Effects of chronic intermittent hypobaric hypoxia on expression and promoter region methylation of key enzyme genes related to glucose metabolism in diabetic mice
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摘要:背景
慢性间歇性低压低氧（CIHH）能有效改善2型糖尿病（T2DM）。其过程是否与糖代谢关键酶基因启动子区域DNA甲基化这一表观遗传学调控机制有关尚待明确。
目的研究CIHH对T2DM小鼠糖代谢关键酶基因表达和启动子区甲基化的影响，探讨CIHH调节糖代谢的可能机制。
方法40只C57BL/6J雄性小鼠随机分为常压常氧对照（NN/CON）组、慢性间歇性低压低氧干预对照（CIHH/CON）组、常压常氧糖尿病模型（NN/DM）组、慢性间歇性低压低氧干预糖尿病模型（CIHH/DM）组。高脂高糖饲料喂养NN/DM组和CIHH/DM组小鼠7周后，连续5 d按每天40 mg·kg−1（以体重计）剂量腹腔注射50 mmol·L−1链脲佐菌素（STZ）建立T2DM小鼠模型。CIHH/DM组和CIHH/CON组小鼠每天按模拟
5000 m海拔低压低氧干预6 h，NN/DM组和NN/CON组小鼠一直处于常压常氧环境中，连续4周，期间检测血糖变化。CIHH干预实验后评估小鼠葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性，测定小鼠肝中糖酵解关键酶葡萄糖激酶（GK）、丙酮酸激酶（PK）和糖异生关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）、葡萄糖-6-磷酸酶（G6P）的酶活力、基因mRNA相对表达水平和启动子区域DNA甲基化水平。结果与NN/DM组相比，CIHH/DM组小鼠在CIHH干预第25天后血糖降低（
P <0.05）。NN/DM组和CIHH/DM组小鼠均呈现糖尿病性耐量曲线，但CIHH/DM组曲线下面积（AUC）低于NN/DM组（P <0.05）。与NN/DM组相比，CIHH/DM组小鼠血清胰岛素含量和胰岛素抵抗指数（HOMA-IRI）降低（P <0.05），肝GK和PK酶活力升高且基因mRNA表达上调（P <0.05），PEPCK和G6P酶活力下降且基因mRNA表达下调（P <0.05）。各组小鼠肝GK、PK、PEPCK 和G6P 基因启动子区域DNA平均甲基化水平的差异无统计学意义，且与mRNA表达的关联性也无统计学意义。结论CIHH干预可降低T2DM小鼠血糖，改善葡萄糖耐受性和缓解胰岛素抵抗，协调调控糖代谢关键酶活力及其基因mRNA表达，但上述现象与这些糖代谢关键酶基因的启动子区域DNA甲基化水平无关。
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关键词:
- 慢性间歇性低压低氧干预 /
- 糖尿病 /
- 葡萄糖代谢 /
- 关键酶 /
- DNA甲基化
Abstract:BackgroundChronic intermittent hypobaric hypoxia (CIHH) can effectively alleviate type 2 diabetes mellitus (T2DM). In this process, the underlying mechanism in its association with the epigenetic regulation of DNA methylation in the promoter regions of glucose metabolism key enzyme genes remains unclear yet.
ObjectiveTo investigate the effects of CIHH on expression and promoter region methylation of key enzyme genes related to glucose metabolism in diabetes mice, and to explore the underlying mechanism by which CIHH regulates glucose metabolism.
MethodsForty C57BL/6J male mice were divided randomly into a normobaric normoxic control (NN/CON) group, a chronic intermittent hypobaric hypoxia intervention control (CIHH/CON) group, a normobaric normoxic diabetic model (NN/DM) group, and a chronic intermittent hypobaric hypoxia intervention diabetic model (CIHH/DM) group. The mice in the NN/DM and the CIHH/DM groups were fed for 7 weeks with high-fat and high-sugar diet. Subsequently, these mice were intraperitoneally injected consecutively with 50 mmol·L−1 streptozotocin (STZ) for 5 d at a dose of 40 mg·kg−1 (body weight) per day to create T2DM model mice. The mice in the CIHH/DM and the CIHH/CON groups were intervened by simulating hypobaric hypoxia at
5000 m altitude for 6 h per day, while the mice in the NN/DM and the NN/CON groups were always placed in a normobaric normoxic environment. All mice were continuously treated for 4 weeks, and blood glucose were monitored during this period. After the CIHH intervention experiment, the glucose tolerance and insulin sensitivity of mice were evaluated. A set of indicators involved in key glycolytic enzymes glucokinase (GK) and pyruvate kinase (PK), as well as key gluconeogenic enzymes phosphoenolpyruvate carboxyl kinase (PEPCK) and glucose-6-phosphatase (G6P) were measured in the liver of mice, including enzyme activity, relative mRNA expression level, and DNA methylation level in the gene promoter regions.ResultsCompared with the mice in the NN/DM group, the blood glucose levels of the mice in the CIHH/DM group decreased after the 25th day of the CIHH intervention (
P <0.05). Regarding the diabetic glucose tolerance curves, the area under the curve (AUC) of the mice in the CIHH/DM group was lower than that of the NN/DM group (P <0.05). Compared with the mice in the NN/DM group, the mice in the CIHH/DM group showed that the serum insulin content and HOMA of insulin resistance index (HOMA-IRI) decreased (P <0.05), the enzyme activities of GK and PK increased and the relative mRNA expression levels of their genes were up-regulated (P <0.05), while the enzyme activities of PEPCK and G6P decreased and the relative mRNA expression levels of their genes were down-regulated (P <0.05) in liver. The average DNA methylation levels in the promoter regions ofGK ,PK ,PEPCK , andG6P genes in liver of mice in each group were not significantly different (P >0.05), and their correlations with mRNA expression levels were also not statistically significant (P >0.05).ConclusionCIHH intervention may reduce blood glucose level, improve glucose tolerance, alleviate insulin resistance, and regulate the key enzyme activities of glucose metabolism and the relative mRNA expression of their corresponding genes in T2DM mice, but the above phenomena are not related to the DNA methylation levels in the promoter regions of these key enzymes.
