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摘要:
自19世纪以来，模式生物的出现帮助研究人员进一步了解细胞信号通路，确定药物靶点以及进行环境毒理学的研究。外源性化学物质，如污染物、药物和工业化学品，可能会影响大脑的生物过程或其功能，并最终导致神经疾病。然而人脑是一个复杂的、组织严密的器官，在很多方面与模式生物有着根本的区别。由于物种的差异，动物模型可能不能完全的模拟人脑以测试环境污染物的神经毒性。由人多能干细胞诱导而来的人类脑器官在基因组、转录组以及代谢组水平更贴合人体的真实情况，提供了测试以及预测环境污染物神经毒性的有效平台，成为研究神经毒理学的新模型。本文综述了类脑器官技术的新进展及其在评估环境毒物方面的应用，以期为类脑器官在环境神经毒理学应用提供新见解。
Abstract:Since the 19th century, the emergence of model systems has helped researchers further understand cellular signaling pathways, identify potential drug targets, and conduct environmental toxicological studies. Exogenous chemicals, such as pollutants, drugs, and industrial chemicals, may affect brain biological processes and functions and eventually lead to neurological diseases. However, the brain is a complex and well-organized human organ, which is fundamentally different from any existing model system. Animal models may not be able to completely simulate the human brain in testing the neurotoxicity of environmental pollutants due to species differences. Human brain organoids, generated from human pluripotent stem cells, are emerging model systems for neurotoxicological research in line with the real situation of human body at the level of genome, transcriptome, and metabolome, and provide an effective platform for testing neurotoxicity of environmental toxins. We reviewed the latest development of brain organoids technology and its application in the evaluation of environmental neurotoxins, and provided new insights into the application of brain organoids in environmental neurotoxicology.
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Keywords:
- human brain organoid /
- environmental toxicology /
- neurotoxicology
