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摘要:背景
氯菊酯是一种常用的拟除虫菊酯类杀虫剂，研究发现其具有潜在神经系统毒性。小胶质细胞是中枢神经系统中的天然免疫细胞，参与一系列神经退行性疾病的发生。
目的本研究观察氯菊酯在体外对人小胶质细胞HMC3的毒性效应，并探讨其机制。
方法使用0、10、25、55 μmol·L−1的氯菊酯染毒HMC3 72 h后，使用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡，实时荧光定量PCR（qPCR）检测细胞周期蛋白依赖性激酶1基因（
CDK1 ）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1A基因（CDKN1A ）、细胞周期蛋白B2基因（CCNB2 ）、肿瘤蛋白p53基因（p53 ）、凋亡相关因子基因（FAS ）、胱天蛋白酶3基因（CASP3 ）和H2A变体组蛋白基因（H2AX ）的表达。转录组测序（RNA-seq）检测0、25 μmol·L−1氯菊酯染毒后HMC3的差异基因和富集通路。再次使用0、10、25、55 μmol·L−1的氯菊酯染毒HMC3 72 h后，使用格里斯试剂法检测上清中一氧化氮（NO）含量，酶联免疫吸附法检测白细胞介素（IL）-6的分泌水平，qPCR检测丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路（包括MAPK1 、MAPK8 、MAPK14 ）、IL-1 β 、IL-6 和基质金属蛋白酶（MMP）家族（包括MMP1 、MMP2 、MMP3 和MMP9 ）的mRNA表达情况，蛋白质印记法（Western blot）检测磷酸化p38（p-p38）、磷酸化细胞外信号调节激酶（p-ERK）、IL-1β、IL-6和MMP1蛋白表达情况。结果0、10、25、55 μmol·L−1氯菊酯染毒细胞后，HMC3在G2/M期阻滞，其中55 μmol·L−1氯菊酯染毒组与对照组差异有统计学意义（
P <0.01），qPCR结果显示CDKN1A mRNA表达较对照组上调（P <0.05）。各组细胞凋亡比例差异无统计学意义（P ＞0.05）。RNA-seq结果提示差异基因富集于MAPK通路。qPCR结果提示55 μmol·L−1染毒组MAPK1 、MAPK8 和MAPK14 的mRNA表达较对照组上调（P <0.05）。Western blot发现，与对照组相比，10 μmol·L−1氯菊酯染毒组的p-p38和p-ERK水平均升高（P ＜0.05），25 μmol·L−1氯菊酯染毒组的p-ERK水平升高（P ＜0.05），55 μmol·L−1氯菊酯染毒组的p-p38水平升高（P ＜0.05）。与对照组相比，染毒后的HMC3上清液中NO分泌量增加（P <0.05），IL-6的mRNA、蛋白表达和分泌量呈上升趋势，IL-1β的mRNA和蛋白表达上调（P <0.05），25、55 μmol·L−1组MMP1的mRNA和蛋白表达上调（P <0.05）。结论氯菊酯在体外抑制HMC3细胞增殖，诱导细胞周期阻滞，可激活MAPK通路，促进炎症因子IL-1β以及MMP1表达，可能是氯菊酯致人神经毒性的机制之一。
Abstract:BackgroundPermethrin is a commonly used pyrethroid insecticide and has been found to be potentially neurotoxic. Microglia are innate immune cells in the central nervous system and are involved in the development of a range of neurodegenerative diseases.