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慢性间歇性低压低氧（chronic intermittent hypobaric hypoxia, CIHH）干预是指对人或实验动物采用一定程度的高原低压低氧模拟环境进行长期间断性的暴露[1]。CIHH干预可诱导低氧诱导因子-1α上调，提高机体组织的低氧耐受性，加强大脑、肝、肾等多种组织器官功能，发挥多种有益作用，如改善患者血糖血脂异常，纠正心律失常，对抗心肌缺血再灌注损伤等[2]，因其经济、简便、安全等优点，已被临床用作重要的非药物性辅助治疗措施[3]。流行病学调查发现，长期生活在高海拔地区的居民，如南美洲智利北部高原的艾马拉人和中国青藏高原的藏族人，其罹患Ⅱ型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM）的风险相对较低[4–5]。其机制可能是低压低氧应激诱导机体的糖酵解能力增强，促进机体在低氧环境下优先利用糖进行供能[6]，或通过诱发神经反射、激素分泌等相应的应激变化降低糖尿病患者高血糖症状并改善其糖耐量[7]。进一步研究证明CIHH能显著增强葡萄糖转运蛋白的表达，使葡萄糖转运速率增加，提高胰岛素敏感性[8]。因此利用CIHH模拟高原低氧环境作为辅助治疗手段改善T2DM代谢紊乱逐渐成为一个重要的研究方向，CIHH改善血糖异常的机制成为新热点。
表观遗传学是研究某些因素在不改变DNA分子核苷酸序列的情况下诱导基因表达水平产生变化的科学，揭示表观遗传学现象的机制，可在疾病的防治领域发挥巨大的应用价值[9]。DNA甲基化是重要的表观遗传机制之一，实验证明DNA甲基化与基因转录活性呈负相关[10]。本研究以T2DM小鼠模型为研究对象，模拟
5000 m海拔低压低氧环境进行CIHH干预，判定CIHH对T2DM小鼠糖代谢的影响，并初步探讨CIHH对T2DM小鼠糖代谢关键酶的表观遗传学调控机制，为CIHH在控制血糖和T2DM治疗方面的应用提供理论依据。1. 材料与方法
1.1 实验动物及饲养
40只雄性C57BL/6J小鼠（4周龄，体重17~19 g，SPF级）以及饲养所需的维持饲料、高脂高糖饲料（脂肪热量比58%）均购于长春亿斯实验动物技术有限公司[SCXK（吉）2022-0003]。小鼠于吉林医药学院实验动物中心所属SPF级鼠类实验室[SCXK（吉）2022-0001]饲养，饲养环境设定温度22~26 ℃，相对湿度50%~60%，并采用12 h间隔循环照明模拟昼夜，自由饮食、饮水。实验方案经过吉林医药学院实验动物中心伦理委员会审批（2022-KJT-013，2022-JYT-043），所有操作均符合动物实验的3R原则。
1.2 主要试剂和仪器
链脲佐菌素（streptozotocin, STZ；美国Sigma），血糖检测试剂盒、血清胰岛素检测试剂盒、考马斯亮蓝G-250（中国北京索莱宝），糖代谢关键酶GK、PK、PEPCK、G6P活力测定试剂盒（上海优选），2×SYBR Green qPCR Mix荧光定量PCR试剂盒、SPARKscriptⅡ All-in-one RT SuperMix for qPCR逆转录试剂盒、SPARKeasy组织RNA提取试剂盒（中国山东思科捷），DNA重亚硫酸盐转化试剂盒、组织DNA提取试剂盒、特异性甲基化PCR试剂盒（中国北京天根），引物合成（中国上海生工）。低压低氧环境模拟舱（ZS-DY-HP，中国北京众实迪创），血糖仪（590，中国江苏鱼跃），超微量分光光度计（NanoDrop One，美国Thermo），实时荧光定量PCR仪（C6，中国北京新羿），酶标仪（680，美国Bio-Rad）。
1.3 实验方法
1.3.1 糖尿病小鼠模型的构建
采用维持饲料适应性喂养40只雄性C57BL/6J小鼠1周。随机选取20只小鼠构建T2DM模型，先采用高脂高糖饲料喂养7周，随后每天按40 mg·kg−1（以体重计）剂量腹腔注射50 mmol·L−1 STZ（0.1 mmol·L−1预冷柠檬酸缓冲液，避光，现用现配）1次，连续5 d，每次注射前禁食4 h，期间给予小鼠饮用10%蔗糖水，末次注射后恢复为普通饮用水[11]，此后每天尾尖采血1次测定血糖，连续3 d空腹血糖浓度均＞11.1 mmol·L−1作为判定T2DM模型小鼠的成模标准[12]。另设正常小鼠20只，采用维持饲料和普通饮用水喂养7周，随后每天按3 mL·kg−1（bw）腹腔注射0.1 mmol·L−1柠檬酸缓冲液1次，连续5 d，作为平行对照。
1.3.2 实验动物分组及干预
将20只T2DM模型小鼠随机平均分为2组，分别为常压常氧糖尿病组（NN/DM组）和慢性间歇性低压低氧干预糖尿病组（CIHH/DM组），另将20只用于平行对照的正常小鼠随机平均分为2组，分别为常压常氧对照组（NN/CON组）和慢性间歇性低压低氧干预对照组（CIHH/CON组）。将CIHH/DM组和CIHH/CON组小鼠每天按模拟
5000 m海拔低压低氧环境干预6 h（低压低氧环境模拟舱参数：舱内气压54 kPa，氧气含量10.9%，氮气流量0.4 SLPM），其余时间处于常压常氧环境中，NN/CON组和NN/DM组小鼠一直处于常压常氧环境中，连续28 d[13]。1.3.3 血糖和葡萄糖耐受性的检测
