Role of STAT3 activated NLRP3 inflammasomes in BV2 cell inflammatory response induced by maltol aluminum
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摘要:背景
铝激活信号转导和转录激活因子3（STAT3）致小胶质细胞活化核苷酸结合和寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体产生炎症反应并造成神经毒性。
目的探讨STAT3调控NLRP3炎症小体在麦芽酚铝（Al(mal)3）致小鼠小胶质细胞株（BV2）细胞炎症反应中的作用。
方法选取BV2细胞株，利用Al(mal)3染毒和STAT3拮抗剂C188-9干预，实验分为5组：对照组，Al(mal)3低、中、高剂量组（40、80和160 μmol·L−1 Al(mal)3），C188-9干预组（10 μmol·L−1 C188-9+160 μmol·L−1 Al(mal)3）。采用CCK8检测细胞活力；采用Western blotting检测BV2细胞M1/M2型标志物CD68/CD206的表达，以及STAT3、p-STAT3、NLRP3、cleaved-casepase-1、衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白（ASC）表达量；采用ELISA检测促炎因子白细胞介素（IL）-1β、IL-18和抗炎因子IL-10的含量。
结果细胞活力测定显示：随着染铝浓度的增加，各剂量组细胞活力逐渐降低。与对照组相比，Al(mal)3高剂量组细胞活力下降18%（
P ＜0.05）；与Al(mal)3高剂量组相比，C188-9干预组细胞活力升高14%（P ＜0.05）。与对照组相比，Al(mal)3低、中、高剂量组CD68的表达分别升高19%、20%、21%（P ＜0.05），Al(mal)3高剂量组CD206的表达降低25%（P ＜0.05）。与Al(mal)3高剂量组相比，C188-9干预组CD68的表达水平降低9%（P ＜0.05），而CD206的表达水平升高22%（P ＜0.05）。与对照组相比，Al(mal)3高剂量组p-STAT3蛋白表达量和p-STAT3/STAT3值分别增加129%和127%（P <0.05）。与Al(mal)3高剂量组相比，C188-9干预组p-STAT3蛋白表达量和p-STAT3/STAT3值分别降低55%和54%（P <0.05）。NLRP3炎症小体测试结果显示，与对照组相比，Al(mal)3高剂量组NLRP3蛋白表达量增加75%（P <0.05），Al(mal)3中、高剂量组cleaved-casepase-1蛋白表达量分别增加28%、35%（P <0.05），Al(mal)3低、中、高剂量组ASC表达量分别增加22%、25%、53%（P <0.05）。与Al(mal)3高剂量组相比，C188-9干预组NLRP3、cleaved-casepase-1、ASC蛋白表达量分别降低30%、19%、32%（P <0.05）。与对照组相比，IL-1β在Al(mal)3中、高剂量组含量分别增加18%、21%（P <0.05），IL-18在Al(mal)3高剂量组的含量增加10%（P <0.05）。与Al(mal)3高剂量组相比，C188-9干预组IL-18的含量降低23%（P <0.05）。抗炎因子IL-10的含量在各组差异无统计学意义（P >0.05）。结论铝能引起BV2小胶质细胞的炎症反应并且以促炎反应为主，其机制可能与STAT3调控NLRP3炎症小体分泌炎症因子有关。
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关键词:
- 麦芽酚铝 /
- BV2细胞 /
- 信号转导和转录激活因子3 /
- 寡聚化结构域样受体蛋白3
Abstract:BackgroundAluminum activates signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), causing microglial nucleotide-binding and oligomerization domain-like receptors protein 3 (NLRP3) inflammasome activation and inflammatory responses and producing neurotoxicity.
ObjectiveTo explore the role of STAT3 regulated NLRP3 inflammasomes in the inflammatory response of mouse microglia cell line (BV2) cells induced by maltol aluminum [Al(mal)3].
MethodsBV2 cells were assigned to five groups: one control group, three Al(mal)3 exposure groups (low, medium, and high doses at 40, 80, and 160 μmol·L−1 Al(mal)3 respectively), and one C188-9 (STAT3 antagonist) intervention group [10 μmol·L−1 C188-9 +160 μmol·L−1 Al(mal)3]. Cell viability was detected by CCK8. The expression of M1/M2 type markers, i.e. CD68/CD206, STAT3, p-STAT3, NLRP3, cleaved-casepase-1, and apoptosis-associated speck-like protein (ASC) in BV2 cells were detected by Western blotting, and proinflammatory cytokines interleukin (IL)-1β and IL-18, and anti-inflammatory cytokine IL-10 were determined by ELISA.