ObjectiveTo observe possible toxic effects of permethrin on human microglia clone 3 (HMC3)
in vitro and explore associated mechanism.MethodsHMC3 were treated with 0, 10, 25, and 55 μmol·L−1 permethrin for 72 h. Cell cycle and apoptosis were measured using flow cytometry. Cyclin-dependent kinase 1 (
CDK1 ), cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (CDKN1A ), cyclin B2 (CCNB2 ), cellular tumor antigen p53 (p53 ), factor-related apoptosis (FAS ), caspase 3 (CASP3 ), and H2A histone family member X (H2AX ) were detected by quantitative real-time PCR (qPCR). The differential genes and enrichment pathways of HMC3 after 0 and 25 μmol·L−1 permethrin treatment was analyzed by RNA sequencing. HMC3 was treated by 0, 10, 25, and 55 μmol· L−1 permethrin for 72 h. The content of nitric oxide (NO) in the supernatant was detected using Griess reagent. The secretion level of interleukin-6 (IL-6) was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The mRNA expression levels of mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway (includingMAPK1 ,MAPK8 , andMAPK14 ), interleukin-1β (IL-1 β ),IL-6 , and matrix metalloproteinase (MMP) families (includingMMP1 ,MMP2 ,MMP3 , andMMP9 ) were detected by qPCR. The protein expressions of phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase (p-p38), phosphorylated extracellular signal-regulated kinase (p-ERK), IL-1β, IL-6, and MMP1 were detected by Western blot.ResultsHMC3 was arrested in G2/M phase after 0, 10, 25, and 55 μmol·L−1 permethrin treatment for 72 h, of which there was a statistically significant difference between the 55 μmol·L−1 permethrin treatment group and the control group (
P <0.01), and the mRNA expression ofCDKN1A was up-regulated according to the qPCR (P <0.05). There was no statistically significant difference in the proportions of apoptosis between the groups (P ＞0.05). The RNA sequencing showed that the differential genes were enriched in the MAPK pathway, and the mRNA expressions ofMAPK1 ,MAPK8 , andMAPK14 were up-regulated after the permethrin treatment at 55 μmol·L−1 compared to the control group by qPCR (P <0.05). The Western blot revealed that, compared to the control group, the levels of p-p38 and p-ERK were increased after the 10 μmol·L−1 permetrin treatment (P <0.05), the p-ERK level was increased after the 25 μmol·L−1 permetrin treatment (P <0.05), and the p-p38 level was up-regulated after the 55 μmol·L−1 permetrin treatment (P <0.05). The secretion of NO in the supernatant of HMC3 increased after permetrin treatment compared to the control group (P <0.05), the mRNA and protein expressions and the secretion of IL-6 showed an upward trend, the mRNA and protein expressions of IL-1β were up-regulated (P <0.05), and the mRNA and protein expressions of MMP1 were up-regulated in the 25 and 55 μmol·L−1 permethrin groups (P <0.05).ConclusionPermethrin inhibits HMC3 cell proliferation