每3 d在低压低氧干预后1 h内尾尖采血测定小鼠血糖。末次低压低氧干预后小鼠禁食6 h，然后进行口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test, OGTT），用400 g·L−1葡萄糖溶液按2.5 g·kg−1（以体重计）剂量灌胃，分别在0、0.25、0.5、1、1.5、2 h时测定血糖含量，根据梯形公式计算OGTT曲线下面积（areas under curve, AUC）[14]。
1.3.4 胰岛素敏感性相关指标的检测
采用1%（质量体积比）戊巴比妥钠，按50 mg·kg−1（以体重计）剂量麻醉禁食18 h的小鼠，眼球取新鲜全血，
1000 ×g离心15 min获得血清。葡萄糖氧化酶法测定血糖含量，酶联免疫法测定血清胰岛素含量，采用梅斯医学在线胰岛素敏感性评分软件（http://m.medsci.cn/scale）计算胰岛素抵抗指数（HOMA of insulin resistance index, HOMA-IRI）、胰岛素敏感性指数（HOMA of insulin sensitivity index, HOMA-ISI）和胰岛β细胞功能指数（HOMA of islet β cell function index, HOMA-β）。1.3.5 糖代谢关键酶活力的检测
取小鼠肝组织，用9倍重量的生理盐水匀浆并在冰水浴中超声破碎，4 ℃下
10000 ×g离心30 min取上清液，即为肝组织总蛋白。将10 μL上清液分别加入葡萄糖激酶（glucokinase, GK）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase, PK）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK）和葡萄糖-6-磷酸酶（glucose 6 phosphatase, G6P）酶活力测定反应体系中检测光密度值，并依据考马斯亮蓝法测定的肝组织总蛋白含量计算酶活力。1.3.6 糖代谢关键酶基因mRNA表达水平的检测
以β-肌动蛋白（β-actin）基因为内参，检测肝组织中GK、PK、PEPCK和G6P基因的mRNA表达水平，所需引物的序列及参数见表1。提取小鼠肝组织中的总RNA，采用紫外分光光度法测定总RNA含量。以总RNA为模板逆转录合成cDNA，逆转录反应体系（20 μL）包含总RNA 1 μL、gDNA清除剂 1 μL、qRT 反应混合液 10 μL、无核酸酶水 8 μL。逆转录反应程序为50 ℃反应15 min，85 ℃终止5 s。定量扩增目的片段，扩增反应体系（20 μL）包含cDNA 1µL、上下游引物各0.5 µL、2×qPCR 反应混合液 10 μL、无核酸酶水 8 μL。扩增反应程序为94 ℃预变性5 min，之后循环反应包括94 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，循环35个反应后72 ℃终末延伸5 min。采用熔解曲线分析确定扩增产物单一性，用2−ΔΔCt公式计算待测基因mRNA的相对表达水平，式中ΔΔCt=ΔCt实验组－ΔCt对照组，各组ΔCt=Ct待测基因－Ct内参基因，Ct值为PCR反应临界循环数。
表 1 mRNA表达检测所需的引物序列Table 1. Primer sequences for mRNA expression detection基因名称 引物序列 GK 正向引物: 5′-TCCCTGTAAGGCACGAAGA-3′ 反向引物: 5′-GAGAAGTCCCACGATGTTGTT-3′ PK 正向引物: 5′-ATGATGTGGATCGAAGGGTC-3′ 反向引物: 5′-TGGGTTGAAAGAAATAGGGT-3′ PEPCK 正向引物: 5′-AGCTGCATAATGGTCTGGACT-3′ 反向引物: 5′-GCCGTCGCAGATGTGAATA-3′ G6P 正向引物: 5′-AGCAGTTCCCTGTCACCTGT-3′ 反向引物: 5′-CGTTGGCTTTTTCTTTCCTC-3′ β-actin 正向引物: 5′-TACCCAGGCATTGCTGACAG-3′ 反向引物: 5′-AGCCACCAATCCACACAGAG-3′ 1.3.7 糖代谢关键酶基因DNA甲基化水平的检测
提取小鼠肝基因组DNA，经超微量分光光度计检测DNA含量和纯度均符合要求，用重亚硫酸盐将小鼠基因组DNA未甲基化修饰的胞嘧啶（cytosine, C）转化为胸腺嘧啶（thymine, T），120 µL反应体系包含DNA样品2 µL（500~