ResultsThe results of cell viability assay showed that cell viability gradually decreased with the increase of Al(mal)3 dose. Compared with the control group, the cell viability of the Al(mal)3 high-dose group was decreased by 18% (
P <0.05); compared with the Al(mal)3 high-dose group, the cell viability of the C188-9 intervention group was significantly elevated by 14% (P <0.05). Compared with the control group, the expression levels of CD68 in the Al(mal)3 low-, medium-, and high-dose groups were elevated by 19%, 20%, and 21%, respectively (P <0.05); the expression level of CD206 in the Al(mal)3 high-dose group was decreased by 25% (P <0.05). Compared with the Al(mal)3 high-dose group, the expression level of CD68 in the C188-9 intervention group was reduced by 9% (P <0.05), whereas the expression level of CD206 was elevated by 22% (P <0.05). Compared with the control group, the p-STAT3 protein expression and the p-STAT3/STAT3 ratio in the Al(mal)3 high-dose group increased by 129% and 127%, respectively (P <0.05). Compared with the Al(mal)3 high-dose group, the p-STAT3 protein expression and the p-STAT3/STAT3 ratio in the C188-9 intervention group were decreased by 55% and 54%, respectively (P >0.05). Compared with the control group, the expression level of NLRP3 protein increased by 75% in the Al(mal)3 high-dose group (P <0.05), the expression levels of cleaved-casepase-1 protein increased by 28% and 35% in the Al(mal)3 medium- and high-dose groups (P <0.05), and the expression levels of ASC increased by 22%, 25%, and 53% in the Al(mal)3 low-, medium- and high-dose groups (P <0.05), respectively. Compared with the Al(mal)3 high-dose group, the expression levels of NLRP3, cleaved-casepase-1, and ASC proteins in the C188-9 intervention group decreased by 30%, 19%, and 32%, respectively (P <0.05). Compared with the control group, the levels of IL-1β in the Al(mal)3 medium- and high-dose groups increased by 18% and 21%, respectively (P <0.05), and the level of IL-18 in the Al(mal)3 high-dose group increased by 10% (P <0.05). Compared with the Al(mal)3 high-dose group, the IL-18 levels were reduced by 23% in the C188-9 intervention group (P <0.05). The content of anti-inflammatory factor IL-10 did not differ significantly between groups (P >0.05).ConclusionAluminum can induce inflammatory responses in BV2 microglia and is predominantly pro-inflammatory, and the mechanism may involve STAT3 regulation of NLRP3 inflammasome secretion of inflammatory factors.