in vitro , induces cell cycle arrest, activates MAPK pathway, and promotes the expression of inflammatory factors IL-1β and MMP1, which may be one of the mechanism of neurotoxicity induced by permethrin. -
氯菊酯是一种Ⅰ型拟除虫菊酯类杀虫剂，通过干扰钠通道、钙通道和氯通道导致靶标昆虫的死亡[1]，被广泛应用于杀灭各种害虫，还可用于治疗皮肤疥疮[2]。氯菊酯也是常用的驱避剂，可用于浸泡衣物以及制作功能性防虫纺织材料等，减少害虫的侵害[3]。然而，氯菊酯长期大量使用导致土壤、地表水、农作物等残留量增加，影响植物、鱼类、水生昆虫以及其他非靶标生物的生长[4–5]，也导致人体暴露水平和途径增加。目前，越来越多的研究报道氯菊酯对哺乳动物神经系统有潜在慢性毒性[6–8]。
氯菊酯是脂溶性化合物，可以通过血脑屏障进入中枢神经系统，且有证据表明，氯菊酯会损伤血脑屏障[9]。研究发现，氯菊酯对大鼠有发育毒性和神经毒性，表现为运动、学习和记忆障碍，其发生的机制包括诱导氧化应激、线粒体功能障碍、神经发生减少和炎症反应等[10–11]。哺乳期（出生后第6—第21天）接触氯菊酯的大鼠在成年后期出现了神经退行性病变，其机制为氯菊酯通过诱导纹状体DNA损伤、减少Nurr1基因表达，降低纹状体多巴胺水平，并抑制电子传输链的线粒体复合物I，从而诱导多巴胺能神经元退化[11–13]。也有人群研究提示，氯菊酯慢性暴露可使患帕金森病的风险升高[14]。
小胶质细胞是中枢神经系统中的天然免疫细胞，在神经退行性疾病中起重要作用[15–16]。研究报道Ⅱ型拟除虫菊酯类杀虫剂——氯氰菊酯暴露会引起小胶质细胞活化，诱导型一氧化氮合酶和白细胞介素（interleukin, IL）-1β等促炎蛋白过表达，以及丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）通路相关基因表达上调，从而诱导纹状体多巴胺能神经元的退化[17–18]。氯菊酯作为I型拟除虫菊酯类杀虫剂，与Ⅱ型拟除虫菊酯类杀虫剂分子结构有一定差别。虽然实验研究显示氯菊酯可作用于小胶质细胞的电压门控钠通道，导致细胞内Na+的过度积累，引起小胶质细胞激活[19]。然而，鲜有研究报道氯菊酯对小胶质细胞是否有毒性效应，这阻碍了氯菊酯神经毒性效应机制的阐明。因此，本研究以人小胶质细胞HMC3为研究对象，观察氯菊酯染毒后的细胞存活率、细胞周期、细胞凋亡的变化情况；并根据转录组测序结果，检测MAPK通路及下游基因相关RNA及蛋白表达，探讨氯菊酯对小胶质细胞的毒性效应及潜在机制。
1. 材料与方法
1.1 实验设计
根据研究报道[19]和前期预实验结果，选择0、10、20、30、40、50、60、70、80、100 μmol·L−1的氯菊酯染毒HMC3 72 h，筛选细胞存活率为100%、90%、75%和50%的浓度，即0、10、25、55 μmol·L−1作为后续研究氯菊酯对HMC3毒性效应的实验浓度。另外，25 μmol·L−1远低于半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration, IC50），并且前期实验已观察到25 μmol·L−1氯菊酯染毒HMC3后，可抑制增殖，诱导细胞周期阻滞，最终选择0 μmol·L−1和25 μmol·L−1染毒组进行转录组测序，分析氯菊酯对小胶质细胞的毒性分子效应机制。
1.2 细胞培养与染毒
人小胶质细胞HMC3细胞株购自武汉普诺赛生命科技有限公司，生长培养基为最低必需培养基，加10%胎牛血清、100 U·mL−1青霉素、100 μg·mL−1链霉素，细胞复苏后接种至25 cm2细胞培养瓶，37 ℃、5% CO2恒温湿化培养箱培养。细胞生长至80%~90%时，经0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸消化液（江苏凯基）消化后，按照1∶3传代比例进行传代，细胞隔天换液以保持生长。细胞复苏后第3代开始实验，并在9次传代内使用，取对数生长期细胞进行实验，根据实验需要调节细胞密度制成细胞悬液接种至不同的培养板。
将氯菊酯（纯度˃98%，天津阿尔塔）溶于二甲基亚砜（美国Sigma），配制成40 mmol·L−1母液，分装冻存于−20 ℃，1个月内使用。
1.3 CCK8法检测细胞存活率
HMC3以3500个·孔−1接种于96孔板，每孔加入100 μL细胞悬液，培养24 h后进行氯菊酯染毒。将氯菊酯母液加入培养液，配制终浓度为0、10、20、30、40、50、60、70、80、100 μmol·L−1的含氯菊酯培养液（含0.25%二甲基亚砜）。每组设置5个重复孔，培养一定时间后，避光条件下每孔加入10 μL的CCK8试剂（中国诺唯赞），避光孵育1.5~2 h，待溶液变色后使用酶标仪检测450 nm处光密度。
1.4 流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡
HMC3以7.5×104个·mL−1接种于6孔板，每孔加入2 mL细胞悬液，培养24 h后，使用0、10、25、55 μmol·L−1氯菊酯染毒72 h，去除细胞培养液，加入1 mL磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline, PBS；中国凯基）清洗细胞，胰酶消化收集细胞。
