Therapeutic effects and mechanisms of two exercise modes on rats with nonalcoholic fatty liver disease
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摘要:背景
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是代谢综合征的肝脏表现，可引起肝硬化甚至肝癌。规律运动是防治NAFLD的重要非药物干预策略，然而最佳康复训练处方尚未确定。
目的对比中等强度持续运动（MICT）和高强度间歇运动（HIIT）对大鼠NAFLD的治疗效果并探讨其可能机制。
方法4周龄雄性OLETF大鼠36只，饲养至20周龄时按照随机数字表分为模型安静组、模型MICT组和模型HIIT组（每组
n =12），同期选取同品系年龄、性别相配匹的LETO大鼠12只作为正常对照组。正常对照组和模型安静组在鼠笼内安静饲养，模型MICT组（60%最高跑速，60 min·d−1，5 d·周−1）和模型HIIT组（以80%最高跑速强度运动1 min后紧接着以40%最高跑速强度运动1 min，依次交替重复10个循环，5 d·周−1）分别进行8周不同方式跑台训练。末次干预48 h后进行肝脏组织病理学观察并测定肝脏甘油三酯和肝糖原含量、线粒体含量和功能以及代谢调控相关标志物（糖原合成、脂肪酸转运、脂肪从头合成、甘油三酯转运和分泌、巨噬细胞极化）的蛋白表达量。结果与模型安静组比较，模型MICT组和模型HIIT组血浆丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）以及肝脏甘油三酯含量下降（
P <0.05），柠檬酸合成酶（CS）活性和脂肪酸氧化（FAO）升高（P <0.05），Elovl脂肪酸延长酶6（Elovl6）、CD11c、白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达量下降（P <0.05），过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（PGC-1α）和CD206蛋白表达量升高（P <0.05），肝脏糖原含量和糖原合酶（GS）蛋白表达量则无统计学意义（P >0.05）；模型MICT组脂肪酸转位酶（FAT/CD36）蛋白表达量下降（P <0.05）；模型HIIT组载脂蛋白B100（ApoB100）表达量上调（P <0.05）。结论长期MICT（60 min·d−1，5 d·周−1）和HIIT（20 min·d−1，5 d·周−1）干预对OLETF大鼠NAFLD具有相似的治疗效果，其机制与改善肝脏线粒体含量和功能、脂质代谢以及巨噬细胞极化状态有关。由于HIIT具有显著时效性，因此有望成为MICT的替代模式，对于NAFLD患者优化运动康复处方具有重要意义。
Abstract:BackgroundNonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is the hepatic manifestation of metabolic syndrome, which may lead to cirrhosis or even hepatoma. Regular exercise is an important non-drug intervention strategy for the prevention and treatment of NAFLD, but the optimal prescription for rehabilitation training has not yet been determined.
ObjectiveTo compare the therapeutic effects of moderate-intensity continuous training (MICT) and high-intensity interval training (HIIT) on rats with NAFLD and explore the possible mechanisms.
MethodsThirty-six 4-week-old male OLETF rats were raised to 20 weeks old and divided into three groups: a sedentary group, a MICT group, and a HIIT group (
n =12 in each group) by random number table, at the same time, same strain 12 age- and sex-matched LETO rats were selected as normal control group. The rats in the normal control and the sedentary group were fed quietly in cages, while the rats in the MICT group (60% of maximal running speed, 60 min·d−1, 5 d·week−1) and the HIIT group (80% of maximal running speed for 1 min followed by 40% of maximal running speed for 1 min, alternately repeating 10 cycles, 5 d·week−1) followed the designed exercise protocols for eight weeks by treadmill running. Forty-eight hours after the last training session, hepatic histopathology was observed and hepatic triglyceride and glycogen content, mitochondrial content and function. and protein expressions of markers related to metabolic regulation (glycogen synthesis, fatty acid transport,de novo lipogenesis, triglyceride transport and secretion, and macrophage polarization) were measured.ResultsCompared with the sedentary group, the levels of plasma alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) and hepatic triglyceride decreased (
P <0.05), the activities of citrate synthase (CS) and fatty acid oxidation (FAO) increased (P <0.05), the protein expression levels of Elovl fatty acid elongase 6 (Elovl6), CD11c, interleukin-1β (IL-1β), and tumor necrosis factor-α (TNF-α) decreased (P <0.05), the protein expression levels of peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α (PGC-1α) and CD206 increased (P <0.05), while the differences of liver glycogen and glycogen synthase (GS) protein expression levels showed no statistical significance (P >0.05) in the MICT group and the HIIT gtoup; the protein expression of fatty acid translocase (FAT/CD36) decreased in the MICT group (P <0.05); the protein expression of apolipoprotein B100 (ApoB100) were up-regulated (P <0.05) in the HIIT group (P <0.05).ConclusionLong-term MICT (60 min·d−1, 5 d·week−1) and HIIT (20 min·d−1, 5 d·week−1) interventions have similar therapeutic effects on NAFLD in OLETF rats, and the mechanisms are related to the improvement of hepatic mitochondrial content and function, lipid metabolism, and macrophage polarization state. Because of its remarkable time efficiency, HIIT is expected to become an alternative mode of MICT, which is of great significance for optimizing exercise rehabilitation prescriptions for patients with NAFLD.