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铝是自然界中最常见的金属元素之一，且被广泛应用，导致人群对铝的接触机会大大增加。铝可通过多种形式进入人体血液等其他组织器官，作为一种神经毒素引起人体的神经炎症反应，影响大脑功能[1]。神经炎症就是中枢神经系统（central nervous system, CNS）的广泛免疫反应，主要涉及小胶质细胞和星形胶质细胞的参与[2]。在炎症反应细胞因子的信号传导下，小胶质细胞会由原来高度分支的静息状态下变为激活的吞噬状态并且释放促炎介质。不同的刺激会导致小胶质细胞被激活分化成不同的类型[3]，主要包括经典M1型激活和替代M2型激活，CD68和CD206分别是小胶质细胞M1型和M2型活化的表面标志物，在M1型激活中，小胶质细胞可能变得过度分化[4]，并上调促炎分子如白细胞介素（interleukin, IL）-1β和IL-18等，而M2型抑制会释放抗炎因子如IL-10等[5]，修复组织、神经炎症反应的关键是小胶质细胞活化后释放的炎症因子。小胶质细胞活化后释放的炎症因子是炎症反应的关键。
研究表明，铝能促进大脑中的神经系统炎性反应，炎性反应可能导致神经退行性疾病的发生[6]。张海洋等[7]研究发现，大鼠口服氯化铝水溶液进行染毒，随着染铝浓度的增加，造成大鼠海马区神经细胞病变及丢失，并且大鼠海马炎性因子增加，表明铝导致大鼠海马发生炎性反应。铝可引发炎症反应产生神经毒性，而神经系统的炎症反应是由小胶质细胞主要参与并执行的，因此研究铝如何引起小胶质细胞的炎症反应是至关重要的。
小胶质细胞活化后释放的炎症因子导致炎症反应是神经退行性疾病研究的热点问题之一。正常生理状态下炎症因子处于静息状态，在受到刺激条件下会发生活化，而核苷酸结合和寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding and oligomerization domain-like receptors protein 3, NLRP3）炎症小体是炎症因子IL-1β和IL-18激活的必要条件[8]。目前已鉴定出许多炎症小体，包括NLRP1、NLRP2、NLRP3、黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2, AIM2）和含NLR家族CARD域蛋白4（NLR family CARD domain-containing protein 4, NLRC4），而NLRP3是最具特色的炎症小体。除NLRP3蛋白外，NLRP3炎性体还含有衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein, ASC）和procaspase-1。在受到免疫刺激时，NLRP3、ASC和procaspase-1这3种蛋白质相互作用[9]，产生具有活性的caspase-1来诱导炎症因子活化和分泌。NLRP3炎症体的激活导致的神经炎症与神经退行性疾病密切相关，并且发现小胶质细胞的炎症可以由NLRP3炎症小体介导。
研究表明信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3, STAT3）信号通路与炎症小体的活化有关[10–11]，STAT蛋白家族由转录因子组成，在调节细胞生理过程发挥着重要作用。STAT3磷酸化调控着神经炎症相关的细胞因子分泌[12]。有研究发现降低STAT3的磷酸化水平可以下调促炎因子和NLRP3炎症小体的表达[10]。
研究发现金属离子可以激活STAT3信号通路，如金属镉可能影响STAT3信号通路[13]。纳米氧化锌具有神经毒性，可以诱导磷酸化Janus激酶2（phosphorylates Janus kinase 2, p-JAK2）及p-STAT3蛋白水平增加，进而导致小胶质细胞的炎症反应[14]。由于铝具有神经毒性，而且铝与镉、氧化锌都可以通过血脑屏障，推测铝可能通过STAT3信号通路活化NLRP3炎症小体，引发神经炎症反应产生神经毒性。
本研究选取小胶质细胞株BV2，利用麦芽酚铝（Al(mal)3）进行染毒，同时采用STAT3抑制剂C188-9对细胞进行干预，探讨STAT3活化NLRP3炎症小体在Al(mal)3致BV2小胶质细胞中的作用机制，为预防铝的神经毒性提供实验室依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株
小鼠小胶质细胞株BV2（山西医科大学张红梅教授馈赠），具有良好的小胶质细胞形态和功能，是良好的神经炎症的体外模型。
1.1.2 试剂
氯化铝（天津风船），麦芽酚（北京索莱宝），CCK-8试剂盒（中国博士德），STAT3活化抑制剂（C188-9；美国Selleck.cn），胎牛血清（中国四季青），Anti-STAT3抗体（中国Proteintech），Anti-p-STAT3抗体（美国Cell signaling Technology），Anti-NLRP3抗体、Anti-casepase-1抗体（中国Affinity），Anti-ASC抗体（美国Cell Signaling Technology），IL-10试剂盒、IL-18试剂盒、IL-1β试剂盒（上海酶联）。
1.1.3 Al(mal)3染毒液配制
将0.193 g氯化铝和0.3024 g麦芽酚分别溶于40 mL高压后的超纯水中，配置20 mmol·L−1的氯化铝溶液和 60 mmol·L−1的麦芽酚溶液，待溶液溶解完全后，用安装有0.22 μm滤头的针管分别过滤溶液，然后分装到无菌离心管中，将配好的麦芽酚、氯化铝溶液等体积加入离心管，混匀，用10%的氢氧化钠溶液调节混合溶液pH，使其为中性。Al(mal)3溶液浓度的选择依据本课题组前期实验[15]