在细胞沉淀中缓慢加入1 mL −20 ℃预冷的75%乙醇，4 ℃固定过夜，次日检测细胞周期。具体方法如下：每管细胞加入100 μL PBS重悬，再加入2 μL浓度为10 mg·mL−1 的核糖核酸酶A（去离子水配制），37 ℃水浴30 min。加入100 μL浓度为10 μg·mL−1的碘化丙啶（propidium iodide, PI）染色液（中国Servicebio）避光染色10 min。使用流式细胞仪（美国Beckman）激发波长488 nm，发射波长（585±21）nm进行检测，用Modfit软件分析细胞周期。
细胞凋亡检测方法如下：加入200 μL不含乙二胺四乙酸的胰酶（中国达优）消化并收集细胞。加入1 mL PBS清洗细胞2次。使用膜联蛋⽩V（Annexin V） -活化蛋⽩C（activated protein C, APC）/PI凋亡试剂盒（中国达科为）进行检测，即在沉淀中加入500 μL的Annexin V 结合缓冲液重悬细胞，取100 μL于新的离心管中，加入5 μL的APC-Annexin V，加入10 μL PI，轻轻涡旋细胞，室温避光孵育15 min。加入400 μL Annexin V结合缓冲液后混匀，使用流式细胞仪进行分析。使用CytExpert 2.4检测并分析细胞凋亡。
1.5 Trizol 法抽提细胞总RNA
HMC3以7.5×104个·mL−1接种于6孔板，每孔加入2 mL细胞悬液，培养24 h后氯菊酯染毒。72 h后，去除细胞培养液，加入1 mL Trizol（美国Thermo Fisher Scientific）将细胞裂解液转移至1.5 mL离心管中，室温放置15 min后，加入200 μL预冷的氯仿，上下颠倒混匀15次，室温静置15 min，离心15 min（13523×g，4 ℃）；取上层水相500 μL于新的1.5 mL离心管中，加入等体积的预冷异丙醇，上下颠倒混匀15次，室温静置15 min，离心10 min（13523×g，4 ℃）；弃去上清，在沉淀中加入1 mL预冷的75%酒精，吹打混匀后离心5 min（5283×g，4 ℃），弃去上清，室温条件下开盖放置10 min，加入焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate, DEPC）水后，使用NanoDrop One（美国Thermo Fisher Scientific）测量RNA浓度和纯度。
1.6 转录组测序（RNA sequencing, RNA-seq）检测差异基因富集通路
HMC3以7.5×104个·mL−1接种于6孔板，每孔加入2 mL细胞悬液，培养24 h后使用0 μmol·L−1和25 μmol·L−1氯菊酯染毒细胞72 h，去除细胞培养液，使用Trizol法提取2组样品的总RNA，每组3个平行样，逆转录为互补脱氧核糖核酸（complementary DNA, cDNA），通过PCR技术生成测序文库，质控合格后，使用Illumina NovaSeq 6000（上海派森诺）进行测序及比对。通过京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）法分析0 μmol·L−1与25 μmol·L−1氯菊酯染毒组的差异通路富集情况。
1.7 逆转录PCR与实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）检测基因mRNA相对表达水平
根据制造商说明，使用第3代全长cDNA一链合成试剂盒（去基因组）（中国诺唯赞）将抽提的RNA逆转录合成cDNA。使用2×通用型高灵敏度染料法定量PCR 检测试剂盒（中国诺唯赞），在实时荧光定量PCR仪（瑞士罗氏）上进行扩增反应。扩增条件：95 ℃ 5 min预变性；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s共45个循环进行扩增。反应结束后，由仪器软件自动计算荧光曲线和循环阈值（cycle threshold, Ct）。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）基因（GAPDH）作为内参基因，检测细胞周期蛋白依赖性激酶1（cyclin-dependent kinase 1, CDK1）基因（CDK1）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1A（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A, CDKN1A）基因（CDKN1A）、细胞周期蛋白B2（cyclin B2, CCNB2）基因（CCNB2）、肿瘤蛋白p53基因（p53）、凋亡相关因子（factor-related apoptosis, FAS）基因（FAS）、胱天蛋白酶3（caspase3, CASP3）基因（CASP3）和H2A变体组蛋白（H2A histone family member X, H2AX）基因（H2AX）、MAPK1、MAPK8、MAPK14、IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-6和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）基因（MMP1、MMP2、MMP3、MMP9）的表达（MMP1、MMP2、MMP3和MMP9是MAPK通路下游与炎症发生相关的基因[20–22]）。ΔCt=样品Ct均值-内参Ct均值，ΔΔCt=实验组ΔCt均值-对照组ΔCt均值，2−ΔΔCt即代表各实验组检测基因mRNA的相对含量。引物名称和序列见表1。
表 1 引物序列Table 1. Primer sequences基因名称
(Genes)正向(Forward)
5′→ 3′反向(Reverse)