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自19世纪末出现各种模式生物（线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠等）以来，人类对病理生理学、药理学以及毒理学的科学研究都迈向了一个全新的维度。研究者们借助模式生物以探讨细胞信号的作用通路、确定药物的潜在作用靶点、指导针对疾病候选药物的设计，亦或是进行环境污染物毒理学研究[1]。大脑作为高等脊椎动物最为复杂的器官，负责整合信息、快速反应和记忆学习的过程。然而，获取患者组织的困难以及动物模型和人脑之间的巨大差异阻碍了对人脑发育和神经毒理学机制的进一步了解[2]。干细胞自组装潜能的发现是近年来在干细胞领域最为瞩目的研究成果，类器官是由人类多能干细胞（human pluripotent stem cell, hPSC）衍生而来的一种实验模型[3]。随着干细胞在类脑器官构建中的应用，由多能干细胞诱导和分化的类脑器官较好地模拟了人脑发育早期阶段的相关特征。
中枢神经系统对环境污染物的暴露十分敏感，包括药物、食品添加剂和环境毒物。越来越多的证据表明，这些暴露可能引发严重的神经毒性，并导致神经发育障碍和神经退行性疾病，进而降低患者的生活质量、增加社会和家庭负担[4]。由于在人脑组织上展开研究的困难，环境污染物对神经系统产生影响的机制尚未完全阐明。类脑器官平台的出现则为开展环境神经毒理学的研究提供了高通量的可靠平台。
1. 类脑器官概述
近年来，越来越多研究提示，有许多生物过程是局限于人体的，无法在动物模型中复现，尤其是大脑的发育过程。人类大脑不仅比啮齿动物的大脑更加复杂，两者神经分化的轨迹也不尽相同。哺乳动物大脑发育始于神经上皮细胞的增殖，进而产生放射状胶质细胞（radial glia, RG）。RG在脑室区（ventricular zone, VZ）顶端发生分裂，同时生成神经元细胞和中间祖细胞（intermediate progenitors, IP）。IP主要分布在与VZ相邻的脑室下区（subventricular zone, SVZ），而神经元则通过中间区（intermediate zone, IZ）迁移到皮质板（cortical plate, CP）并形成不同类型的皮层。人类SVZ经由纤维层（inner fiber layer, IFL）分割为内侧靠近脑室的内侧脑室下区和外侧靠近软脑膜的外侧脑室下区[5]。外侧脑室下区则形成了一个独立的祖细胞层，由IP和一种独特的干细胞组成——外放射状胶质细胞（outer radial glia, oRG），这种干细胞在啮齿类动物中表达的很少，甚至不表达[6]。然而，人类大脑皮层神经元主要就是由这种位于外侧脑室下区的oRG细胞分化而来。同时，纤维层和外侧脑室下区在啮齿类动物初始脑区中也是缺乏的[7]。这些不同之处也导致了啮齿类动物与人类在脑体积上的明显差异。除了在神经发生上的不同，人体在代谢上与模式动物也存在显著差异，而在代谢上的差异也导致了人和模式动物在暴露于药物以及环境毒物时的反应、生理过程大不相同[8]。例如，细胞色素P450酶作为机体最重要的药物代谢酶，在不同种属间存在较大的差异，尤其是在底物特异性和催化活性上[4]。此外，现有的模式动物都是近亲繁殖产生的，而人类则不然，正是这一不同促成了区别于模式动物的人类遗传的多样性[1]。因此，跨过人类与模式动物的鸿沟对研究疾病发生发展、开发个性化医疗以及环境毒理学机制等研究至关重要。总而言之，科学研究中亟须建立人类特有的模型系统。
1.1 类脑器官的构建
类脑器官雏形的建立最早可以追溯到2008年Eiraku等[9]利用胚胎干细胞建立了具有极性的皮质组织，之后具有更清楚的皮层分层结构以及人类特有外侧脑室下区的类脑器官也得到了建立[10]。类脑器官相较于传统的神经细胞2D培养一方面可以展现大脑部分复杂的结构，另一方面因其较小的体积成为了大通量神经毒理/药理学研究的筛选模型。类器官建立的过程包括：创建多能干细胞的三维聚集体，在细胞外基质或者悬浮的情况下成功生长，形成毫米大小的具有分化潜能的细胞聚集体，并且该三维聚集体可以展现目标组织的相关特征[11]。既往研究者们对于类器官定义曾有过一段时间的争议，目前普遍认为类器官的定义为：在体外使用3D系统建立的模型，该模型可以复制人体器官复杂的细胞类型、重现人体组织的“自组装”过程，并尽量还原人体器官的主要组织[2]。2013年由Lancaster等[7]利用人类胚胎干细胞（human embryoid stem cell, hESC）构建了类脑器官，并建立了一套稳定的模型培养系统。除了多能干细胞，具有生长、分化潜能的供体组织也可以构建类脑器官，比如由来自胶质母细胞瘤构建的胶质母细胞瘤类脑器官[12]。研究者们一般根据类脑器官所模拟的大脑区域对其进行划分，如皮质类器官、视网膜类器官、下丘脑类器官或脊髓类器官等。