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非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD）是一组进行性肝脏病变，同时也是代谢综合征的肝脏表现[1]。截至2020 年，NAFLD全球患病率高达25.24%，在肥胖和糖尿病人群中更是达到了70%~80%[2]。NAFLD是引发肝细胞癌最重要的诱因，严重影响患者生存质量[2]。
改变生活方式如增加体力活动是NAFLD患者主要的康复治疗手段[3]。目前，美国运动医学学会[3]推荐成年人每周进行150 min的中等强度持续运动（moderate-intensity continuous training, MICT）（即有氧运动）以达到健康促进的目的。证据显示[4]，有氧运动能够改善成年NAFLD患者临床症状。然而，由于MICT形式单调、持续时间长、枯燥乏味，在实施运动处方过程中患者往往难以长期坚持，其中“缺乏时间”是影响体力活动参与率与坚持性的最大障碍[5]。针对心血管疾病患者的临床研究证实[6]，体力活动的健康效应与运动强度呈现剂量-反应关系，其中高强度体力活动的心脏保护作用是中等强度的2倍。近年来的研究证据显示，高强度间歇运动（high-intensity interval training, HIIT）由于所需时间较短、总运动量较低，因此具有显著时效性特点，已逐渐成为竞技运动员一种新颖流行的训练模式[7-8]。研究表明，HIIT具有诸多健康益处，其对于多种慢性病的康复疗效与传统MICT相似甚至更佳[9-10]。最近的一项采用高脂饮食诱导大鼠NAFLD的研究发现，HIIT对NAFLD的疗效优于MICT，两种运动方式的持续时间均为50 min[11]。临床研究证实，消耗相同热量（1674 kJ）的HIIT和MICT对NAFLD的改善作用是等效的，每周训练时间并无统计学意义[（231.3±11.0） min vs. （222.4±18.2） min，P>0.05][12]。上述两项研究并未突显HIIT的时效性特点，因此HIIT在NAFLD疾病管理中的最优方案尚未确定。本研究以更接近人类NAFLD自然病程的OLETF自发性2型糖尿病大鼠为动物模型[13]，同时制定更为省时的HIIT方案，旨在对比不同运动方式对NAFLD的治疗效果并探讨其可能机制。
1. 对象与方法
1.1 实验材料
选取4周龄雄性OLETF大鼠36只以及年龄、性别相配匹的同品系LETO（long-evans tokushima otsuka）大鼠12只，体质量160~180 g，从日本大冢制药株式会社德岛研究所引进。在无特定病原体级条件下分笼饲养，饲养环境：通风良好，温度24~26 ℃，湿度50%~60%，明暗周期比12 h∶12 h，大鼠自由摄食和饮水。饲养至20周龄时将OLETF大鼠按照随机数字表分为模型安静组、模型MICT组和模型HIIT组（每组n=12），将LETO大鼠作为正常对照组（n=12）。实验过程中，由于意外死亡、拒跑等原因，于数据统计时共剔除8只动物，最终样本量为n=40，其中正常对照组n=12、模型安静组n=10、模型MICT组n=9、模型HIIT组n=9。实验方案经常州工程职业技术学院动物实验伦理委员会批准，批准号为CVIE 2022-018。实验过程遵循了单位和国家有关实验动物管理和使用的规定。
1.2 训练方案与取材
参照课题组前期研究制定训练方案[14-17]。首先利用递增负荷运动力竭实验测定大鼠最高跑速：起始负荷为5 m·min−1，每2 min增加1.5 m·min−1，坡度为0°，直至力竭，记录最后一级负荷对应的跑速即为最高跑速。随后模型MICT组和模型HIIT组分别进行5 d·周−1、共8周的不同方式跑台训练。模型MICT组方案为：运动强度（跑速）为60%最高跑速，运动时间为60 min·d−1；模型HIIT组方案为：以80%最高跑速强度运动1 min后紧接着以40%最高跑速强度运动1 min，依次交替重复10个循环。分别于第4和6周重新测定最高跑速并及时调整运动强度。正常对照组和模型安静组在鼠笼内安静饲养。
整个研究过程中每周测量体重和食物摄入量。末次训练后48 h，测定体脂百分比，随后腹主动脉取血致死。将全血以3000 r·min−1离心20 min（离心半径为8.5 cm），后分离血浆，−20 ℃低温冰箱冻存待测血浆生化标志物含量。剥离肝脏并称重，将其分为两部分，一部分固定于10%福尔马林中进行组织病理学观察，另一部分转移至−80 ℃冰箱待测肝脏物质代谢标志物以及相关蛋白表达量。
1.3 指标测试
1.3.1 体脂百分比测定
采用双能X线吸收法测定大鼠全身体脂百分比。腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪（9∶1，2 mL·kg−1）麻醉动物，以俯卧位置于双能X线吸收仪（Lunar Prodigy Advance，美国GE公司）扫描床上，依次标定开始点、结束点、基点，扫描结束后保存、分析数据，记录大鼠全身脂肪含量，连续测量三次，取均值。体脂百分比＝全身脂肪含量÷体质量×100%。
