-
摘要:背景
矽肺是一种肺部弥漫性纤维化疾病，由长期暴露于游离二氧化硅（SiO2）粉尘引起，发病机制复杂，缺乏有效的治疗。鸦胆子苦醇（Bru）具有多种生物活性，其在矽肺纤维化中的作用尚不明确。
目的探究不同浓度Bru对SiO2诱导小鼠矽肺纤维化的影响。
方法将30只雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组、矽尘组、Bru低剂量（1 mg·kg−1）组、Bru中剂量（2 mg·kg−1）组、Bru高剂量（4 mg·kg−1）组，每组6只；除对照组外，其余各组均采用一次性非气管暴露法滴注50 μL、60 mg·mL−1 SiO2悬浊液建立矽肺小鼠模型，对照组滴注等量生理盐水；Bru组于染尘的同时腹腔注射Bru，连续注射5 d，随后隔天注射，染尘28 d后处死小鼠，收集肺组织。测定小鼠肺系数；采用苏木精-伊红（HE）染色和Masson染色观察小鼠肺组织的病理变化；Western blot法检测小鼠肺组织中凋亡蛋白Cleaved-caspase 3、纤维化相关蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、I型胶原蛋白（Col-I）、自噬相关蛋白Beclin1、微管相关蛋白1轻链3（LC3）、Sequestosome 1（p62/SQSTM1）蛋白、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap1），核因子E2相关因子2（Nrf2）的表达水平；实时荧光定量逆转录PCR（RT-qPCR）检测小鼠肺组织中
Caspase 3 、α-SMA 和Col-I mRNA水平。结果与对照组相比，矽尘组小鼠的肺系数明显升高（
P <0.01）；肺组织中肺泡壁受损，出现炎性细胞浸润、纤维结节和胶原纤维沉积；Cleaved-caspase 3、α-SMA和Col-I的蛋白表达及转录水平均明显上调（P <0.01）；Beclin1、LC3-Ⅱ/I、p62、Nrf2表达水平增加（P <0.05，P <0.01），而Keap1表达水平下降（P <0.05）。与矽尘组相比，Bru低、中剂量组小鼠肺系数降低（P <0.05）；肺组织的病理损伤及胶原沉积明显改善；Cleaved-caspase 3、α-SMA和Col-I的蛋白表达及转录水平下降（P <0.05，P <0.01），Beclin1、LC3-Ⅱ/I、p62、Nrf2表达水平也均明显下降（P <0.05，P <0.01），中剂量组Keap1水平上升（P <0.05）。与矽尘组相比，Bru高剂量组肺系数、病理损伤、Cleaved-caspase 3、α-SMA和Col-I的蛋白表达及转录水平差异无统计学意义（P >0.05）；Beclin1、LC3-Ⅱ/I及Nrf2表达水平降低（P <0.01），p62蛋白表达水平差异无统计学意义（P >0.05），Keap1蛋白水平上升（P <0.01）。结论低、中剂量Bru可能通过Keap1-Nrf2通路调控自噬，改善自噬降解障碍，降低矽肺小鼠的肺系数，减轻矽肺小鼠肺组织中的细胞凋亡，延缓矽肺纤维化的进展。
Abstract:BackgroundSilicosis is a diffuse fibrosis of the lungs caused by long-term inhalation of free silicon dioxide (SiO2). It has a complex pathogenesis and lacks effective treatment. Brusatol (Bru) has a variety of biological activities, and its role in silicosis fibrosis is unclear yet.
ObjectiveTo investigate the effects of different concentrations of Bru on SiO2-induced silicosis fibrosis in mice.