神经类器官和神经系统类器官则指代涵盖更广泛细胞类型的类器官，包括来自中枢和外周神经系统、自主神经和肠道神经系统的细胞类型。组装类脑器官是指将一种类型的类脑器官与另一种类型的类脑器官进行组装融合（背侧前脑类器官与腹侧前脑类器官形成的组装类脑器官）或将一种类型的类脑器官与另外一种细胞类型进行融合（皮层类器官与内皮细胞融合形成的组装类脑器官）[11]。移植类脑器官是指将类脑器官移植到动物体内继续生长，而与移植类脑器官相似的嵌合体动物是指将人类细胞在动物发育的早期阶段整合到其胚胎中后继续生长的动物。与移植类脑器官相比，嵌合体动物可能使得动物细胞更广泛地与人类细胞进行整合[13]。
1.2 类脑器官的研究进展
目前，建立成熟的类脑器官模型可以较好地模拟背侧前脑、海马区、脉络丛，其中脉络丛类器官可以产生与人体脑脊液类似的关键成分。然而在类脑器官的培养中，缺乏功能性的血管循环系统阻碍了有效的氧气供应和营养交换，导致类脑器官核心区细胞的死亡。为了更准确地了解大脑发育和出现紊乱的机制，迫切需要开发可靠的方法来改善氧气和营养供应，以此产生更接近在体状态的类脑器官[2]。在研究人员的不懈努力下，出现了包括使用3D打印微型旋转瓶[14]、生物兼容性微丝[15]、类脑器官移植、微流控芯片系统[16]以及对类脑器官切片形成气液界面等方法以延长培养周期[17]。常用旋转瓶需要大量的培养液，给一些实验室造成了严重的负担。因此，Qian等[18]开发了一种经济高效且对类器官缺氧状态有较好改善的3D打印旋转生物反应器（SpinΩ），用于大脑特定区域类器官的培养，Qian等利用该模型研究了寨卡病毒对皮质器官早期阶段的影响。Mansour等[19]为了培养具有功能和血管的类脑器官，将类脑器官移植到成年小鼠的脑中，类脑器官的移植促进了类脑器官中神经元的分化和成熟。器官芯片是由光学透明的塑料、玻璃或者聚二甲基硅氧烷等柔性聚合物组成的微流控细胞培养系统[20]。该系统的构建包含由内容物填充的微通道，通过在体外重建目标组织和器官的结构和功能来模拟在体的生理状态和病理过程。一般的器官芯片结合了两种或多种组织类型，这些细胞组织可以穿过多孔的细胞外基质涂层或由微通道中的基质凝胶隔开。细胞的活力可以通过流经内皮衬里的血管通道、实质通道或两者的流动培养液来维持，一般可以维持较长的时间（几周到几个月）[21]。器官芯片的出现，也为解决类脑器官营养和氧气供给不足的问题提供了另外一条解决方案。Cho等[14]利用细胞外基质包埋的微流控芯片来培养类脑器官不仅促进了类脑器官的发育和生长，也为神经系统疾病的有效建模和药物筛选提供了更好的平台（见表1）。而通过对类器官的切片培养，将类器官的厚度缩减以期达到长期培养的效果[17]，并通过该模型再现了肌萎缩侧索硬化症的早期病理特征，并通过组学技术揭示了肌萎缩侧索硬化症中星形胶质细胞和神经元的功能障碍。
表 1 类脑器官培养系统Table 1. Culture systems of brain organoids类器官命名 特殊生长因子或抑制剂 技术要求 时长 参考文献 全脑类器官 Rho相关蛋白激酶（Rho-associated protein kinase, ROCK）抑制剂 基质胶，旋转瓶/摇床 30 d [7] 视网膜-皮层类器官 视黄醇乙酸酯，转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGFB)受体抑制剂 旋转瓶 30~60 d [23] 背侧前脑类器官 TGFB和WNT(Wingless/Integrated)抑制剂 摇床，旋转瓶 3~6个月 [24] 感光皮层类器官 ROCK抑制剂，脑源性神经营养(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)因子 基质胶包埋，旋转瓶 3~9个月 [25] 视网膜皮层类器官 视黄酸 细胞刮刀 6个月 [26] 皮层类器官 TGFB和ROCK抑制剂，音猬因子(sonic hedgehog, SHH) 摇床 40 d [27] 腹侧中脑类器官 SHH因子，肝醣合成酶激酶3抑制剂，成纤维细胞生长因子8因子,蜘蛛丝蛋白 3D支架，基质胶包埋 2~4个月 [28] 后脑-脊髓类器官 SHH因子，视黄酸 组装类器官 45~75 d [10] 下丘脑弓状核类脑器官 SHH因子，WNT抑制剂 摇床 40~100 d [29] 丘脑类器官 SHH因子，TGFB抑制剂，Smad(由线虫的Sma和果蝇的Mad缩写而来)抑制剂，BDNF因子 摇床(80 r·min−1) 1~3个月 [30] 脉络丛类器官 骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein, BMP4)因子 基质胶包埋，摇床 42 d [31] 海马类器官 WNT抑制剂，TGFB抑制剂，BMP4因子 40% O2 61 d [32] 微流控芯片-基质胶脑类器官 ROCK抑制剂 基质胶包埋，微流控系统 75 d [14] 自2013年以来，类脑器官的构建方法层出不穷。