5′→ 3′GAPDH GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG CDK1 AAACTACAGGTCAAGTGGTAGCC TCCTGCATAAGCACATCCTGA CDKN1A TGTCCGTCAGAACCCATGC AAAGTCGAAGTTCCATCGCTC CCNB2 CCGACGGTGTCCAGTGATTT TGTTGTTTTGGTGGGTTGAACT p53 GGCGTAAACGCTTCGAGATG CTTCAGGTAGCTGGAGTGAGC FAS AGATTGTGTGATGAAGGACATGG TGTTGCTGGTGAGTGTGCATT CASP3 CATGGAAGCGAATCAATGGACT CTGTACCAGACCGAGATGTCA H2AX CTGTACCAGACCGAGATGTCA TGTGCCTGTTACCAAGTGCT MAPK1 TACACCAACCTCTCGTACATCG CATGTCTGAAGCGCAGTAAGATT MAPK8 TACAGAGCACCCGAGGTCAT TCTCCCATGATGCACCCAAC MAPK14 TCAGTCCATCATTCATGCGAAA AACGTCCAACAGACCAATCAC IL-1α AGATGCCTGAGATACCCAAAACC CCAAGCACACCCAGTAGTCT IL-1β ATGATGGCTTATTACAGTGGCAA GTCGGAGATTCGTAGCTGGA IL-4 CGGCAACTTTGTCCACGGA TCTGTTACGGTCAACTCGGTG IL-6 ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG MMP1 AAAATTACACGCCAGATTTGCC GGTGTGACATTACTCCAGAGTTG MMP2 CGCTACGATGGAGGCGCTAA AGAAGGTGTTCAGGTATTGCACTG MMP3 CTGGACTCCGACACTCTGGA CAGGAAAGGTTCTGAAGTGACC MMP9 GGCAGCTGGCAGAGGAATAC GGCCCCAGAGATTTCGACTC 1.8 蛋白质印记（Western blot）检测蛋白相对表达水平
经氯菊酯染毒后，去除HMC3培养液，使用预冷的PBS清洗3次。加入放射免疫沉淀法裂解液（内含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂；1∶50；中国碧云天）裂解细胞，用细胞刮片收集细胞及裂解液，冰上裂解30 min，离心15 min（13523×g，4 ℃），收集上清，使用二喹啉甲酸法（中国碧云天）检测蛋白质浓度，调整蛋白上样体积为10 μL（25 μg），蛋白质样品中加入5×十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate, SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacryamide gel electrophoresis, PAGE）上样缓冲液（中国雅酶），100 ℃水浴锅中变性10 min。使用4%~12%的SDS-PAGE电泳（电泳条件60 V，1.5 h），每孔上样25 μg蛋白样品，电泳结束后转移到聚偏氟乙烯（美国Millipore）膜上（200 mA，1.5 h，4 ℃）。使用封闭液（中国碧云天）室温条件下封闭45 min或4 ℃过夜。使用GAPDH小鼠单克隆抗体（中国碧云天）、重组Anti-IL-6抗体（英国Abcam）、重组Anti-IL-1β抗体（英国Abcam）和Anti-MMP1抗体（英国Abcam）、p38单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology）、p44/42（ERK）单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology）、磷酸化p38单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology）、磷酸化p44/42（ERK1/2）单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology），抗体稀释比例均为1∶1000，4 ℃孵育过夜，Western洗涤液（中国碧云天）清洗3次，每次10 min。根据一抗的种属属性，选择对应的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)（中国碧云天；1∶1000稀释）室温孵育1 h，Western洗涤液清洗3次，每次10 min。使用增强化学发光（enhanced chemiluminescence, ECL）显色液（中国碧云天），在ChemiScope系列荧光及化学发光成像系统（上海勤翔）上曝光、记录和保存结果。使用Image J（v 1.46r）分析目的蛋白条带灰度值，以GAPDH作为内参蛋白，结果以目的蛋白灰度值/内参灰度值表示。
1.9 格里斯试剂法检测一氧化氮（nitric oxide, NO）
氯菊酯染毒后，使用NO检测试剂盒（中国碧云天）进行检测，即取细胞上清，352×g离心5 min，取上清50 μL于96孔板中，在各孔中加入50 μL室温格里斯试剂I，加入50 μL室温格里斯试剂II，使用酶标仪540 nm测定光密度。
1.10 酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测细胞因子水平
氯菊酯染毒后，取细胞培养上清液845×g离心5 min，收集上清液。应用ELISA双抗体夹心法测定细胞因子水平，具体操作按照人IL-6 ELISA试剂盒（中国碧云天）说明书进行，使用酶标仪450 nm测定光密度。
1.11 数据处理与分析
使用Microsoft Excel 2021及GraphPad Prism 9统计软件对数据进行处理比较，数据用$\bar {x}\pm s$表示，组间数据对比采用ANOVA检测和Tukey多重比较，P<0.05为差异具有统计学意义。将数据通过Graphpad Prism 9绘图软件制作成直方图的形式表现实验结果之间的差异。
2. 结果
2.1 氯菊酯对小胶质细胞存活率的影响