MethodsThirty male C57BL/6J mice were randomly divided into five groups: a control group, a silica group, and three Bru intervention groups with low, medium, and high doses (1, 2, and 4 mg·kg−1), with 6 mice in each group. Except the control group, the remaining groups were established as SiO2-induced silicosis mouse models by using a single tracheal infusion of 50 μL 60 mg·mL−1 SiO2 suspension. The control group was dosed with equal amount of saline. The Bru intervention groups were injected intraperitoneally with Bru for 5 consecutive days and then injected every other day. After 28 d of exposure, the mice were executed and lung tissues were collected. The lung coefficient of the mice was measured, and the pathological changes of the lung tissues were observed after hematoxylin-eosin (HE) and Masson staining. The levels of apoptotic protein Cleaved-caspase 3, fibrosis-related protein α-smooth muscle actin (α-SMA), type I collagen (Col-I), autophagy-associated protein Beclin1, microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3), Sequestosome 1 (p62/SQSTM1), Kelch like ECH-associated protein-1 (Keap1), and nuclear factor erythroid 2 related factor 2 (Nrf2) were detected by Western blot. The mRNA levels of
Caspase 3 ,α-SMA , andCol-I were measured by realtime fluorescence-based quantitative PCR.ResultsCompared with the control group, the lung coefficient of mice in the silica group was significantly increased (
P < 0.01); the lung tissues of the silicosis mice showed damaged alveolar walls, along with infiltration of inflammatory cells, fibrous nodules, and collagen deposition; furthermore, the protein and mRNA levels of Cleaved-caspase 3, α-SMA, and Col-I were significantly increased (P < 0.01); the expression levels of Beclin1, LC3-II/I, p62, and Nrf2 were increased, while that of Keap1 was decreased (P < 0.05). The interventions with low and medium doses of Bru reduced lung coefficient (P < 0.05) and protected against pathological damage and collagen deposition in the lung tissues of the silicosis mice; the protein and mRNA expression levels of Cleaved-caspase 3, α-SMA, and Col-I were significantly decreased in the low and medium dose groups (P < 0.05,P < 0.01), the expression levels of Beclin1, LC3-II/I, p62, and Nrf2 were also decreased (P < 0.05,P < 0.01), and the expression level of Keap1 was increased in the medium dose group (P < 0.05). However, compared with the silica group, the differences in lung coefficient, pathological damage, and protein and mRNA expression levels of Cleaved-caspase 3, α-SMA, and Col-I in the Bru high dose group were not statistically significant (P > 0.05). In addition, the high dose of Bru decreased