研究者们在开发新的类脑器官系统时走向了两个方向：一方面，建立愈来愈趋于稳定的类脑器官系统，以便进行高通量的药物筛选和毒理学实验；另一方面，建立更加复杂的类脑器官系统，通过组装不同的脑区或将类脑器官与血管类器官或其他组织类器官进行共培养以更好地模拟人体内不同的生理环境。研究者们则要权衡天平的两端——类脑器官研究的同质性与复杂性。虽然目前研究人员利用移植类脑器官、切片培养、微流控芯片等技术有效地提高了类脑器官的培养质量，但大多数方法需要专业的技术操作和大量的前期经验（如动物实验相关操作和器官切片技术）。同时，大部分类器官的构建方案培养出的类器官批次间差异较大，一致性欠佳。开发一种低成本、新手友好、一致性较高的类脑器官培养系统也成为目前研究者们努力的目标[22]。
2. 类脑器官在环境毒理学中的应用
类脑器官模型的建立为探究人脑早期发育、人类特定疾病以及神经毒理学研究提供一个稳定的新平台。在前脑、中脑、后脑，丘脑、下丘脑弓状核、海马、脉络丛[28–30，32，33]等区域类脑器官技术日渐成熟，为探究单一脑区生理过程的研究者们提供了极大便利。在此期间，类脑器官的复杂度也得到了显著提升。同时，利用微流控芯片等技术改善类脑器官的培养环境，构建类脑器官、血管类器官或者其他组织类器官的共培养体系更是医工交叉领域的研究热点[34]。因此，利用类脑器官进行环境毒理学研究具有德天独厚的优势。类脑器官的高通量培养不仅有利于暴露浓度的筛选，也适用于毒理学混合暴露研究中复杂的分组。此外，相较于动物模型，类脑器官模型更接近于真实的在体状态，尤其是类脑器官对于人类初始神经发育过程的模拟。
2.1 环境污染物的神经毒性研究
铅、汞、镉、铬以及砷是在地壳中广泛存在的重金属元素，也同是工业来源的金属。流行病学调查显示，重金属暴露会导致癌症、神经毒性和皮肤损伤[35]。砷、铅、镉的神经毒性包括神经退行性改变，周围神经病变以及异常行为等。长期铅暴露可对神经系统、骨骼、造血系统、肝脏等造成严重影响，其中对神经系统的毒性作用最为明显，而且对发育早期神经系统的毒性比对成年期的毒性更为严重。一项meta研究提示中等剂量砷暴露就会导致智商降低，饮用水中砷含量每增加1 µg·L−1，智商将下降0.08%[36]。此外，流行病学研究表明，尿液、头发和趾甲中砷的浓度与智力下降、运动发育障碍、神经心理评分下降和孤独症谱系障碍有关。鉴于多种重金属被世界卫生组织列为主要公 共卫生关注的十大化学品，探究这几种重金属混合暴露的毒理学效应也成为了环境毒理学的重要问题之一。砷、铅、镉和汞的混合暴露研究中发现，神经细胞存活率下降，凋亡率增加，活性氧增加，胞内钙离子水平改变。砷、铅、镉混合暴露下调小鼠胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）的基因转录水平，上调皮质星形角质细胞凋亡水平，并导致骨骼生长迟缓。尽管对重金属单独暴露研究已有了初步成果，但混合暴露的毒性机制尚不清楚，因此探索重金属联合暴露会产生何种类型的混合毒性作用和相应的毒性机制具有极为重要的理论意义和临床防治的应用前景。环境中无处不在的化学物质除了重金属还包括二手烟和空气污染等。前瞻性研究发现邻苯二甲酸酯暴露与新生儿不良的发育结局相关；双酚A暴露与儿童行为问题相关，尤其是在男童中；产前空气污染中多环芳烃的暴露与儿童五岁时的IQ得分降低相关[37]。而类脑器官的出现也为环境污染物的识别提供了一个有效且可靠的平台。利用皮层类脑器官的研究提示，尼古丁暴露诱导神经元过早分化和皮质发育受损[38]，另一项研究也发现了丙戊酸暴露导致神经系统功能障碍并增加了自闭症的发生风险[39]。
2.2 类脑器官在环境毒理学的应用