1.3.2 血浆生化标志物含量检测
空腹血糖、甘油三酯、游离脂肪酸、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase, AST）用全自动生化分析仪（Cobas 8000型，德国罗氏公司）以比色法测定；糖化血红蛋白（glycated hemoglobin, HbA1c）、空腹胰岛素、白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）采用全自动酶标仪（BIO-RAD 680型，美国伯乐公司）以酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）测定。计算胰岛素抵抗指数（insulin resistance index, ISI），ISI＝空腹血糖水平×空腹胰岛素水平÷22.5。试剂盒均购自中国生物技术股份有限公司，严格按照试剂盒说明书进行操作。
1.3.3 肝脏组织病理学观察
肝脏用10%福尔马林固定，石蜡包埋，制作5 μm厚度组织切片。分别进行苏木精－伊红（hematoxylin-eosin, HE）和Masson染色，光学显微镜（DM 4000B型，德国徕卡公司）下观察肝脏组织病理学变化和纤维化程度。
1.3.4 肝脏甘油三酯和肝糖原含量测定
取适量肝脏组织，利用组织匀浆机低温匀浆后离心，取上清，利用自动分光光度计（Lambda 950型，美国Perkinelmer公司）以比色酶法测定肝脏甘油三酯和肝糖原含量，试剂盒购自南京建成生物科技有限公司。
1.3.5 肝脏线粒体含量测定
利用肝脏线粒体柠檬酸合成酶（citrate synthase, CS）活性反映肝脏线粒体含量。取适量肝脏组织，密度梯度离心法提取肝脏线粒体，Bradford法测定蛋白浓度，采用紫外分光光度计（UV-2450型，日本岛津公司）以比色法测定线粒体CS活性。记录吸光度变化，重复3次，以每分钟吸光度变化0.01为1个酶单位。
1.3.6 脂肪酸氧化（fatty acid oxidation，FAO）测定
参照Rector等[18]的研究利用同位素法测定肝脏FAO。取适量肝脏组织剪碎后置于代谢瓶中，加入放射同位素标记的[1-14C]-棕榈酸（美国Sigma公司），注入硫酸释放二氧化碳（carbon dioxide, CO2）。采用液体闪烁仪（LS-6500型，美国Beckman公司）测定放射性，以[1-14C]-棕榈酸转化的14CO2反映FAO。
1.3.7 蛋白表达量检测
利用Western blot法检测肝脏过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator 1 α, PGC-1α）（sc-518025）、糖原合酶（glycogen synthase, GS）（ab40810）、磷酸化糖原合酶（phosphorylated glycogen synthase, pGS）（ab81230）、脂肪酸转位酶（fatty acid translocase, FAT/CD36）（sc-7309）、Elovl脂肪酸延长酶6（Elovl fatty acid elongase 6, Elovl6）（ab69857）、微粒体甘油三酯转运蛋白（microsomal triglyceride transfer protein, MTTP）（ab63467）、载脂蛋白B100（apolipoprotein B100, ApoB100）（sc-13538）、CD11c（ab52632）、白细胞介素1β（interleukin-1β, IL-1β）（ab254360）、TNF-α（ab183218）、CD163（ab182422）和CD206（ab64693）。
取适量肝脏组织匀浆后取上清，Bradford法测定总蛋白浓度。根据目的蛋白分子量配置6%~12%分离胶以及5%浓缩胶，取20 μg蛋白样品在垂直电泳仪上经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）分离后，转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride, PVDF）膜上。用5%牛血清白蛋白封闭，兔抗鼠一抗4 ℃孵育过夜，二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，1∶5000，武汉博士德生物工程有限公司）室温孵育1 h。充分洗涤后，使用增强化学发光（enhanced chemiluminescence, ECL）成像，X线胶片压片曝光，利用凝胶成像系统（ChemiDoc XRS，美国Bio-Rad公司）拍摄并扫描各条带光密度值。根据目的蛋白分子量选取β-actin、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）或Cyclophilin（1∶2000，美国Santa cruz公司）为内参蛋白，以各组与正常对照组的倍数作为目的蛋白相对表达量。