Beclin1, LC3-II/I, and Nrf2 expression levels (P < 0.01), did not change p62 protein expression level (P > 0.05), while increased Keap1 protein level (P < 0.01).ConclusionLow and medium doses of Bru might regulate autophagy through the Keap1-Nrf2 pathway, ameliorate autophagic degradation impairment, reduce pulmonary coefficient, attenuate apoptosis, and delay the progression of fibrosis in SiO2-induced silicosis mice.
-
Keywords:
- silicosis /
- brusatol /
- lung fibrosis /
- autophagy /
- apoptosis
-
矽肺是由于长期吸入含游离二氧化硅（silicon dioxide, SiO2）粉尘引起的肺部弥漫性纤维化疾病，是危害最严重的尘肺病之一[1]。自噬是真核细胞内的一种自我降解途径，对于维持细胞内环境稳态至关重要[2]。前期的研究发现，矽肺患者肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages, AMs）及矽肺小鼠模型中自噬体增多，自噬底物蛋白Sequestosome 1（p62/SQSTM1）异常增高导致自噬降解障碍，进而加重AMs凋亡并促进纤维化的进展[3–4]，提示p62依赖的选择性自噬在矽肺的发生、发展中发挥重要作用。此外，p62参与细胞内多条信号通路的调控，包括Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Kelch like ECH-associated protein-1, Keap1）-核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2 related factor 2, Nrf2）信号通路[5]。Keap1-Nrf2是重要的细胞防御和存活途径之一，Nrf2作为核转录因子，与Keap1解离进入细胞核，诱导抗氧化基因的转录来激活细胞抗氧化反应[6]。研究发现由自噬失调引起的p62蛋白积累会诱导Nrf2持续激活，造成组织损伤[7–8]，另外在矽肺患者外周血单核细胞中发现Nrf2表达增加[9]，提示Nrf2可能参与矽肺的发病进程。
鸦胆子苦醇（brusatol, Bru）是从苦木科植物鸦胆子果实中提取出来的一种苦木内酯类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多重功效[10]。作为Nrf2的有效抑制剂，Bru可通过抑制Nrf2的激活减少p62的转录延缓大鼠子宫内膜癌的发生，并可通过调控自噬减轻肾小管细胞凋亡[8，11]。据此推测Bru可能通过抑制Nrf2调控p62依赖的选择性自噬，缓解矽肺纤维化。因此，本研究拟建立SiO2诱导的小鼠矽肺模型，并予以不同浓度的Bru干预，探讨Bru对小鼠矽肺纤维化的作用。
1. 对象与方法
1.1 实验动物
30只无特定病原体（specific pathogen free, SPF）级C57BL/6J雄性小鼠，6~8周龄，体重20~25 g，从湖南斯莱克景达实验动物有限公司获得（生产许可证书号：2019-0004）。小鼠饲养于湖南师范大学医学院SPF级饲养房，许可证号：SYXK（湘）2020-0012，温度和相对湿度分别保持在21~25 ℃和45%~65%，昼夜周期各为12 h，饲养期间小鼠自主进食及饮水。进行实验前小鼠适应性喂养1周。本研究经湖南师范大学生物医学研究伦理委员会批准（审批号：2021-308）。
1.2 动物模型的建立
天然结晶SiO2颗粒（Min-U-Sil 5，97%<5 μm，美国Silica）置于研钵中研磨1 h后溶于无菌生理盐水中，配制成60 mg·mL−1 SiO2悬液，经高压灭菌后使用。根据Bru相关药理学研究[12–16]，确定以2 mg·kg−1作为中剂量。采用随机数表法，并根据动物实验剂量梯度设计原则，将30只小鼠分为对照组、矽尘组、Bru低剂量（1 mg·kg−1）组、Bru中剂量（2 mg·kg−1）组、Bru高剂量（4 mg·kg−1）组5组，每组6只，在实验第1天使用一次性非气管暴露法建立矽肺小鼠模型[17]。对照组：气管内滴注50 µL生理盐水；矽尘组：气管内滴注50 µL、60 mg·mL−1 SiO2悬浊液；Bru各剂量组：在气管内滴注SiO2悬浊液的同时，分别按1、2、4 mg·kg−1的剂量腹腔注射Bru（14907-95-3，使用高效液相色谱法测定药物的纯度≥98%，中国埃法生物）溶液200 µL，连续注射5 d，随后隔天注射。各组小鼠在滴注28 d后处死，收集肺组织。
1.3 肺系数的测定
麻醉小鼠后称量体重，处死小鼠后分离肺组织并称重。计算各组小鼠肺系数：肺系数（mg·g−1）=肺脏质量（mg）/体重（g）。
1.4 组织学检查
小鼠处死后，取左肺肺门处组织，采用4%的多聚甲醛溶液固定，经石蜡包埋后制成5 μm的切片。将切片进行苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin, HE）和Masson三染后，于光学显微镜（DM 4000B型，德国Leica）下观察，并使用Image J v1.8.0软件分析胶原着色的光密度值。在每个样本中选取3个不同区域进行评估，并取平均值。
1.5 Western blot检测肺组织相关蛋白的表达