氯菊酯0~60 μmol·L−1染毒HMC3 72 h后，细胞存活率呈浓度依赖性降低（y=−0.8984x+99.916，R2=0.9887），IC50为55.22 μmol·L−1，而70、80、100 μmol·L−1氯菊酯染毒后细胞存活率无明显变化（图1）。根据CCK8结果，选择细胞存活率为100%、90%、75%、50%左右的浓度，即0、10、25、55 μmol·L−1为后续实验浓度。
2.2 氯菊酯诱导小胶质细胞G2/M期阻滞
流式细胞术检测HMC3细胞周期，结果显示，0、10、25、55 μmol·L−1氯菊酯染毒72 h后，HMC3在G2/M期的比例分别是（7.28±1.23）%、（7.46±1.68）%、（10.57±2.54）%、（18.94±0.94）%。随着染毒浓度的增加，G2/M期细胞比例逐渐增大，其中，55 μmol·L−1染毒组与对照组差异有统计学意义（P<0.01）（图2A、2B）。检测与G2/M期阻滞相关的基因CDK1、CDKN1A和CCNB2的表达情况，结果提示CDKN1A的mRNA表达上调（P<0.05），CDK1和CCNB2 mRNA表达呈下调趋势，但差异未见统计学意义（图2C）。
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图 2 氯菊酯对HMC3细胞周期及相关基因表达的影响A：流式细胞仪检测氯菊酯染毒72 h后的HMC3细胞周期；B：各周期细胞比例定量；C：细胞周期相关基因表达情况。*：P<0.05；**：P<0.01； ****：P<0.0001。Figure 2. Cell cycle and related-gene expressions of HMC3 after 72 h permethrin treatmentA: HMC3 cell cycle after 72 h permethrin treatment by flow cytometry. B: Quantification of cell proportions in each cycle. C: Cell cycle-related gene expression. *: P<0.05; **: P<0.01; ****: P<0.0001.2.3 氯菊酯对小胶质细胞细胞凋亡的影响
流式细胞术检测HMC3细胞凋亡，结果显示，0、10、25、55 μmol·L−1氯菊酯染毒后，细胞凋亡比例无明显变化（P＞0.05）（图3A、3B）。p53、FAS、CASP3和H2AX的mRNA表达检测显示，各组之间各基因表达差异无统计学意义（结果见补充材料图S1）。
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图 3 氯菊酯对HMC3细胞凋亡影响A：使用流式细胞仪检测不同氯菊酯染毒72 h后，HMC3细胞凋亡情况；B：流式细胞凋亡定量图。Figure 3. Effects of permethrin on apoptosis in HMC3A: Apoptosis of HMC3 after 72 h permethrin treatment by flow cytometry. B: Quantitative apoptosis ratio.2.4 氯菊酯激活HMC3 MAPK通路
RNA-seq以基因为单位进行统计，对原始数据进行整理、过滤、质控等筛选后，纳入16159个基因进行后续研究。将log2(FC)（fold change，差异倍数）大于1且P值小于0.05，定义为上调基因；log2(FC)小于−1且P值小于0.05定义为下调基因。RNA-seq共检测出1332个下调基因和1321个上调基因（结果见补充材料图S2）。对所有差异基因进行KEGG通路富集分析，结果发现，25 μmol·L−1氯菊酯染毒组与对照组相比，差异基因主要富集的通路中包括MAPK信号通路（结果见补充材料图S3）。
因此，进一步检测了MAPK通路中相关基因的RNA和蛋白表达情况，发现HMC3经过0、10、25、55 μmol·L−1氯菊酯染毒72 h后，55 μmol·L−1组MAPK1、MAPK8和MAPK14的mRNA表达上调，与转录组富集结果一致（图4A）。10 μmol·L−1染毒组中磷酸化p38（p-p38）和磷酸化ERK（p-ERK）水平升高（P＜0.05），25 μmol·L−1染毒组中p-ERK水平升高（P＜0.05），55 μmol·L−1染毒组中p-p38水平升高（P＜0.05）（图4B）。
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图 4 氯菊酯对HMC3 MAPK通路的影响A：qPCR检测MAPK通路基因表达情况；B：Western blot检测MAPK通路蛋白表达条带及定量。**: P<0.01；***: P<0.001；****: P<0.0001。Figure 4. Effects of permethrin on MAPK pathway of HMC3A: Expression of genes related to MAPK pathway by qPCR. B: Protein expression bands of MAPK pathway and quantification by Western blot. **: P<0.01; ***: P<0.001; ****: P<0.0001.2.5 氯菊酯诱导HMC3炎症反应
HMC3经过0、10、25、55 μmol·L−1氯菊酯染毒72 h后，检测NO含量，发现上清中NO分泌量逐渐增加，分别是（0.52±0.11）、（0.70±0.11）、（0.83±0.06）、（1.19±0.13）μmol·L−1，各氯菊酯染毒组均高于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）（图5A）。另外，氯菊酯染毒后，HMC3上清中IL-6分泌量有增加趋势（结果见补充材料图S4）；HMC3 IL-6的mRNA和蛋白表达也有增加趋势（图5B和5C），但差异尚未呈现统计学意义。氯菊酯染毒HMC3 72 h后，各氯菊酯染毒组的IL-1β mRNA表达均较对照组明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05）（图5B）；同时，IL-1β蛋白表达也升高（P<0.05）（图5C）。