1.4 统计学分析
所有数据以均数±标准差表示，用SPSS 20.0进行数据统计分析。各参数四组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用Bonferroni检验。P<0.05定为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 训练负荷特征分析
训练负荷包括训练强度和训练时间两个方面（训练负荷＝训练强度×训练时间）。本研究中，模型HIIT组（20 min·d−1）训练时间是模型MICT组（60 min·d−1）的1/3，其中模型HIIT组高强度训练时间仅10 min，训练负荷[（80%最高跑速×1＋40%最高跑速×1）×10]是模型MICT组（60%最高跑速×60）的1/3。
2.2 各组体质量、体脂百分比和食物摄入量比较
与正常对照组比较，模型安静组体质量、体脂百分比和食物摄入量均升高（P<0.05）；与模型安静组比较，模型MICT组和模型HIIT组体质量、体脂百分比和食物摄入量均下降（P<0.05）。见表1。
表 1 各组体质量、体脂百分比和食物摄入量比较Table 1. Comparison of body mass, percentage of body fat, and food intake in each group指标(Variable) 正常对照组
(Control group) (n=12)模型安静组
(Sedentary group) (n=10)模型MICT组
(MICT group)(n=9)模型HIIT组
(HIIT group)(n=9)体质量(Body mass)/g 437.2±39.7 685.5±55.9a 547.0±43.8b 575.9±51.3b 体脂百分比(Percentage of body fat)/% 13.7±2.6 35.8±4.3a 22.8±3.6b 25.1±4.0b 食物摄入量/(g·周−1)[Food intake/(g·week−1)] 145.1±6.8 251.6±9.0a 203.6±8.8b 195.4±9.2b [注] 与正常对照组比较，a：P < 0.05；与模型安静组比较，b：P < 0.05。[Note] Compared with the control group, a: P < 0.05; Compared with the sedentary group, b: P < 0.05. 2.3 各组血浆生化标志物比较
与正常对照组比较，模型安静组血浆甘油三酯、游离脂肪酸、IL-6、ALT、AST、空腹血糖、空腹胰岛素、ISI和HbA1c含量升高（P<0.05）；与模型安静组比较，模型MICT组和模型HIIT组血浆甘油三酯、游离脂肪酸、ALT、AST、空腹血糖、空腹胰岛素、ISI和HbA1c含量下降（P<0.05），模型MICT 组IL-6 浓度下降（P<0.05）。见表2。
表 2 各组血浆生化标志物比较Table 2. Comparison of plasma biochemical markers in each group指标(Variable) 正常对照组
(Control group) (n=12)模型安静组
(Sedentary group) (n=10)模型MICT组
(MICT group)(n=9)模型HIIT组
(HIIT group)(n=9)血脂参数(Blood lipid parameters) 甘油三酯(Triglycerides)/(mmol·L−1) 0.52±0.13 3.70±1.05a 1.18±0.34b 1.33±0.41b 游离脂肪酸(Free fatty acids)/(mmol·L−1) 0.30±0.05 0.91±0.12a 0.55±0.07b 0.62±0.08b 炎症标志物(Inflammatory markers) TNF-α/(pg·mL−1) 3.9±1.8 5.8±2.7 4.9±2.1 4.3±1.7 IL-6/(pg·mL−1) 3.7±1.1 127.6±40.7a 51.5±9.7b 107.1±45.9 肝损伤标志物(Liver damage markers) ALT/(U·L−1) 38.5±5.3 62.0±7.9a 41.6±6.5b 35.7±6.0b AST/(U·L−1) 152.6±52.1 387.1±98.0a 215.2±63.7b 238.0±71.5b 血糖控制参数(Glycemic control parameters) 空腹血糖(Fasting blood glucose)/(mmol·L−1) 6.5±1.3 14.6±3.2a 8.8±2.2b 9.6±3.1b 空腹胰岛素(Fasting insulin)/(mU·L−1) 15.9±3.9 36.9±6.2a 21.0±4.7b 23.7±5.9b ISI 4.6±1.2 22.8±6.0a 8.3±2.6b 9.9±3.7b HbA1c/% 4.9±1.8 8.8±3.1a 5.1±1.9b 5.3±2.0b [注] 与正常对照组比较，a：P < 0.05；与模型安静组比较，b：P < 0.05。 [Note] Compared with the control group, a: P < 0.05; Compared with the sedentary group, b: P < 0.05. 2.4 各组肝脏组织病理学观察