取肺组织样本称重后匀浆并加入放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay, RIPA）裂解液（P0013B，中国碧云天）裂解1 h，12000 r·min−1，半径18.5 cm，4 ℃离心20 min，吸取上清蛋白并根据比辛可宁酸（bicinchoninic acid, BCA）蛋白定量试剂盒（P0010，中国碧云天）说明书进行BCA定量。随后，蛋白经变性、电泳、转膜，封闭，后于4 ℃温育Cleaved-caspase 3（1∶1000，AC033，中国碧云天）、Caspase 3（1∶1000，AF6311，中国亲科生物）、Ⅰ型胶原蛋白（collagenⅠ, Col-I）（1∶1000，AF7001，中国亲科生物）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）（1∶1000，A17910，中国爱博泰克）、Beclin1（1∶1000，AF5128，中国亲科生物）、p62（1∶1000，5114，美国CST）、微管相关蛋白1轻链β3（microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta, LC3B）（1∶1000，2775，美国CST）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase, GAPDH）（1∶3000，AF7021，中国亲科生物）、Nrf2（1∶1000，BF8017，中国亲科生物）、Keap1（1∶1000，A11484，中国爱博泰克）一抗过夜。次日蛋白条带经TBST洗涤后于室温下温育辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）标记的羊抗兔IgG（1∶4000，AS014，中国爱博泰克）或HRP标记的羊抗鼠IgG（1∶4000，AS003，中国爱博泰克）二抗1 h，再以TBST洗涤。使用增强型化学发光液（BL520A，中国白鲨生物）显影后，使用Image J v1.8.0软件对蛋白条带进行灰度值分析。以目的蛋白灰度值/内参蛋白GAPDH灰度值表示各目的蛋白的相对表达水平。
1.6 实时荧光定量PCR（realtime fluorescence-based quantitative PCR, RT-qPCR）检测肺组织相关mRNA的表达
取适量小鼠肺组织，使用TRIzol（R011-100，中国鼎国昌盛生物）法提取总RNA，并用核酸蛋白测定仪（Bio Photometer D30，德国Eppendorf）测定总RNA的浓度及纯度。根据Prime Script RT试剂盒（RK20429，中国爱博泰克）说明书进行逆转录，使用SYBR Green Master Mix试剂盒（RK21204，中国爱博泰克）进行RT-qPCR。以GAPDH作为内参基因，使用2−ΔΔCt方法计算各基因的相对表达量。引物名称及序列见表1。
表 1 引物名称及序列Table 1. Primer names and sequences引物名称 引物序列(5'-3') Caspase 3 正向：GCTGACTTCCTGTATGCTTACTC 反向：AATTCCGTTGCCACCTTCCT Col-I 正向：CAGTGGCGGTTATGACTTCAG 反向：GGCTGCGGATGTTCTCAATC α-SMA 正向：GAACACGGCATCATCACCAA 反向：ATCTCCAGAGTCCAGCACAATA GAPDH 正向：AATGGTGAAGGTCGGTGTGA 反向：CGCTCCTGGAAGATGGTGAT 1.7 统计学分析
采用GraphPad Prism 8.0软件进行数据统计分析。计量资料服从正态分布以均数±标准差（$ \bar x $±s）表示。各组组间比较采用单因素方差分析，组间均数两两比较方差齐时采用最小显著性差异法（least significant difference, LSD），方差不齐时采用Dunnett's T3检验。P<0.05则表示差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 不同浓度Bru对矽肺小鼠肺系数的影响
结果如表2所示，染尘28 d后，与对照组相比，矽尘组小鼠肺系数升高（P<0.01）；给予Bru干预后，Bru低、中剂量组小鼠肺系数下降（P<0.05），而Bru高剂量组与矽尘组相比差异无统计学意义（P>0.05）。
表 2 不同浓度Bru对矽肺小鼠肺系数的影响（$ \bar x $±s，n=6）Table 2. Effects of different concentrations of Bru on lung coefficient of silicosis mice ($ \bar x $±s , n=6)组别 肺系数/(mg·g−1) 对照组 5.27±0.26 矽尘组 7.40±0.47aa Bru低剂量组 6.45±0.43b Bru中剂量组 6.39±0.42b Bru高剂量组 6.73±0.56 [注] aa：与对照组相比，P<0.01；b：与矽尘组相比，P<0.05。 2.2 不同浓度Bru对矽肺小鼠肺组织病理的影响
HE染色结果如图1A所示，与对照组小鼠相比，矽尘组小鼠肺部结构损伤，肺泡壁受损，大量炎性细胞浸润，伴有纤维结节。Bru低、中剂量组小鼠肺组织炎性细胞浸润减少，病理损伤较矽尘组有明显改善，而Bru高剂量组小鼠肺组织病变与矽尘组相比未见明显改善。
![]()
图 1 各组小鼠肺组织病理变化的情况（n=6）A：HE染色；B：Masson染色；C：各组小鼠肺组织纤维化面积的百分比；向右箭头表示炎性细胞浸润，向下箭头表示肺泡结构受损，向左箭头表示胶原沉积，黑框表示放大部分；aa：与对照组相比，P<0.01；与矽尘组相比，b：P<0.05；bb：P<0.01。Figure 1. Histopathological changes of lung tissues of mice in each group (n=6)Masson染色结果如图1B、C所示，与对照组相比，暴露于SiO2的小鼠肺组织中可见大量胶原纤维沉积。Bru干预后，胶原纤维减少，Bru低、中剂量组与矽尘组相比差异具有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。
2.3 不同浓度Bru对矽肺小鼠肺组织细胞凋亡的影响
与对照组相比，矽尘组Cleaved-caspase 3的表达和转录水平均提高（P<0.01）；Bru干预后，Bru低、中剂量组Cleaved-caspase 3的水平下降（P<0.05，P<0.01），而Bru高剂量组与矽尘组之间Cleaved-caspase 3的表达差异无统计学意义（P>0.05）。见图2。