1000 ng）、ddH2O 18 µL、杜氏磷酸缓冲液10 µL、重亚硫酸盐混合液90 µL。转化反应程序为95 ℃反应10 min，然后64 ℃反应45 min。通过Gene Bank数据库查询GK、PK、PEPCK和G6P基因启动子区域序列，利用Meth Primer在线软件（http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi）预测CpG岛和设计扩增片段的PCR引物[15]。预测CpG岛参数为岛计数（island size）>100，鸟嘌呤和胞嘧啶（guanine and cytosine, GC）含量>50%，观察与期望比值（observed/ expected ratio, Obs/Exp）>0.6，设计的引物序列及参数见表2。对扩增片段CpG位点进行分析后，以重亚硫酸盐转化前后小鼠基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增反应体系（20 µL）包含DNA模板2 µL、上下游引物各0.5 µL、dNTPs 2 µL、甲基化特异性PCR DNA聚合酶1 µL、10×PCR缓冲液 2 µL、ddH2O 12 µL。扩增反应程序为94 ℃预变性5 min，之后循环反应包括94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循环35个反应后72 ℃终末延伸5 min。扩增产物测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。利用EMBOSS Needle在线软件将转化前后小鼠扩增产物序列与小鼠基因组参考序列进行比对。CpG位点甲基化水平=该位点C未转化为T的样本数/全部样本数，扩增片段平均甲基化水平=片段内所有CpG位点甲基化水平的平均值。表 2 甲基化检测所需的引物序列Table 2. Primer sequences for methylation detection基因名称 引物序列 GK 正向引物: 5′-AAGAAAAGGTTTTATGTTAGAGAGGG-3′ 反向引物: 5′-ATTATATTTCCCAACAAATTACAACTCA-3′ PK 正向引物: 5′-TAGTTTAGGGTTATTTGGGATATGG-3′ 反向引物: 5′-TCCTTTTCTCTTCTAAACAAAATTTCT-3′ PEPCK 正向引物: 5′-TTGAAGAGGAAGTTATTTTTTTTGTAT-3′ 反向引物: 5′-TAAACACCATCACCCTTAAAACTAC-3′ G6P 正向引物: 5′-TTGTTTTTTTAGAGGATTTAGATTTAATTT-3′ 反向引物: 5′-CAAAGGGATGGGAAGGGGAC-3′ 1.4 统计学分析
采用SPSS 23.0统计软件对实验数据进行处理，计量资料数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析进行组间比较，计数资料数据采用卡方检验，双变量Pearson检验分析相关性，P<0.05表示差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 小鼠血糖和葡萄糖耐量的变化
各组小鼠血糖检测结果见图1。CIHH干预第1天，CIHH/CON组小鼠血糖高于NN/CON组（P<0.05），其他时间点血糖差异无统计学意义。NN/DM组小鼠在干预期间第1、4、7、10、13、16、19、22、25、28天的血糖均高于NN/CON组（P<0.05）。CIHH/DM组小鼠第1天血糖高于NN/DM组（P<0.05），第25、28天血糖低于NN/DM组（P<0.05），其他时间点血糖差异无统计学意义。
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图 1 CIHH干预对小鼠血糖的影响（n=10）空腹血糖。a：与NN/CON组相比，P<0.05；b：与NN/DM组相比，P<0.05。Figure 1. Effect of CIHH intervention on blood glucose in mice (n=10)各组小鼠OGTT检测结果见图2。NN/CON组和CIHH/CON组小鼠均呈现正常糖耐量曲线，且两组小鼠AUC差异无统计学意义。NN/DM组和CIHH/DM组小鼠均呈现糖尿病性糖耐量曲线。NN/DM组小鼠AUC高于NN/CON组（P<0.05）。CIHH/DM组小鼠AUC低于NN/DM组（P<0.05）。
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图 2 CIHH干预对小鼠口服葡萄糖耐量的影响（n=10）A：口服葡萄糖耐量试验；B：曲线下面积。a：与NN/CON组相比，P<0.05；b：与NN/DM组相比，P<0.05；c：30 min时与60 min时相比，P<0.05。Figure 2. Effect of CIHH intervention on OGTT in mice (n=10)2.2 小鼠血清胰岛素含量和胰岛素敏感性相关指标的变化
CIHH干预后各组小鼠血清胰岛素含量和胰岛素敏感性相关指标检测结果见图3。与NN/CON组相比，CIHH/CON组小鼠的血清胰岛素和各胰岛素敏感性相关指标差异均无统计学意义。NN/DM组小鼠的血清胰岛素含量和HOMA-IRI值高于NN/CON组（P<0.05）。NN/DM组小鼠的HOMA-ISI值和HOMA-β值均低于NN/CON组（P<0.05）。CIHH/DM组小鼠的血清胰岛素含量和HOMA-IRI值均低于NN/DM组（P<0.05）。CIHH/DM组和NN/DM组小鼠的HOMA-ISI值和HOMA-β值差异无统计学意义。