HE染色显示（图1A），正常对照组肝细胞形态结构正常，模型安静组肝细胞肿胀、排列无序、脂肪变性，胞浆中充满大量脂肪空泡，部分肝细胞内可见气球样变，模型MICT组和模型HIIT组肝细胞形态有所恢复，肝细胞肿胀和脂肪变性明显减轻。Masson染色显示（图1B），正常对照组肝细胞结构完整，肝汇管区和中央静脉周围仅有少量胶原纤维沉积，模型安静组汇管区和中央静脉周围蓝色胶原纤维沉积增多，模型MICT组和模型HIIT组汇管区和中央静脉周围胶原沉积和纤维化程度有所减轻。
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图 1 肝脏组织病理学观察A：HE染色；B：Masson染色。Figure 1. Hepatic histopathological observationA: HE stain; B: Masson stain.2.5 各组肝脏线粒体含量和功能比较
CS活性反映线粒体含量，PGC-1α能够促进线粒体生物合成，FAO则是表征肝脏线粒体氧化功能的指标。与正常对照组比较，模型安静组肝脏FAO和PGC-1α蛋白表达量下降（P<0.05）；与模型安静组比较，模型MICT组和模型HIIT组肝脏CS活性、FAO以及PGC-1α蛋白表达量升高（P<0.05）。见图2。
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图 2 各组肝脏线粒体含量和功能比较A：线粒体CS活性；B：FAO；C：PGC-1α蛋白电泳图；D：PGC-1α蛋白表达量；与正常对照组比较，a：P<0.05；与模型安静组比较，b：P<0.05。Figure 2. Comparison of content and function of hepatic mitochondria in each groupA: Mitochondrial CS activity; B: FAO; C: PGC-1α protein electrophoresis pattern; D: PGC-1α protein expression; Compared with the control group, a: P<0.05; Compared with the sedentary group, b: P<0.05.2.6 各组肝脏糖原代谢比较
GS是肝脏糖原合成的关键酶。与正常对照组比较，各模型组肝脏糖原含量、pGS蛋白表达量和pGS/GS比值均下降（P<0.05），各模型组间比较则无统计学意义（P>0.05）。见图3。
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图 3 各组肝脏糖原代谢比较A：肝脏糖原含量；B：GS蛋白电泳图；C：GS蛋白表达量；与正常对照组比较，a：P<0.05；与模型安静组比较，b：P<0.05。Figure 3. Comparison of hepatic glycogen metabolism in each groupA: Liver glycogen content; B: GS protein electrophoresis pattern; C: GS protein expression; Compared with the control group, a: P<0.05; Compared with the sedentary group, b: P<0.05.2.7 各组肝脏脂质代谢比较
FAT/CD36是脂肪酸转运的关键酶，Elovl 6是脂肪从头合成的关键酶，MTTP是负责甘油三酯转运的重要蛋白，ApoB100则负责甘油三酯分泌。与正常对照组比较，模型安静组肝脏甘油三酯含量以及FAT/CD36、Elovl6蛋白表达量升高（P<0.05），ApoB100表达量下降（P<0.05）；与模型安静组比较，模型MICT组和模型HIIT组肝脏甘油三酯含量以及Elovl6蛋白表达量下降（P<0.05），模型MICT组FAT/CD36蛋白表达量下降（P<0.05），模型HIIT组ApoB100表达量升高（P<0.05）。MTTP在各组间比较无统计学意义（P>0.05）。见图4。
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图 4 各组肝脏脂质代谢比较A：肝脏甘油三酯含量；B：脂质代谢蛋白电泳图；C：脂质代谢蛋白表达量。与正常对照组比较，a：P<0.05；与模型安静组比较，b：P<0.05。Figure 4. Comparison of hepatic lipid metabolism in each groupA: Liver triglyceride content; B, Lipid metabolism protein electrophoresis pattern; C: Lipid metabolism protein expression; Compared with the control group, a: P<0.05. Compared with the sedentary group, b: P<0.05.2.8 各组肝脏巨噬细胞极化比较