![]()
图 2 各组小鼠肺组织凋亡相关蛋白及mRNA表达的变化（n=6）A：蛋白电泳图；B：Cleaved-caspase 3蛋白相对表达量；C：Cleaved-caspase 3 mRNA相对表达量。aa：与对照组相比，P<0.01。与矽尘组相比，b：P<0.05；bb：P<0.01。Figure 2. Changes in apoptosis-related protein and mRNA expression in lung tissues of mice in each group (n=6)2.4 不同浓度Bru对矽肺小鼠肺组织纤维化相关蛋白及mRNA表达的影响
结果如图3所示，SiO2暴露引起小鼠肺组织Col-I和α-SMA蛋白水平升高（P<0.01），而Bru低、中剂量组蛋白水平下降（P<0.01），Bru高剂量组与矽尘组差异无统计学意义（P>0.05）。RT-qPCR检测Col-I和α-SMA的转录水平也得到相似的结果。
![]()
图 3 各组小鼠肺组织纤维化相关蛋白及mRNA表达的变化（n=6）A：蛋白电泳图；B：Col-I蛋白相对表达量；C：α-SMA蛋白相对表达量；D：Col-I mRNA相对表达量；E：α-SMA mRNA相对表达量。aa：与对照组相比，P<0.01；bb：与矽尘组相比，P<0.01。Figure 3. Changes in fibrosis-related protein and mRNA expression in lung tissues of mice in each group (n=6)2.5 不同浓度Bru对矽肺小鼠肺组织自噬的影响
结果如图4所示，相比于对照组，矽尘组自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ/I值和自噬底物蛋白p62的表达明显增加（P<0.05，P<0.01），而Bru低、中、高剂量组与矽尘组相比Beclin1、LC3-Ⅱ/I值下降（P<0.05，P<0.01）；Bru低、中剂量组p62表达水平明显降低（P<0.05，P<0.01），而Bru高剂量组与矽尘组相比p62蛋白的表达差异无统计学意义（P﹥0.05）。
![]()
图 4 各组小鼠肺组织p62、Beclin1和LC3蛋白表达的变化(n=6)A：蛋白电泳图；B：p62相对表达量；C：Beclin1相对表达量；D：LC3- Ⅱ相对LC3- Ⅰ的表达。与对照组相比，a：P<0.05；aa：P<0.01。与矽尘组相比，b：P<0.05；bb：P<0.01。Figure 4. Changes in protein expression of p62, Beclin1, and LC3 in lung tissues of mice in each group (n=6)2.6 不同浓度Bru对矽肺小鼠肺组织Nrf2、Keap1蛋白表达的影响
结果如图5所示，与对照组相比，矽尘组小鼠肺组织中Nrf2蛋白水平增加（P<0.05），Keap1蛋白水平减少（P<0.05）；而Bru干预后小鼠肺组织中Nrf2的蛋白水平下降，其中Bru高剂量组最低（P<0.01），Bru中、高剂量组Keap1蛋白水平增加（P<0.05，P<0.01）。
![]()
图 5 各组小鼠肺组织Nrf2、Keap1蛋白表达的变化（n=6）A：蛋白电泳图；B：Nrf2相对表达量；C：Keap1相对表达量。a：与对照组相比，P<0.05。与矽尘组相比，b：P<0.05；bb：P<0.01。Figure 5. Changes in protein expression of Nrf2 and Keap1 in lung tissues of mice in each group (n=6)3. 讨论
矽肺的发病机制复杂且未完全阐明，缺乏有效的治疗[18]。Bru是中药鸦胆子的重要成分之一，在矽肺中的作用未见报道。本研究通过建立不同浓度Bru多次干预的矽肺小鼠模型，发现低、中剂量Bru可显著降低矽肺小鼠的肺系数，抑制纤维化相关标志物Col-I和α-SMA的表达，改善矽肺小鼠肺组织的病理损伤，而高剂量Bru对上述指标的影响不明显，提示1、2 mg·kg−1 Bru具有抗矽肺纤维化的效应。
自噬是细胞维持内环境稳态的动态平衡过程，是矽肺纤维化发生、发展的重要机制之一。Beclin1和LC3是重要的自噬相关蛋白，介导自噬体的形成。LC3分为I型和Ⅱ型，在自噬过程中，胞质LC3-I经泛素化修饰转变为脂质化形式的LC3-Ⅱ，进而诱导自噬体的生长与闭合，因此LC3-Ⅱ/I可反映自噬体的变化[19]。p62是选择性自噬中的关键蛋白，与泛素化底物结合并转运至自噬溶酶体完成底物的降解。在自噬过程中p62蛋白的异常增高可提示p62绑定的泛素化蛋白聚集，即自噬降解功能受损[20]。本研究发现低、中剂量Bru干预的矽肺小鼠肺组织中Beclin1、LC3-Ⅱ/I和p62的蛋白表达下降，证明低、中剂量Bru可抑制矽肺小鼠肺组织的自噬活性，改善自噬降解障碍。凋亡是一种程序性细胞死亡，与自噬密切相关。研究证实，自噬失调引起的p62的积累促进细胞凋亡[21]。课题组前期的研究也发现阻碍自噬降解会加剧SiO2诱导的AMs凋亡[4]。Caspase 3是凋亡途径中关键的下游调控因子，当被激活后，活化型Caspase 3引发下游Caspase级联反应，以蛋白水解级联的方式切割细胞骨架和核蛋白，从而诱导细胞凋亡[22–23]。因此，活化型Caspase 3即Cleaved-caspase 3被视为凋亡事件的最终执行者，其相对于总Caspase 3的表达水平可代表细胞凋亡程度。本研究观察到低、中剂量Bru可显著抑制Cleaved-caspase 3的表达，提示低、中剂量Bru可能通过改善自噬降解障碍减轻SiO2触发的细胞凋亡。然而高剂量Bru对p62和Cleaved-caspase 3没有明显的抑制作用，提示高剂量Bru未改善自噬降解障碍和凋亡，这可能是高剂量Bru未发挥抗矽肺纤维化作用的原因之一。