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图 5 氯菊酯对HMC3炎症因子表达的影响A：格里斯试剂法检测氯菊酯染毒后的HMC3上清中NO含量；B：qPCR检测氯菊酯染毒后HMC3炎症因子mRNA表达情况；C：Western blot检测氯菊酯染毒后HMC3细胞IL-6和IL-1β的蛋白表达情况及相对定量；D：qPCR检测氯菊酯染毒后HMC3 MMP家族mRNA表达情况；E：Western blot检测氯菊酯染毒后HMC3细胞MMP1的蛋白表达情况及相对定量。*: P<0.05；**: P<0.01；***: P<0.001；****: P<0.0001。Figure 5. Effects of permethrin on the expression of inflammatory cytokines in HMC3A: NO content in the supernatant of HMC3 after permethrin treatment by Greiss method. B: mRNA expressions of HMC3 inflammatory factors after permethrin treatment by qPCR. C: Protein expressions of IL-6 and IL-1β in HMC3 after permethrin treatment and their relative quantification by Western blot; D: Relative mRNA expressions of HMC3 MMP family by qPCR. D: Protein expressions of MMP1 in HMC3 after permethrin treatment and their relative quantification by Western blot. *: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001; ****: P<0.0001.使用qPCR检测MMP1、MMP2、MMP3和MMP9表达后，发现MMP1和MMP3表达量上调，其中，MMP1上调更加明显。与对照组相比，各氯菊酯染毒组MMP1基因相对表达倍数分别是（1.27±0.03）倍、（2.36±0.04）倍、（7.69±0.03）倍（图5D），25、55 μmol·L−1组蛋白表达量均升高（P<0.05）（图5E）。
3. 讨论
本研究探讨不同浓度氯菊酯对HMC3的毒性效应。细胞周期失调是细胞增殖异常的一种方式[23]，本研究发现氯菊酯诱导小胶质细胞周期G2/M期阻滞，周期蛋白依赖性激酶抑制因子基因CDKN1A表达量升高，这与周期阻滞结果有关[24]。同时转录组测序发现氯菊酯染毒HMC3差异基因富集到MAPK信号通路，检测p38和ERK表达上调得以验证。MAPK参与细胞增殖、分化和炎症反应等过程，提示氯菊酯可通过激活HMC3细胞MAPK信号通路，产生神经毒性效应。
HMC3炎症相关基因表达检测结果显示，氯菊酯染毒后NO分泌量和IL-1β表达水平升高。NO是一种脑内可扩散信使，在神经发生中具有双重作用[25]，神经炎症条件下的NO过量产生，会使NO从神经调节因子转变为神经毒性因子[26]。IL-1β是介导神经系统损伤的关键细胞因子[27]，小胶质细胞高表达或过多分泌IL-1β会抑制神经干细胞的增殖[28]，促进神经元损伤，从而导致神经退行性病变[16]。本研究提示氯菊酯刺激小胶质细胞分泌NO和IL-1β等炎症因子产生神经毒性效应。
有研究发现，0.125 μmol·L−1氯氰菊酯可通过诱导小胶质细胞MAPKs和MMPs活化，可能导致神经退行性病变[18]。Gremlin-1（一种分泌型骨形态发生蛋白拮抗剂）诱导MAPK激活，刺激细胞分泌IL-1β，从而促进MMPs高表达，导致炎症发生和细胞外基质降解[29]。MMPs的异常表达可导致血脑屏障功能障碍、炎症、神经毒性和各种中枢神经系统疾病[30]。作为MMPs家族中的一员，MMP1高表达也可以降解细胞外基质，破坏血脑屏障，中断细胞-细胞或细胞-基质相互作用引发“失巢”的周围神经细胞的死亡[31]。本研究发现，氯菊酯染毒小胶质细胞后，MAPK通路被激活，IL-1β和MMP1高表达。这提示，MAPK/IL-1β/MMPs可能是氯菊酯导致神经炎症发生，破坏血脑屏障及产生神经毒性的潜在机制，但其具体作用机制仍需进一步探讨。
本研究只针对人小胶质细胞HMC3探讨氯菊酯的毒性，还未对其他细胞和动物展开毒性效应研究，因此本研究的结论还需谨慎推广。下一步也将开展氯菊酯对其他神经细胞和实验动物的毒性效应和机制研究。
综上，本研究发现氯菊酯能够抑制小胶质细胞的增殖，诱导细胞周期阻滞，激活小胶质细胞炎症反应，MAPK/IL-1β/MMPs可能是氯菊酯导致小胶质细胞炎症发生并产生神经毒性的潜在机制。
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图 2 氯菊酯对HMC3细胞周期及相关基因表达的影响
A：流式细胞仪检测氯菊酯染毒72 h后的HMC3细胞周期；B：各周期细胞比例定量；C：细胞周期相关基因表达情况。*：P<0.05；**：P<0.01； ****：P<0.0001。
Figure 2. Cell cycle and related-gene expressions of HMC3 after 72 h permethrin treatment
A: HMC3 cell cycle after 72 h permethrin treatment by flow cytometry. B: Quantification of cell proportions in each cycle. C: Cell cycle-related gene expression. *: P<0.05; **: P<0.01; ****: P<0.0001.