CD11c、IL-1β和TNF-α是肝脏巨噬细胞M1极化标志物，CD163和CD206是M2极化标志物。与正常对照组比较，模型安静组肝脏CD11c、IL-1β和TNF-α蛋白表达量升高（P<0.05），CD206蛋白表达量下降（P<0.05）；与模型安静组比较，模型MICT组和模型HIIT组肝脏CD11c、IL-1β和TNF-α蛋白表达量降低（P<0.05），CD206蛋白表达量升高（P<0.05）。见图5。
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图 5 各组肝脏巨噬细胞极化比较A：巨噬细胞M1型极化标志物蛋白电泳图；B：巨噬细胞M1型极化标志物蛋白表达量；C：巨噬细胞M2型极化标志物蛋白电泳图；D：巨噬细胞M2型极化标志物蛋白表达量。与正常对照组比较，a：P<0.05；与模型安静组比较，b：P<0.05。Figure 5. Comparison of hepatic macrophage polarization in each groupA: Protein electrophoresis pattern of M1 polarization markers in macrophages; B: Protein expression level of M1 polarization markers in macrophages; C: Protein electrophoresis pattern of M2 polarization markers in macrophages; D: Protein expression level of M2 polarization markers in macrophages. Compared with the control group, a: P<0.05; Compared with the sedentary group, b: P<0.05.3. 讨论
多项临床试验以及课题组前期的实验动物均证实，MICT能够有效改善NAFLD，然而最佳康复运动处方尚未确定[4，15，19]。近年来，HIIT因其较低的运动时间和总运动量而成为流行的训练模式。研究表明，HIIT能够显著改善诸多慢性病患者临床症状、降低心血管危险因素并提升生活质量[9-10]。本研究发现，模型安静组大鼠出现代谢综合征的典型特点，包括肥胖、高血糖、高血脂、轻度炎症和NAFLD，后者是代谢综合征的肝脏表现。此外，由于转氨酶（ALT和AST）含量升高，提示肝脏发生损伤。经过8周康复后，两种运动方式（MICT和HIIT）均可有效改善OLETF大鼠NAFLD临床结局，包括肝脏甘油三酯和血浆转氨酶含量下降、肝脏脂肪变性和肝纤维化减轻。上述结果提示，长期HIIT与MICT干预对OLETF大鼠NAFLD具有相似的治疗效果。更为重要的是，HIIT的训练时间和训练负荷仅为MICT的1/3，与一项针对NAFLD患者的临床研究设计相似（HIIT组：13 min，MICT组：40 min）[20]，因此HIIT较MICT具有显著的时效性优势，这对于优化NAFLD患者运动康复处方具有重要意义。
肝脏是进行物质代谢尤其是脂肪酸氧化最活跃的组织，这一过程主要在线粒体完成，因此维持肝脏线粒体功能对于改善肝脏脂质沉积具有重要作用[21-22]。在本研究中，模型安静组CS活性、FAO以及PGC-1α蛋白表达量下降，线粒体含量减少、功能受损，脂肪酸氧化效率下降。研究证实[23]，运动可增加骨骼肌和心肌线粒体含量并提高其氧化代谢功能。本研究发现，与模型安静组比较，模型MICT组和模型HIIT组肝脏CS活性、PGC-1α蛋白表达和FAO增加，提示两种运动方式均可诱导肝脏线粒体发生良性适应。由于NAFLD发生之前已出现肝脏线粒体功能障碍，而后者与OLETF大鼠NAFLD进展密切相关[24]，因此肝脏线粒体标志物增加具有重要意义，这也是运动防治NAFLD的关键生物学机制。
肝脏是机体物质代谢和能量代谢的主要器官，葡萄糖进入肝脏后氧化产能或合成糖原。在本研究中，模型安静组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素、ISI和HbA1c含量升高，预示糖调节受损并参与2型糖尿病发生。血糖升高时，胰岛素通过促进肝糖原合成维持血糖稳定。然而由于胰岛素抵抗以及GS表达量下调，导致糖原合成减少、肝糖原含量降低，从而进一步引发高血糖和高胰岛素血症。值得注意的是，经过8周运动后，尽管两种运动方式均使空腹血糖、空腹胰岛素、ISI和HbA1c下降，但肝糖原含量和GS表达量均未发生改变，提示运动在改善血糖控制的同时并未对肝脏糖代谢产生影响。这与课题组前期以果糖喂养诱导NAFLD动物模型的研究结果不同（肝糖原含量显著下降）[15]，可能是运动方案、造模方法等因素存在差异所致。