Nrf2是一种重要的核转录因子，也是抗氧化防御系统的主要调节器[24]。正常情况下，Nrf2与Keap1结合定位于细胞质中，并通过泛素-蛋白酶体途径降解。在氧化刺激下，Nrf2与Keap1解离并进入细胞核，诱导抗氧化基因的转录，保护细胞免受内源性和外源性的氧化损伤[5]。研究证实Keap1-Nrf2通路、凋亡和自噬之间相互调节，在有害化学物质诱导的细胞毒性中，适度激活Nrf2具有抗凋亡作用[25]，而Nrf2的持续高表达加剧细胞凋亡[8，26–27]。此外，由自噬失调引起的p62积累可增强其与Keap1的结合，诱导Nrf2持续激活，进一步加剧细胞凋亡和自噬抑制[8]。Bru被广泛用作Nrf2的有效抑制剂[28]，因此本研究进一步检测了矽肺小鼠肺组织中Keap1-Nrf2的蛋白水平以探究Bru调控自噬是否与Keap1-Nrf2通路有关。本研究结果表明，SiO2暴露后小鼠肺组织中Nrf2水平增加，Keap1水平下降，提示SiO2激活Keap1-Nrf2通路。Bru则逆转了由SiO2引起的Nrf2和Keap1蛋白水平的变化，提示Bru可能通过Keap1-Nrf2通路调控自噬缓解矽肺纤维化。值得注意的是，Chen等[29]发现Nrf2缺陷小鼠抗氧化反应减弱，对镉暴露诱导的肾损伤更敏感，证实了过度抑制Nrf2可导致氧化还原失衡和组织损伤。本次实验结果显示Bru高剂量组Nrf2蛋白水平最低，推测在矽肺小鼠模型中高剂量Bru可能抑制了Nrf2对SiO2暴露的适应性激活，阻碍下游抗氧化反应的启动，导致细胞内活性氧积累加剧氧化损伤，从而治疗效果不明显。
本研究尚有以下局限性：没有定期监测小鼠的体重，未能探讨不同浓度Bru对小鼠体重增长的影响；在实验设计方面，没有设立Bru对照组，未探究Bru对小鼠生理状态的影响；在机制研究方面，尚需在细胞层面探究Bru的作用，进一步探讨高剂量Bru的效果，以及明确Bru抗矽肺纤维化的机制。
综上，低、中剂量（1、2 mg·kg−1）Bru可能通过Keap1-Nrf2通路调控自噬，改善自噬降解障碍，减轻细胞凋亡，延缓矽肺纤维化的进展。然而本次的实验结果也表明，相较于低、中剂量Bru，高剂量Bru没有表现出显著的治疗效果。因此，在未来的研究中需要注意Bru剂量的选择，并需要进一步确定Bru抗矽肺纤维化的确切机制，为矽肺的治疗提供更有效的策略。
-
![]()
图 1 各组小鼠肺组织病理变化的情况（n=6）
A：HE染色；B：Masson染色；C：各组小鼠肺组织纤维化面积的百分比；向右箭头表示炎性细胞浸润，向下箭头表示肺泡结构受损，向左箭头表示胶原沉积，黑框表示放大部分；aa：与对照组相比，P<0.01；与矽尘组相比，b：P<0.05；bb：P<0.01。
Figure 1. Histopathological changes of lung tissues of mice in each group (n=6)
![]()
图 2 各组小鼠肺组织凋亡相关蛋白及mRNA表达的变化（n=6）
A：蛋白电泳图；B：Cleaved-caspase 3蛋白相对表达量；C：Cleaved-caspase 3 mRNA相对表达量。aa：与对照组相比，P<0.01。与矽尘组相比，b：P<0.05；bb：P<0.01。
Figure 2. Changes in apoptosis-related protein and mRNA expression in lung tissues of mice in each group (n=6)
![]()
图 3 各组小鼠肺组织纤维化相关蛋白及mRNA表达的变化（n=6）
A：蛋白电泳图；B：Col-I蛋白相对表达量；C：α-SMA蛋白相对表达量；D：Col-I mRNA相对表达量；E：α-SMA mRNA相对表达量。aa：与对照组相比，P<0.01；bb：与矽尘组相比，P<0.01。
Figure 3. Changes in fibrosis-related protein and mRNA expression in lung tissues of mice in each group (n=6)
![]()
图 4 各组小鼠肺组织p62、Beclin1和LC3蛋白表达的变化(n=6)
A：蛋白电泳图；B：p62相对表达量；C：Beclin1相对表达量；D：LC3- Ⅱ相对LC3- Ⅰ的表达。与对照组相比，a：P<0.05；aa：P<0.01。与矽尘组相比，b：P<0.05；bb：P<0.01。
Figure 4. Changes in protein expression of p62, Beclin1, and LC3 in lung tissues of mice in each group (n=6)
![]()
图 5 各组小鼠肺组织Nrf2、Keap1蛋白表达的变化（n=6）
A：蛋白电泳图；B：Nrf2相对表达量；C：Keap1相对表达量。a：与对照组相比，P<0.05。与矽尘组相比，b：P<0.05；bb：P<0.01。
Figure 5. Changes in protein expression of Nrf2 and Keap1 in lung tissues of mice in each group (n=6)
表 1 引物名称及序列
Table 1 Primer names and sequences
引物名称 引物序列(5'-3') Caspase 3 正向：GCTGACTTCCTGTATGCTTACTC 反向：AATTCCGTTGCCACCTTCCT Col-I 正向：CAGTGGCGGTTATGACTTCAG 反向：GGCTGCGGATGTTCTCAATC α-SMA 正向：GAACACGGCATCATCACCAA 反向：ATCTCCAGAGTCCAGCACAATA GAPDH 正向：AATGGTGAAGGTCGGTGTGA 反向：CGCTCCTGGAAGATGGTGAT 
下载: 导出CSV
表 2 不同浓度Bru对矽肺小鼠肺系数的影响（$ \bar x $±s，n=6）
Table 2 Effects of different concentrations of Bru on lung coefficient of silicosis mice ($ \bar x $±s , n=6)
组别 肺系数/(mg·g−1) 对照组 5.27±0.26 矽尘组 7.40±0.47aa Bru低剂量组 6.45±0.43b Bru中剂量组 6.39±0.42b Bru高剂量组 6.73±0.56 [注] aa：与对照组相比，P<0.01；b：与矽尘组相比，P<0.05。