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图 3 CIHH干预对小鼠血清胰岛素含量和胰岛素敏感性相关指标的影响（n=10）A：血清胰岛素含量，B：胰岛素抵抗指数（HOMA-IRI），C：胰岛素敏感性指数（HOMA-ISI），D：胰岛β细胞功能指数（HOMA-β）。a：与NN/CON组相比，P<0.05；b：与NN/DM组相比，P<0.05。Figure 3. Effects of CIHH intervention on serum insulin level and insulin sensitivity indexes in mice (n=10)2.3 小鼠肝葡萄糖代谢关键酶活力的变化
CIHH干预后各组小鼠肝葡萄糖代谢关键酶活力检测结果见图4。与NN/CON组相比，CIHH/CON组小鼠肝中GK、PK、PEPCK、G6P活力差异均无统计学意义。NN/DM组小鼠肝中GK、PK活力均低于NN/CON组（P<0.05）。NN/DM组小鼠小鼠肝中PEPCK、G6P活力高于NN/CON组（P<0.05）。CIHH/DM组小鼠肝中GK、PK活力高于NN/DM组（P<0.05）。CIHH/DM组小鼠小鼠肝中PEPCK、G6P活力低于NN/DM组（P<0.05）。
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图 4 CIHH干预对小鼠肝GK、PK、PEPCK和G6P酶活力的影响（n=10）A：葡萄糖激酶；B：丙酮酸激酶；C：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；D：葡萄糖-6-磷酸酶的酶活力。a：与NN/CON组相比，P<0.05；b：与NN/DM组相比，P<0.05。Figure 4. Effects of CIHH intervention on enzyme activities of GK, PK, PEPCK, and G6P in liver of mice (n=10)2.4 小鼠肝葡萄糖代谢关键酶基因mRNA表达水平
CIHH干预后各组小鼠肝葡萄糖代谢关键酶基因mRNA相对表达水平检测结果见图5。与NN/CON组相比，CIHH/CON组小鼠肝中GK、PK、PEPCK、G6P基因的mRNA相对表达水平差异均无统计学意义。NN/DM组小鼠GK、PK基因的mRNA相对表达水平低于NN/CON组（P<0.05）。NN/DM组小鼠PEPCK、G6P基因的mRNA相对表达水平高于NN/CON组（P<0.05）。CIHH/DM组小鼠GK、PK基因的mRNA相对表达水平高于NN/DM组（P<0.05）。CIHH/DM组小鼠PEPCK、G6P基因的mRNA相对表达水平低于NN/DM组（P<0.05）。
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图 5 CIHH干预对小鼠肝GK、PK、PEPCK和G6P基因mRNA表达的影响（n=10）A：葡萄糖激酶；B：丙酮酸激酶；C：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；D：葡萄糖-6-磷酸酶基因mRNA的相对表达水平。a：与NN/CON组相比，P<0.05；b：与NN/DM组相比，P<0.05。Figure 5. Effects of CIHH intervention on mRNA expression of GK, PK, PEPCK, and G6P genes in liver of mice (n=10)2.5 小鼠肝葡萄糖代谢关键酶基因启动子区DNA甲基化水平
小鼠肝GK、PK、PEPCK和G6P基因启动子区域CpG岛预测见图6，结果均未发现符合设定参数的CpG岛。CpG位点分析发现GK、PK、PEPCK和G6P基因启动子区域扩增片段中分别含有7、9、10、5个CpG位点，根据CpG位点所处扩增片段上的位置进行编号，各CpG位点甲基化水平和平均甲基化水平检测结果见图7。各组小鼠GK、PK、PEPCK和G6P基因扩增片段中各CpG位点甲基化水平和平均甲基化水平差异均无统计学意义。
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图 6 小鼠GK、PK、PEPCK和G6P基因启动子区域CpG岛预测和PCR引物设计A：葡萄糖激酶；B：丙酮酸激酶；C：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；D：葡萄糖-6-磷酸酶基因启动子区域CpG岛预测和PCR引物设计结果。红色粗线：输入的基因序列；红色方块：正向（F）和反向（R）的重亚硫酸盐PCR引物。Figure 6. Prediction of CpG islands and design of PCR primers in the promoter regions of GK, PK, PEPCK, and G6P genes in mice![]()