目前研究者们主要是通过细胞系培养，大鼠，斑马鱼等模式动物进行重金属单独暴露以及混合暴露的神经毒理学研究。这些模式动物对于人脑神经发育的模拟非常局限，其中纤维层和外侧脑室下区这些人类特有的脑区，在重金属的神经毒理学研究中无法得到准确的复现和探索。不仅如此，模式动物在培养成本上也不适合混合暴露多分组的研究。类脑器官作为更接近人体情况的模型，在培养成本上也适用于多分组的混合暴露研究。Huang等[40]利用Lancaster建立的全脑类器官揭示了镉通过诱导类脑器官神经细胞凋亡，激活星形胶质细胞，抑制纤毛生长，从而产生神经发育毒性。Chen等[41]利用皮层-视网膜类脑器官揭示了砷的急性暴露诱导细胞周期阻滞，进而影响了神经元的增值和凋亡水平。除了在重金属神经毒理学中的应用，类脑器官平台也在其他环境污染物的神经毒性探究中得到了应用。Bu等[42]团队于2020年利用类脑模型探究食源性污染物——丙烯酰胺神经毒性的可能机制。该研究表明在丙烯酰胺的诱导下类脑器官核呼吸因子2（NRF2）介导的基因表达上调，进而诱导细胞凋亡，抑制神经元分化，导致高度可溶的微管相关蛋白（tau蛋白）过度磷酸化，这可能是丙烯酰胺诱导神经发育毒性的机制之一。Zeng等[43]利用视网膜类器官结合转录组学发现，大气污染物PM2.5暴露可能通过MAPK和PI3K/Akt通路抑制细胞增殖、促进细胞凋亡，进而影响人视网膜类器官的早期发育。Hua等[44]于2022年利用皮质类器官研究新型环境污染物——微塑料的短期暴露和长期暴露对于皮质类器官细胞活力以及成熟神经元的抑制效应。皮层类脑器官也可以用来探究环境内分泌干扰物对神经系统的影响，Yang等[45]发现邻苯二甲酸二酯暴露14 d显著抑制类脑器官细胞增殖、增加细胞凋亡、破坏神经发生和神经前体迁移，进而损害大脑皮层的形态发生。类脑器官也被用于评估抗抑郁药物帕罗西汀的神经毒性，与对照组相比，帕罗西汀导致类脑器官突触标志物以及少突胶质细胞总数减少。视网膜类器官在视神经毒性药物的评估上也被证实是合理有效的，在空气污染物（PM2.5）、地高辛、硫代咪嗪、西地那非、酮咯酸、乙醇和甲醇的独立研究中提供了新的视角（见表2）。
表 2 类脑器官在神经毒理学中的应用Table 2. Application of brain organoids in neurotoxicology污染物及其浓度 暴露时间 结论 参考文献 镉(10 μmol·L−1、40 μmol·L−1、80 μmol·L−1) 24 h 神经细胞凋亡；GFAP和白细胞介素-6过表达；神经纤毛长度缩短 [40] 丙烯酰胺(2.5 mmol·L−1、5 mmol·L−1) 24 h 诱导细胞凋亡；抑制神经元分化；促进tau过度磷酸化 [42] PM2.5(25~100 μg·mL−1) 1周/3周 类器官面积和厚度减少；增殖细胞减少；细胞凋亡增加；成纤维细胞生长因子水平降低 [43] 微塑料(5、50、100 μg·mL−1) 6 d/26 d 短期微塑料暴露促进巢蛋白、人类配对盒基因、激活转录因子4、人同源盒基因4和超氧化物歧化酶2基因的表达和增殖；长期暴露降低细胞存活率 [44] 邻苯二甲酸二酯(0~400 μmol·L−1) 14 d 神经发生和神经前体迁移受阻；扰乱细胞-细胞外基质互作 [45] 帕罗西汀(20 ng·mL−1、60 ng·mL−1) 8周 神经突触标志物减少；神经突起生长减少；少突胶质细胞总数减少 [46] 酮咯酸(2.5 mmol·L−1)；
地高辛(40 nmol·L−1)；
硫代咪嗪(135 μmol·L−1)；
西地那非(225 μmol·L−1)；
乙醇(500 mmol·L−1)；
甲醇(32 mmol·L−1)酮咯酸-24 h；
地高辛-24 h；
硫代咪嗪-24 h；
西地那非-7 d；
乙醇-24 h；
甲醇-24 h地高辛、硫代咪嗪和西地那非引起的感光细胞死亡；所有药物治疗引起的星形胶质细胞的激活 [47] 3. 结论与展望
综上所述，类脑器官在既往的动物模型和人体真实环境间取得了一定的平衡，兼顾了实验模型的便捷和人体真实情况的模拟，为探究环境毒理学机制以及潜在治疗靶点提供了新的研究手段。然而，在应用类脑器官时，批次间的差异和中心区的逐渐坏死也引起了研究者们对类脑器官真正应用于神经毒理学研究的担心。但是，随着基质胶以及微流控平台技术的精进，以上问题也逐一得到了有效的解决。随着更多实验技术方法与类脑器官模型适配，使得研究者们能够在类脑器官中验证既往动物模型研究中产生的假说。利用成熟的类脑器官模型与多种技术结合，可以多水平高通量地研究外源性化合物对人体的毒性作用机制，并从中筛选出具有较高特异型和高灵敏度的生物标志物，为环境污染物的健康风险评估提供新的技术手段。
