂量依赖性。
CREB作为一个关键的转录因子，对于神经细胞发生、生长分化的多个环节以及功能方面都有重要影响[16–17]。CREB经激活后转化为磷酸化CREB（p-CREB），并进一步增强其靶基因转录和蛋白表达[16–18]。课题组前期研究已证明一定剂量的麦芽酚铝能够减少CREB基因和蛋白的表达，从而导致大鼠的学习和记忆功能受到损害[3]。本次研究发现，与对照组相比，大鼠海马CREB、p-CREB（Ser133）蛋白表达水平均降低，并且随着铝染毒剂量的升高，p-CREB（Ser133）蛋白表达水平进一步降低，由此判断，铝影响CREB蛋白的激活。
miRNA是在转录后水平上调节基因表达，它被看作是转录网络的主要开关，并在正常神经元活动中发挥重要作用，当miRNA受到影响时，会导致多种异常改变[19]。miR-132-3p是脑中含量最丰富的miRNA之一，并且具有强神经保护活性[7]，Cha等[20]指出下调的miR-132-3p与神经退行性疾病病理有关。miR-132-3p的神经保护作用可体现在它能够靶向调节多种导致tau蛋白异常磷酸化的激酶，如GSK3β、DYRK2[7]，史丽[21]通过动物实验和细胞实验验证了过表达miR-132-3p可减少tau蛋白异常磷酸化。铝暴露可使GSK3β蛋白表达升高并且加重tau蛋白异常磷酸化，本次研究发现，铝暴露导致miR-132-3p表达下调，铝染毒浓度越高，下调程度越显著，另外，p-tau（Ser396）蛋白表达量也逐步上升，这与前期研究结果一致[22–23]。有研究发现CREB能够通过调节miR-132-3p的转录来促进神经突触的生长[24]，Wanet等[6]指出CREB在多种生物学过程中直接参与miR-132-3p转录。另有研究证实CREB与miR-132-3p之间并非单向调控关系，而是存在着一种正反馈调节关系[25]。CREB的激活可以促进miR-132-3p的转录，同时，miR-132-3p可以提高CREB的磷酸化水平从而激活CREB，其中的具体机制可能与miR-132-3p对下游基因的靶向调节作用有关[8]。
RASA1是miR-132-3p的靶点之一，miR-132-3p过表达可下调RASA1的表达从而提高CREB的磷酸化水平[18]。这可能是因为RASA1能够使RAS失活，抑制RAS相关通路，而CREB正是RAS相关通路的下游。课题组已证明铝致RAS活性降低[2]，本实验检测了RASA1蛋白表达水平，结果发现经麦芽酚铝染毒大鼠的海马RASA1蛋白表达水平显著上升，与对照组相比，铝染毒组大鼠海马的CREB、p-CREB（Ser133）蛋白表达水平均降低，miR-132-3p转录水平下降，激酶含量增多，促进tau蛋白异常磷酸化；与此同时，miR-132-3p转录水平的下降还可能导致RASA1蛋白表达水平上升，引起RAS活性降低并再次减少CREB活化，进一步加剧tau蛋白异常磷酸化。
本研究结果提示，铝致tau蛋白异常磷酸化的机制同时与CREB和miR-132-3p有关，CREB、miR-132和RASA1之间可能存在正反馈调控关系，铝对CREB和miR-132-3p的正反馈环路上相关基因、蛋白的影响，可能会进一步加重tau蛋白异常磷酸化的情况。本研究后期将补充干预实验，进一步验证CREB与miR-132-3p之间的正反馈调节关系，以及miR-132-3p对tau蛋白异常磷酸化的调控作用。
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图 1 铝染毒前后各组大鼠体重（n=7）
Figure 1. Body weight of rats in each group before and after aluminum exposure (n=7)
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图 2 各组大鼠的逃避潜伏期（A）、穿越平台次数（B）和目标象限停留时间（C）（n=7）
a：与对照组相比，P<0.05；b：与10 μmol·kg−1 Al(mal)3组相比，P<0.05；c：与20 μmol·kg−1 Al(mal)3组相比，P<0.05。
Figure 2. Escape latency (A), times of crossing platform (B), and retention time in target quadrant (C) of rats in each group (n=7)
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图 3 亚慢性铝染毒对各组大鼠海马miR-132-3p基因表达水平的影响（n=3）
a：与对照组相比，P<0.05；b：与10 μmol·kg−1 Al(mal)3组相比，P<0.05；c：与20 μmol·kg−1 Al(mal)3组相比，P<0.05。
Figure 3. The impact of subchronic exposure to aluminum on the miR-132-3p gene expression in the hippocampus of rats of each group (n=3)
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图 4 亚慢性铝染毒对大鼠海马CREB、p-CREB（Ser133）蛋白表达水平的影响（n=4）
a：与对照组相比，P<0.05；b：与10 μmol·kg−1 Al(mal)3组相比，P<0.05。
Figure 4. The impact of subchronic exposure to aluminum on the expression levels of CREB and p-CREB (Ser133) proteins in the hippocampus of rats (n=4)
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图 5 亚慢性铝染毒对各组大鼠海马RASA1蛋白表达水平的影响（n=4）
a：与对照组相比，P<0.05；b：与10 μmol·kg−1 Al(mal)3组相比，P<0.05。
Figure 5. The impact of subchronic exposure to aluminum on the expression levels of RASA1 protein in the hippocampus of rats of each group (n=4)
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图 6 亚慢性铝染毒对各组大鼠海马tau和p-tau（Ser396）蛋白表达水平的影响（n=4）
a：与对照组相比，P<0.05；b：与10 μmol·kg−1 Al(mal)3组相比，P<0.05；c：与20 μmol·kg−1 Al(mal)3组相比，P<0.05。
Figure 6. The impact of subchronic exposure to aluminum on the expression levels of tau and p-tau（Ser396） proteins in the hippocampus of rats (n=4)
表 1 qRT-PCR引物序列
Table 1 The qRT-PCR primer sequence
基因 上游引物 下游引物 miR-132-3p 5’CATTGTACAGGGCTATGAAAA3’ — 
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表 2 各组大鼠的逃避潜伏期（n=7）
Table 2 Escape latency of rats in each group (n=7)
单位：s 组别 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 对照组 50.54±26.04 23.56±11.42 18.01±0.94 13.05±1.26 9.79±0.35 10 μmol·kg−1 Al(mal)3 52.08±32.67 23.94±14.54 21.61±5.04 14.40±0.53a 11.78±0.77a 20 μmol·kg−1 Al(mal)3 52.44±36.84 25.31±6.77 25.05±2.23a 16.20±1.04ab 14.62±1.23ab 40 μmol·kg−1 Al(mal)3 53.58±27.00 26.67±14.94 26.81±5.46ab 18.66±1.74abc 17.56±1.54abc F 0.011 0.092 6.808 24.063 70.223 P 0.998 0.964 0.002 <0.001 <0.001 [注]a：与对照组相比，P<0.05；b：与10 μmol·kg−1 Al(mal)3组相比，P<0.05；c：与20 μmol·kg−1 Al(mal)3组相比，P<0.05。
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