图 7 CIHH干预对小鼠肝GK、PK、PEPCK和G6P基因启动子区域DNA甲基化水平的影响（n=10）A：葡萄糖激酶；B：丙酮酸激酶；C：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；D：葡萄糖-6-磷酸酶基因启动子区域扩增片段中CpG位点的甲基化水平；E：葡萄糖激酶；F：丙酮酸激酶；G：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；H：葡萄糖-6-磷酸酶基因启动子区域扩增片段DNA平均甲基化水平。Figure 7. Effects of CIHH intervention on DNA methylation in promoter regions of GK, PK, PEPCK, and G6P genes in liver of mice (n=10)2.6 相关性分析
小鼠肝GK、PK、PEPCK和G6P酶活力及其基因mRNA相对表达水平和启动子区DNA甲基化水平三者之间的相关性见图8。双变量Pearson检验分析结果发现，肝GK、PK、PEPCK和G6P酶活力与其基因mRNA相对表达水平的相关系数分别为0.684、0.648、0.869和0.830，相关性有统计学意义（P<0.05），而肝GK、PK、PEPCK和G6P基因启动子区DNA甲基化水平与mRNA相对表达水平的相关性无统计学意义。
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图 8 小鼠肝GK、PK、PEPCK和G6P酶活力及其基因启动子区DNA甲基化水平与mRNA相对表达水平的相关性分析（n=10）A：葡萄糖激酶；B：丙酮酸激酶；C：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；D：葡萄糖-6-磷酸酶的酶活力与其基因mRNA相对表达水平相关性散点图；E：葡萄糖激酶；F：丙酮酸激酶；G：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；H：葡萄糖-6-磷酸酶基因启动子区DNA甲基化水平与mRNA相对表达水平相关性散点图。回归曲线（y=ax+b，R2为决定系数）表示存在相关性，P<0.05。Figure 8. Correlation analysis of enzyme activities, promoter region DNA methylation levels, and relative mRNA expression levels of GK, PK, PEPCK, and G6P in liver of mice (n=10)3. 讨论
本研究通过高脂高糖饮食联合腹腔注射STZ方法诱导T2DM小鼠模型验证CIHH对血糖的调节。小鼠T2DM模型构建中，高脂高糖饮食可降低葡萄糖的利用，STZ造成胰岛β细胞损伤，胰岛素分泌功能障碍，导致糖耐量异常。随后经CIHH干预发现，CIHH对正常小鼠血糖、糖耐量和胰岛素敏感性指标没有影响，却可以使T2DM小鼠的血糖有所下降，糖耐量异常也有一定恢复，这与以往的研究结果一致，其机制可能是低压低氧环境诱导葡萄糖转运蛋白GLUT-4表达上调，增强了组织细胞对葡萄糖的摄取利用能力，进而对血糖产生调控作用[5]。此外，本研究还发现CIHH干预降低T2DM小鼠血清胰岛素含量，缓解胰岛素抵抗，但胰岛素敏感性和胰岛β细胞功能并没有得到有效的恢复，说明CIHH干预只能调节机体胰岛素分泌和改善胰岛素抵抗状态，而并不能修复组织细胞的器质性损伤。本实验中还发现CIHH干预首日正常小鼠和T2DM小鼠血糖均有升高，这可能与首次CIHH干预时环境改变产生的应激反应有关[16]。
促进糖酵解和抑制糖异生是改善T2DM葡萄糖代谢紊乱的常用手段。有研究发现CIHH可提高果糖磷酸激酶、乳酸脱氢酶的含量及活性，使机体优先利用糖进行供能，降低血糖[5]。糖酵解关键酶GK、PK和糖异生关键酶PEPCK、G6P在维持血糖平衡中发挥重要作用。本实验中发现，T2DM小鼠GK、PK活力较正常小鼠降低，PEPCK、G6P活力较正常小鼠升高。CIHH干预后，正常小鼠糖代谢相关关键酶的活力均无变化，而T2DM小鼠糖代谢相关关键酶的活力向正常值恢复。进一步检测GK、PK、PEPCK和G6P基因mRNA相对表达水平，结果发现糖代谢相关关键酶的表达变化与其对应关键酶活力高低相一致，具有密切的相关性。说明CIHH可从转录水平调控糖代谢相关关键酶基因表达而提高酶活力，通过增强胞内糖酵解，抑制糖异生，有效调控血糖的下降，进而能降低胰岛素代偿性增高，有助于缓解胰岛素抵抗。其机制与低氧诱导因子（hypoxia inducible factor, HIF）在调节肝脏葡萄糖稳态中的有益作用关系密切，HIF-1α可上调糖酵解基因表达，促进糖的分解代谢，HIF-2α有利于降低肝脏胰高血糖素信号传导，改善葡萄糖耐量，增加胰岛素敏感性[17]。