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表 1 类脑器官培养系统
Table 1 Culture systems of brain organoids
类器官命名 特殊生长因子或抑制剂 技术要求 时长 参考文献 全脑类器官 Rho相关蛋白激酶（Rho-associated protein kinase, ROCK）抑制剂 基质胶，旋转瓶/摇床 30 d [7] 视网膜-皮层类器官 视黄醇乙酸酯，转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGFB)受体抑制剂 旋转瓶 30~60 d [23] 背侧前脑类器官 TGFB和WNT(Wingless/Integrated)抑制剂 摇床，旋转瓶 3~6个月 [24] 感光皮层类器官 ROCK抑制剂，脑源性神经营养(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)因子 基质胶包埋，旋转瓶 3~9个月 [25] 视网膜皮层类器官 视黄酸 细胞刮刀 6个月 [26] 皮层类器官 TGFB和ROCK抑制剂，音猬因子(sonic hedgehog, SHH) 摇床 40 d [27] 腹侧中脑类器官 SHH因子，肝醣合成酶激酶3抑制剂，成纤维细胞生长因子8因子,蜘蛛丝蛋白 3D支架，基质胶包埋 2~4个月 [28] 后脑-脊髓类器官 SHH因子，视黄酸 组装类器官 45~75 d [10] 下丘脑弓状核类脑器官 SHH因子，WNT抑制剂 摇床 40~100 d [29] 丘脑类器官 SHH因子，TGFB抑制剂，Smad(由线虫的Sma和果蝇的Mad缩写而来)抑制剂，BDNF因子 摇床(80 r·min−1) 1~3个月 [30] 脉络丛类器官 骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein, BMP4)因子 基质胶包埋，摇床 42 d [31] 海马类器官 WNT抑制剂，TGFB抑制剂，BMP4因子 40% O2 61 d [32] 微流控芯片-基质胶脑类器官 ROCK抑制剂 基质胶包埋，微流控系统 75 d [14] 
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表 2 类脑器官在神经毒理学中的应用
Table 2 Application of brain organoids in neurotoxicology
污染物及其浓度 暴露时间 结论 参考文献 镉(10 μmol·L−1、40 μmol·L−1、80 μmol·L−1) 24 h 神经细胞凋亡；GFAP和白细胞介素-6过表达；神经纤毛长度缩短 [40] 丙烯酰胺(2.5 mmol·L−1、5 mmol·L−1) 24 h 诱导细胞凋亡；抑制神经元分化；促进tau过度磷酸化 [42] PM2.5(25~100 μg·mL−1) 1周/3周 类器官面积和厚度减少；增殖细胞减少；细胞凋亡增加；成纤维细胞生长因子水平降低 [43] 微塑料(5、50、100 μg·mL−1) 6 d/26 d 短期微塑料暴露促进巢蛋白、人类配对盒基因、激活转录因子4、人同源盒基因4和超氧化物歧化酶2基因的表达和增殖；长期暴露降低细胞存活率 [44] 邻苯二甲酸二酯(0~400 μmol·L−1) 14 d 神经发生和神经前体迁移受阻；扰乱细胞-细胞外基质互作 [45] 帕罗西汀(20 ng·mL−1、60 ng·mL−1) 8周 神经突触标志物减少；神经突起生长减少；少突胶质细胞总数减少 [46] 酮咯酸(2.5 mmol·L−1)；
地高辛(40 nmol·L−1)；
硫代咪嗪(135 μmol·L−1)；
西地那非(225 μmol·L−1)；
乙醇(500 mmol·L−1)；
甲醇(32 mmol·L−1)酮咯酸-24 h；
地高辛-24 h；
硫代咪嗪-24 h；
西地那非-7 d；
乙醇-24 h；
甲醇-24 h地高辛、硫代咪嗪和西地那非引起的感光细胞死亡；所有药物治疗引起的星形胶质细胞的激活 [47]
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