下载: 导出CSV
-
[1] LIU X, JIANG Q, WU P, et al. Global incidence, prevalence and disease burden of silicosis: 30 years' overview and forecasted trends[J]. BMC Public Health, 2023, 23(1): 1366. doi: 10.1186/s12889-023-16295-2
[2] GLICK D, BARTH S, MACLEOD K F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms[J]. J Pathol, 2010, 221(1): 3-12. doi: 10.1002/path.2697
[3] CHEN S, YUAN J, YAO S, et al. Lipopolysaccharides may aggravate apoptosis through accumulation of autophagosomes in alveolar macrophages of human silicosis[J]. Autophagy, 2015, 11(12): 2346-2357. doi: 10.1080/15548627.2015.1109765
[4] HE X, CHEN S, LI C, et al. Trehalose alleviates crystalline silica-induced pulmonary fibrosis via activation of the TFEB-mediated autophagy-lysosomal system in alveolar macrophages[J]. Cells, 2020, 9(1): 122. doi: 10.3390/cells9010122
[5] JIANG T, HARDER B, DE LA VEGA M R, et al. p62 links autophagy and Nrf2 signaling[J]. Free Radic Biol Med, 2015, 88: 199-204. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2015.06.014
[6] JARAMILLO M C, ZHANG D D. The emerging role of the Nrf2-Keap1 signaling pathway in cancer[J]. Genes Dev, 2013, 27(20): 2179-2191. doi: 10.1101/gad.225680.113
[7] DE LA VEGA M R, DODSON M, GROSS C, et al. Role of Nrf2 and autophagy in acute lung lnjury[J]. Curr Pharmacol Rep, 2016, 2(2): 91-101. doi: 10.1007/s40495-016-0053-2
[8] LIAN C Y, CHU B X, XIA W H, et al. Persistent activation of Nrf2 in a p62-dependent non-canonical manner aggravates lead-induced kidney injury by promoting apoptosis and inhibiting autophagy[J]. J Adv Res, 2023, 46: 87-100. doi: 10.1016/j.jare.2022.04.016
[9] ZHAO Y, XU G, LI H, et al. Genome-wide mRNA profiling identifies the Nrf2-regulated lymphocyte oxidative stress status in patients with silicosis[J]. J Occup Med Toxicol, 2021, 16(1): 40. doi: 10.1186/s12995-021-00332-0
[10] YU X Q, SHANG X Y, HUANG X X, et al. Brusatol: A potential anti-tumor quassinoid from Brucea javanica[J]. Chin Herb Med, 2020, 12(4): 359-366.
[11] FENG L, LI J, YANG L, et al. Tamoxifen activates Nrf2-dependent SQSTM1 transcription to promote endometrial hyperplasia[J]. Theranostics, 2017, 7(7): 1890-1900. doi: 10.7150/thno.19135
[12] REN D, VILLENEUVE N F, JIANG T, et al. Brusatol enhances the efficacy of chemotherapy by inhibiting the Nrf2-mediated defense mechanism[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108(4): 1433-1438. doi: 10.1073/pnas.1014275108
[13] YANG Y, TIAN Z, GUO R, et al. Nrf2 inhibitor, Brusatol in combination with trastuzumab exerts synergistic antitumor activity in HER2-positive cancers by inhibiting Nrf2/HO-1 and HER2-AKT/ERK1/2 pathways[J]. Oxid Med Cell Longev, 2020, 2020: 9867595.