表观遗传现象与T2DM发生存在密切的相互作用，其中DNA甲基化修饰研究最多[18]。研究发现T2DM患者DNA甲基化水平与正常人群存在显著差异，该差异是T2DM在不同人群中罹患率不同的重要关键因素[19]。DNA甲基化水平的改变可能在高海拔低氧环境适应过程中发挥重要作用，低压低氧诱导DNA低甲基化状态可能是其重要的调控机制之一[20]。CpG位点是DNA分子中以胞嘧啶后接鸟嘌呤为特征的二核苷酸碱基序列，经常是甲基化修饰的目标。而富含大量CpG位点的特定DNA区域片段称为CpG岛，DNA分子甲基化程度通常与CpG岛的分布密度呈正相关，对基因表达和调控起重要的作用[21]。CpG岛通常位于基因启动子区域，本实验首先检测GK、PK、PEPCK和G6P基因启动子区域CpG岛分布情况，结果未发现CpG岛存在，进一步检测重亚硫酸盐转化后PCR扩增启动子区域片段中CpG二核苷酸位点甲基化水平，结果各CpG位点甲基化水平和平均甲基化水平均无明显变化，而且与对应基因mRNA表达水平也无相关性，这说明GK、PK、PEPCK和G6P基因启动子区域的甲基化水平并未对它们的mRNA转录产生影响，其原因可能与这些基因启动子区域本身CpG岛分布少，甲基化程度低有关。本研究仅从代谢酶活力变化和DNA甲基化角度对CIHH对肝糖代谢调控进行初步的探索，而调控代谢酶活力的相关信号通路以及其他表观遗传调控机制，如RNA甲基化、组蛋白化学修饰、非编码RNA的调控以及染色质重塑等，也是重要的研究方向。因此CIHH对肝糖代谢复杂而精密的调控机制尚需进一步更全面的深入研究。
综上所述，CIHH作为一种非药物干预手段，能有效降低T2DM小鼠的血糖水平，改善葡萄糖耐受性和缓解胰岛素抵抗，调控糖酵解和糖异生关键酶的活力及基因mRNA表达，在T2DM治疗方面展现出了潜在的应用前景。尽管CIHH对T2DM小鼠糖代谢的调控可能不依赖糖代谢关键酶基因启动子区的DNA甲基化状态的变化，但这仍然从表观遗传学角度为探索CIHH影响T2DM的分子机制研究积累了坚实的科学数据。
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图 1 CIHH干预对小鼠血糖的影响（n=10）
空腹血糖。a：与NN/CON组相比，P<0.05；b：与NN/DM组相比，P<0.05。
Figure 1. Effect of CIHH intervention on blood glucose in mice (n=10)
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图 2 CIHH干预对小鼠口服葡萄糖耐量的影响（n=10）
A：口服葡萄糖耐量试验；B：曲线下面积。a：与NN/CON组相比，P<0.05；b：与NN/DM组相比，P<0.05；c：30 min时与60 min时相比，P<0.05。
Figure 2. Effect of CIHH intervention on OGTT in mice (n=10)
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图 3 CIHH干预对小鼠血清胰岛素含量和胰岛素敏感性相关指标的影响（n=10）
A：血清胰岛素含量，B：胰岛素抵抗指数（HOMA-IRI），C：胰岛素敏感性指数（HOMA-ISI），D：胰岛β细胞功能指数（HOMA-β）。a：与NN/CON组相比，P<0.05；b：与NN/DM组相比，P<0.05。
Figure 3. Effects of CIHH intervention on serum insulin level and insulin sensitivity indexes in mice (n=10)
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图 4 CIHH干预对小鼠肝GK、PK、PEPCK和G6P酶活力的影响（n=10）
A：葡萄糖激酶；B：丙酮酸激酶；C：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；D：葡萄糖-6-磷酸酶的酶活力。a：与NN/CON组相比，P<0.05；b：与NN/DM组相比，P<0.05。
Figure 4. Effects of CIHH intervention on enzyme activities of GK, PK, PEPCK, and G6P in liver of mice (n=10)
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图 5 CIHH干预对小鼠肝GK、PK、PEPCK和G6P基因mRNA表达的影响（n=10）
A：葡萄糖激酶；B：丙酮酸激酶；C：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；D：葡萄糖-6-磷酸酶基因mRNA的相对表达水平。a：与NN/CON组相比，P<0.05；b：与NN/DM组相比，P<0.05。
Figure 5. Effects of CIHH intervention on mRNA expression of GK, PK, PEPCK, and G6P genes in liver of mice (n=10)
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图 6 小鼠GK、PK、PEPCK和G6P基因启动子区域CpG岛预测和PCR引物设计