脂肪酸摄取、转运和肝脏脂肪从头合成对于NAFLD具有促进作用。脂肪酸转运体FAT/CD36在NAFLD患者[25]和肥胖OLETF大鼠肝脏中表达明显上调[26]，进而加速肝脏对循环中脂肪酸的摄取。在本研究中，仅MICT能够下调肝脏FAT/CD36蛋白表达量。此外，据估计，NAFLD患者肝脏中超过25%的甘油三酯来源于脂肪从头合成[27]。前期的研究表明[18]，OLETF大鼠肝脏脂肪从头合成显著增加，这一改变在经过长期有氧运动后得到抑制。在本研究中，两种运动方式均可下调Elovl6蛋白表达量。作为长链脂肪酸延长酶，Elovl6不仅与肝脏脂肪变性有关，而且可通过促进炎症反应参与NAFLD向非酒精性脂肪性肝炎进展的病理过程[28]。MTTP和ApoB100对于肝脏极低密度脂蛋白分泌甘油三酯具有重要调节作用[29]。在本研究中，与正常对照组比较，模型安静组肝脏ApoB100含量明显下降，MTTP表达无显著性变化，提示甘油三酯转运功能正常，但分泌和摄取受阻，进而导致甘油三酯在肝脏积聚。与模型安静组比较，模型HIIT组ApoB100表达量升高，而模型MICT组则无显著性改变，这在一定程度上进一步证实了HIIT方式对于肝脏脂肪变性具有潜在的改善作用。
炎症反应是导致晚期肝病进展的重要原因[30]。已证实，NAFLD患者系统炎症因子水平显著升高[31]，这在本研究中亦得到进一步印证，即模型安静组大鼠血浆IL-6含量明显升高。此外，肥胖还会导致肝脏中巨噬细胞（又称Kupffer细胞）极化失衡，细胞表型发生改变，进而激活肝脏星状细胞诱导炎症和纤维化[32]。巨噬细胞主要极化为两种表型，即经典激活促炎的M1型和交替激活抗炎的M2型[33]。研究发现，巨噬细胞M1型极化标志物在非酒精性脂肪性肝炎[34]和饮食诱导肥胖[35]实验动物模型中显著升高。这在本研究中同样得到证实，即模型安静组肝脏M1极化标志物CD11c、IL-1β和TNF-α表达显著上调。此外，肝脏CD206表达下调，与Wan等[35]针对肝脏脂肪变性患者的研究结果一致，提示OLETF大鼠M2极化标志物降低。总之，NAFLD诱导肝脏巨噬细胞向M1型极化，进而引起促炎因子分泌，加剧肝脏炎症反应[31]。经过运动干预后，模型HIIT组和模型MICT组CD11c、IL-1β和TNF-α表达量均下降，与Kawanishi等[36]以饮食诱导肥胖小鼠为动物模型的研究结果类似，说明运动能够下调巨噬细胞M1型极化标志物。此外，HIIT和MICT均上调CD206表达量，表明不同运动方式均可诱导肝脏巨噬细胞由M1型向M2型极化。巨噬细胞极化平衡得到改善有利于降低炎症反应并减轻肝纤维化[37]。上述结果提示，运动能够通过改变肝脏巨噬细胞的极化状态发挥肝脏保护作用，这可能是运动防治NAFLD重要机制和干预靶点。
综上所述，本研究表明，长期MICT（60 min·d−1，5 d·周−1）和HIIT（20 min·d−1，5 d·周−1）干预对OLETF大鼠NAFLD具有相似的治疗效果，其机制与肝脏线粒体含量及功能、脂质代谢和肝脏巨噬细胞极化状态改善有关。本研究结果再次证实了运动康复疗法对NAFLD的重要作用，由于HIIT具有显著时效性，因此有望成为MICT的替代模式，对于NAFLD患者优化运动康复处方具有重要意义。今后的研究应进一步探讨不同运动方案（包括运动方式、运动强度、运动时间、运动频率）对NAFLD的干预作用并深入探索其分子机制，同时开展多中心、大样本、随机、双盲、对照临床试验，以形成基于证据等级和推荐强度的循证运动指南。
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图 1 肝脏组织病理学观察
A：HE染色；B：Masson染色。
Figure 1. Hepatic histopathological observation
A: HE stain; B: Masson stain.
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图 2 各组肝脏线粒体含量和功能比较
A：线粒体CS活性；B：FAO；C：PGC-1α蛋白电泳图；D：PGC-1α蛋白表达量；与正常对照组比较，a：P<0.05；与模型安静组比较，b：P<0.05。
Figure 2. Comparison of content and function of hepatic mitochondria in each group
A: Mitochondrial CS activity; B: FAO; C: PGC-1α protein electrophoresis pattern; D: PGC-1α protein expression; Compared with the control group, a: P<0.05; Compared with the sedentary group, b: P<0.05.