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图 3 氯菊酯对HMC3细胞凋亡影响
A：使用流式细胞仪检测不同氯菊酯染毒72 h后，HMC3细胞凋亡情况；B：流式细胞凋亡定量图。
Figure 3. Effects of permethrin on apoptosis in HMC3
A: Apoptosis of HMC3 after 72 h permethrin treatment by flow cytometry. B: Quantitative apoptosis ratio.
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图 4 氯菊酯对HMC3 MAPK通路的影响
A：qPCR检测MAPK通路基因表达情况；B：Western blot检测MAPK通路蛋白表达条带及定量。**: P<0.01；***: P<0.001；****: P<0.0001。
Figure 4. Effects of permethrin on MAPK pathway of HMC3
A: Expression of genes related to MAPK pathway by qPCR. B: Protein expression bands of MAPK pathway and quantification by Western blot. **: P<0.01; ***: P<0.001; ****: P<0.0001.
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图 5 氯菊酯对HMC3炎症因子表达的影响
A：格里斯试剂法检测氯菊酯染毒后的HMC3上清中NO含量；B：qPCR检测氯菊酯染毒后HMC3炎症因子mRNA表达情况；C：Western blot检测氯菊酯染毒后HMC3细胞IL-6和IL-1β的蛋白表达情况及相对定量；D：qPCR检测氯菊酯染毒后HMC3 MMP家族mRNA表达情况；E：Western blot检测氯菊酯染毒后HMC3细胞MMP1的蛋白表达情况及相对定量。*: P<0.05；**: P<0.01；***: P<0.001；****: P<0.0001。
Figure 5. Effects of permethrin on the expression of inflammatory cytokines in HMC3
A: NO content in the supernatant of HMC3 after permethrin treatment by Greiss method. B: mRNA expressions of HMC3 inflammatory factors after permethrin treatment by qPCR. C: Protein expressions of IL-6 and IL-1β in HMC3 after permethrin treatment and their relative quantification by Western blot; D: Relative mRNA expressions of HMC3 MMP family by qPCR. D: Protein expressions of MMP1 in HMC3 after permethrin treatment and their relative quantification by Western blot. *: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001; ****: P<0.0001.
表 1 引物序列
Table 1 Primer sequences
基因名称
(Genes)正向(Forward)
5′→ 3′反向(Reverse)
5′→ 3′GAPDH GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG CDK1 AAACTACAGGTCAAGTGGTAGCC TCCTGCATAAGCACATCCTGA CDKN1A TGTCCGTCAGAACCCATGC AAAGTCGAAGTTCCATCGCTC CCNB2 CCGACGGTGTCCAGTGATTT TGTTGTTTTGGTGGGTTGAACT p53 GGCGTAAACGCTTCGAGATG CTTCAGGTAGCTGGAGTGAGC FAS AGATTGTGTGATGAAGGACATGG TGTTGCTGGTGAGTGTGCATT CASP3 CATGGAAGCGAATCAATGGACT CTGTACCAGACCGAGATGTCA H2AX CTGTACCAGACCGAGATGTCA TGTGCCTGTTACCAAGTGCT MAPK1 TACACCAACCTCTCGTACATCG CATGTCTGAAGCGCAGTAAGATT MAPK8 TACAGAGCACCCGAGGTCAT TCTCCCATGATGCACCCAAC MAPK14 TCAGTCCATCATTCATGCGAAA AACGTCCAACAGACCAATCAC IL-1α AGATGCCTGAGATACCCAAAACC CCAAGCACACCCAGTAGTCT IL-1β ATGATGGCTTATTACAGTGGCAA GTCGGAGATTCGTAGCTGGA IL-4 CGGCAACTTTGTCCACGGA TCTGTTACGGTCAACTCGGTG IL-6 ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG MMP1 AAAATTACACGCCAGATTTGCC GGTGTGACATTACTCCAGAGTTG MMP2 CGCTACGATGGAGGCGCTAA AGAAGGTGTTCAGGTATTGCACTG MMP3 CTGGACTCCGACACTCTGGA CAGGAAAGGTTCTGAAGTGACC MMP9 GGCAGCTGGCAGAGGAATAC GGCCCCAGAGATTTCGACTC 
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