A：葡萄糖激酶；B：丙酮酸激酶；C：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；D：葡萄糖-6-磷酸酶基因启动子区域CpG岛预测和PCR引物设计结果。红色粗线：输入的基因序列；红色方块：正向（F）和反向（R）的重亚硫酸盐PCR引物。
Figure 6. Prediction of CpG islands and design of PCR primers in the promoter regions of GK, PK, PEPCK, and G6P genes in mice
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图 7 CIHH干预对小鼠肝GK、PK、PEPCK和G6P基因启动子区域DNA甲基化水平的影响（n=10）
A：葡萄糖激酶；B：丙酮酸激酶；C：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；D：葡萄糖-6-磷酸酶基因启动子区域扩增片段中CpG位点的甲基化水平；E：葡萄糖激酶；F：丙酮酸激酶；G：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；H：葡萄糖-6-磷酸酶基因启动子区域扩增片段DNA平均甲基化水平。
Figure 7. Effects of CIHH intervention on DNA methylation in promoter regions of GK, PK, PEPCK, and G6P genes in liver of mice (n=10)
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图 8 小鼠肝GK、PK、PEPCK和G6P酶活力及其基因启动子区DNA甲基化水平与mRNA相对表达水平的相关性分析（n=10）
A：葡萄糖激酶；B：丙酮酸激酶；C：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；D：葡萄糖-6-磷酸酶的酶活力与其基因mRNA相对表达水平相关性散点图；E：葡萄糖激酶；F：丙酮酸激酶；G：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；H：葡萄糖-6-磷酸酶基因启动子区DNA甲基化水平与mRNA相对表达水平相关性散点图。回归曲线（y=ax+b，R2为决定系数）表示存在相关性，P<0.05。
Figure 8. Correlation analysis of enzyme activities, promoter region DNA methylation levels, and relative mRNA expression levels of GK, PK, PEPCK, and G6P in liver of mice (n=10)
表 1 mRNA表达检测所需的引物序列
Table 1 Primer sequences for mRNA expression detection
基因名称 引物序列 GK 正向引物: 5′-TCCCTGTAAGGCACGAAGA-3′ 反向引物: 5′-GAGAAGTCCCACGATGTTGTT-3′ PK 正向引物: 5′-ATGATGTGGATCGAAGGGTC-3′ 反向引物: 5′-TGGGTTGAAAGAAATAGGGT-3′ PEPCK 正向引物: 5′-AGCTGCATAATGGTCTGGACT-3′ 反向引物: 5′-GCCGTCGCAGATGTGAATA-3′ G6P 正向引物: 5′-AGCAGTTCCCTGTCACCTGT-3′ 反向引物: 5′-CGTTGGCTTTTTCTTTCCTC-3′ β-actin 正向引物: 5′-TACCCAGGCATTGCTGACAG-3′ 反向引物: 5′-AGCCACCAATCCACACAGAG-3′ 
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表 2 甲基化检测所需的引物序列
Table 2 Primer sequences for methylation detection
基因名称 引物序列 GK 正向引物: 5′-AAGAAAAGGTTTTATGTTAGAGAGGG-3′ 反向引物: 5′-ATTATATTTCCCAACAAATTACAACTCA-3′ PK 正向引物: 5′-TAGTTTAGGGTTATTTGGGATATGG-3′ 反向引物: 5′-TCCTTTTCTCTTCTAAACAAAATTTCT-3′ PEPCK 正向引物: 5′-TTGAAGAGGAAGTTATTTTTTTTGTAT-3′ 反向引物: 5′-TAAACACCATCACCCTTAAAACTAC-3′ G6P 正向引物: 5′-TTGTTTTTTTAGAGGATTTAGATTTAATTT-3′ 反向引物: 5′-CAAAGGGATGGGAAGGGGAC-3′
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