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图 3 各组肝脏糖原代谢比较
A：肝脏糖原含量；B：GS蛋白电泳图；C：GS蛋白表达量；与正常对照组比较，a：P<0.05；与模型安静组比较，b：P<0.05。
Figure 3. Comparison of hepatic glycogen metabolism in each group
A: Liver glycogen content; B: GS protein electrophoresis pattern; C: GS protein expression; Compared with the control group, a: P<0.05; Compared with the sedentary group, b: P<0.05.
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图 4 各组肝脏脂质代谢比较
A：肝脏甘油三酯含量；B：脂质代谢蛋白电泳图；C：脂质代谢蛋白表达量。与正常对照组比较，a：P<0.05；与模型安静组比较，b：P<0.05。
Figure 4. Comparison of hepatic lipid metabolism in each group
A: Liver triglyceride content; B, Lipid metabolism protein electrophoresis pattern; C: Lipid metabolism protein expression; Compared with the control group, a: P<0.05. Compared with the sedentary group, b: P<0.05.
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图 5 各组肝脏巨噬细胞极化比较
A：巨噬细胞M1型极化标志物蛋白电泳图；B：巨噬细胞M1型极化标志物蛋白表达量；C：巨噬细胞M2型极化标志物蛋白电泳图；D：巨噬细胞M2型极化标志物蛋白表达量。与正常对照组比较，a：P<0.05；与模型安静组比较，b：P<0.05。
Figure 5. Comparison of hepatic macrophage polarization in each group
A: Protein electrophoresis pattern of M1 polarization markers in macrophages; B: Protein expression level of M1 polarization markers in macrophages; C: Protein electrophoresis pattern of M2 polarization markers in macrophages; D: Protein expression level of M2 polarization markers in macrophages. Compared with the control group, a: P<0.05; Compared with the sedentary group, b: P<0.05.
表 1 各组体质量、体脂百分比和食物摄入量比较
Table 1 Comparison of body mass, percentage of body fat, and food intake in each group
指标(Variable) 正常对照组
(Control group) (n=12)模型安静组
(Sedentary group) (n=10)模型MICT组
(MICT group)(n=9)模型HIIT组
(HIIT group)(n=9)体质量(Body mass)/g 437.2±39.7 685.5±55.9a 547.0±43.8b 575.9±51.3b 体脂百分比(Percentage of body fat)/% 13.7±2.6 35.8±4.3a 22.8±3.6b 25.1±4.0b 食物摄入量/(g·周−1)[Food intake/(g·week−1)] 145.1±6.8 251.6±9.0a 203.6±8.8b 195.4±9.2b [注] 与正常对照组比较，a：P < 0.05；与模型安静组比较，b：P < 0.05。[Note] Compared with the control group, a: P < 0.05; Compared with the sedentary group, b: P < 0.05. 
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表 2 各组血浆生化标志物比较
Table 2 Comparison of plasma biochemical markers in each group
指标(Variable) 正常对照组
(Control group) (n=12)模型安静组
(Sedentary group) (n=10)模型MICT组
(MICT group)(n=9)模型HIIT组
(HIIT group)(n=9)血脂参数(Blood lipid parameters) 甘油三酯(Triglycerides)/(mmol·L−1) 0.52±0.13 3.70±1.05a 1.18±0.34b 1.33±0.41b 游离脂肪酸(Free fatty acids)/(mmol·L−1) 0.30±0.05 0.91±0.12a 0.55±0.07b 0.62±0.08b 炎症标志物(Inflammatory markers) TNF-α/(pg·mL−1) 3.9±1.8 5.8±2.7 4.9±2.1 4.3±1.7 IL-6/(pg·mL−1) 3.7±1.1 127.6±40.7a 51.5±9.7b 107.1±45.9 肝损伤标志物(Liver damage markers) ALT/(U·L−1) 38.5±5.3 62.0±7.9a 41.6±6.5b 35.7±6.0b AST/(U·L−1) 152.6±52.1 387.1±98.0a 215.2±63.7b 238.0±71.5b 血糖控制参数(Glycemic control parameters) 空腹血糖(Fasting blood glucose)/(mmol·L−1) 6.5±1.3 14.6±3.2a 8.8±2.2b 9.6±3.1b 空腹胰岛素(Fasting insulin)/(mU·L−1) 15.9±3.9 36.9±6.2a 21.0±4.7b 23.7±5.9b ISI 4.6±1.2 22.8±6.0a 8.3±2.6b 9.9±3.7b HbA1c/% 4.9±1.8 8.8±3.1a 5.1±1.9b 5.3±2.0b [注] 与正常对照组比较，a：P < 0.05；与模型安静组比较，b：P < 0.05。 [Note] Compared with the control group, a: P < 0.05; Compared with the sedentary group, b: P < 0.05.
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