[14] YE R, DAI N, HE Q, et al. Comprehensive anti-tumor effect of Brusatol through inhibition of cell viability and promotion of apoptosis caused by autophagy via the PI3K/Akt/mTOR pathway in hepatocellular carcinoma[J]. Biomed Pharmacother, 2018, 105: 962-973. doi: 10.1016/j.biopha.2018.06.065
[15] OH E T, KIM C W, KIM H G, et al. Brusatol-mediated inhibition of c-Myc increases HIF-1α degradation and causes cell death in colorectal cancer under hypoxia[J]. Theranostics, 2017, 7(14): 3415-3431. doi: 10.7150/thno.20861
[16] 杨星. 鸦胆子苦醇对TNF-α诱导的HaCaT细胞与银屑病样小鼠的作用及机制研究[D]. 重庆: 重庆大学, 2020. YANG X. Effect and mechanism study of brusatol in TNF-α-induced HaCaT cells and psoriasis-like mice[D]. Chongqing: Chongqing University, 2020.
[17] TAN S, YANG S, KANG H, et al. Atractylenolide ⅡI ameliorated autophagy dysfunction via epidermal growth factor receptor-mammalian target of rapamycin signals and alleviated silicosis fibrosis in mice[J]. Lab Invest, 2023, 103(2): 100024. doi: 10.1016/j.labinv.2022.100024
[18] HANDRA C M, GURZU I L, CHIRILA M, et al. Silicosis: new challenges from an old inflammatory and fibrotic disease[J]. Front Biosci (Landmark Ed), 2023, 28(5): 96. doi: 10.31083/j.fbl2805096
[19] TANIDA I, UENO T, KOMINAMI E. LC3 and autophagy[M]//DERETIC V. Autophagosome and Phagosome. Totowa: Humana Press, 2008: 77-88.
[20] ZAFFAGNINI G, SAVOVA A, DANIELI A, et al. p62 filaments capture and present ubiquitinated cargos for autophagy[J]. EMBO J, 2018, 37(5): e98308. doi: 10.15252/embj.201798308
[21] ZHU F, LI X, TANG X, et al. Neferine promotes the apoptosis of HNSCC through the accumulation of p62/SQSTM1 caused by autophagic flux inhibition[J]. Int J Mol Med, 2021, 48(1): 124. doi: 10.3892/ijmm.2021.4957
[22] TAN S, CHEN S. The mechanism and effect of autophagy, apoptosis, and pyroptosis on the progression of silicosis[J]. Int J Mol Sci, 2021, 22(15): 8110. doi: 10.3390/ijms22158110
[23] NAGATA S. Apoptosis and clearance of apoptotic cells[J]. Annu Rev Immunol, 2018, 36: 489-517. doi: 10.1146/annurev-immunol-042617-053010
[24] BARTOLINI D, DALLAGLIO K, TORQUATO P, et al. Nrf2-p62 autophagy pathway and its response to oxidative stress in hepatocellular carcinoma[J]. Transl Res, 2018, 193: 54-71. doi: 10.1016/j.trsl.2017.11.007
[25] LI Z, ZHU J, WAN Z, et al. Theaflavin ameliorates renal ischemia/reperfusion injury by activating the Nrf2 signalling pathway in vivo and in vitro[J]. Biomed Pharmacother, 2021, 134: 111097. doi: 10.1016/j.biopha.2020.111097
[26] HOSEINRAD H, SHAHRESTANAKI J K, MOGHADDAM M M, et al. Protective effect of vitamin D3 against Pb-induced neurotoxicity by regulating the Nrf2 and NF-κB pathways[J]. Neurotox Res, 2021, 39(3): 687-696. doi: 10.1007/s12640-020-00322-w
[27] KONG Q, DENG H, LI C, et al. Sustained high expression of NRF2 and its target genes induces dysregulation of cellular proliferation and apoptosis is associated with arsenite-induced malignant transformation of human bronchial epithelial cells[J]. Sci Total Environ, 2021, 756: 143840. doi: 10.1016/j.scitotenv.2020.143840
[28] CAI S J, LIU Y, HAN S, et al. Brusatol, an Nrf2 inhibitor for future cancer therapeutic[J]. Cell Biosci, 2019, 9: 45. doi: 10.1186/s13578-019-0309-8
[29] CHEN C, HAN X, WANG G, et al. Nrf2 deficiency aggravates the kidney injury induced by subacute cadmium exposure in mice[J]. Arch Toxicol, 2021, 95(3): 883-893. doi: 10.1007/s00204-020-02964-3
计量
- 文章访问数: 125
- HTML全文浏览量: 12
- PDF下载量: 34