1.2 方法
1.2.1 BV2细胞传代培养和实验分组
BV2细胞培养采用含10%胎牛血清的培养基，置于恒温培养箱培养，温度设置为37 ℃。实验分为5组，包括对照组（空白对照，不进行染毒处理），Al(mal)3低、中、高剂量组（40、80、160 μmol·L−1 Al(mal)3）和C188-9干预组（10 μmol·L−1 C188-9+160 μmol·L−1 Al(mal)3）。培养24 h后染毒24 h，然后收集细胞进行后续实验。细胞实验中C188-9预先选择0、2.5、5、10、20 μmol·L−1，根据细胞活力测试结果，最终确认干预剂量为10 μmol·L−1 C188-9。
1.2.2 CCK-8测定细胞活力
将BV2细胞悬液以每孔5×103个接种到96孔板里，每孔100 μL细胞悬液，于37 ℃恒温箱中培养24 h，当细胞密度达到50%~60%时按照上述浓度染毒24 h。每孔加入100 μL DMEM和10 μL CCK8的混合液，同时设置5个空白孔，空白孔只有100 μL DMEM和10 μL CCK8的混合液，没有细胞，在培养箱孵育1 h，用酶标仪测定波长为450 nm的光密度值（D）。
1.2.3 细胞总蛋白的提取
按照1∶1∶98的比例将蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、放射免疫沉淀法缓冲液（radioimmunoprecipitation assay buffer, RIPA）裂解液配成蛋白裂解液。每组细胞沉淀中加入80 μL蛋白裂解液，将细胞团块吹开，在冰上裂解30 min，12000 r·min−1离心10 min，取上清到一套新离心管里，上清即为细胞蛋白。
1.2.4 BCA蛋白定量
稀释牛血清白蛋白标准品（bovine serum albumin standard, BSA），将A、B液以50∶1的比例混匀配成二辛可宁酸（bicinchonininc acid, BCA）工作液，用超纯水将待测蛋白样品稀释至1/25，将标准品稀释液、样品稀释液和BCA工作液加到96孔版中，每个样品设置3个复孔。37 ℃孵育30 min后冷却至室温，测量波长595 nm处的D值，绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。
1.2.5 Western blotting
制胶，电泳，转膜，封闭，孵育一抗（CD68，1∶1000；CD206，1∶1000；STAT3，1∶1000；p-STAT3，1∶2000；NLRP3，1∶3000；cleaved-caspsase-1，1∶2000；ASC，1∶1000），洗膜孵育二抗再洗膜，最后显影。
1.2.6 ELISA检测
收集样品；设置标准品孔和样品孔加标准品和样品；加样稀释，加待测液加酶标试剂，封板，37 ℃温育60 min；洗涤；先后加入显色剂A、B；在37 ℃下避光显色15 min；最后加终止液；以空白孔调零，15 min以内在450 nm波长下依序测D值。
1.2.7 统计分析
采用SPSS 22.0软件进行统计分析。所有数据均为计量资料，采用均数±标准差（$ \bar{x}\pm s $）表示。多组数据比较采用单因素方差分析，方差齐采用LSD检验，方差不齐采用SNK进行两两比较。检验水准α=0.05（双侧）。
2. 结果
2.1 各组BV2细胞活力检测
随着Al(mal)3浓度的增加，各剂量组细胞活力呈逐渐降低的趋势。与对照组相比，Al(mal)3高剂量组细胞活力明显下降（P＜0.05）；与高剂量组相比，C188-9干预组细胞活力明显升高（P＜0.05），且C188-9干预组细胞活力与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。
2.2 各组BV2细胞M1/M2型标志物蛋白表达情况
由图1可见，与对照组相比，Al(mal)3低、中、高剂量组M1型标志蛋白CD68的表达分别升高19%、20%、21%（P＜0.05），Al(mal)3高剂量组M2型标志蛋白CD206的表达降低25%（P＜0.05）。与Al(mal)3高剂量组相比，C188-9干预组CD68的表达水平降低9%，CD206的表达水平升高22%（P＜0.05）。与对照组相比，C188-9干预组CD68和CD206的水平差异无统计学意义。
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图 1 各组BV2细胞M1型标志蛋白CD68和M2型标志蛋白CD206的表达（n=3）a：与对照组比较，P<0.05；b：与Al(mal)3高剂量组比较，P<0.05。Figure 1. Expression of M1 type marker protein CD68 and M2 type marker protein CD206 in BV2 cells of each group (n=3)a: Compared with the control group, P<0.05; b: Compared with the Al(mal)3 high-dose group, P<0.05.2.3 各组BV2细胞STAT3和p-STAT3蛋白的表达情况
由图2可见，随着Al(mal)3浓度的增加，STAT3蛋白表达量未有变化，p-STAT3蛋白表达量、p-STAT3/STAT3值均呈现逐渐增加的趋势。与对照组相比，Al(mal)3高剂量组p-STAT3蛋白的表达增加129%（P<0.05），p-STAT3/STAT3值增加127%（P<0.05）。与Al(mal)3高剂量组相比，C188-9干预组p-STAT3蛋白表达量降低55%（P<0.05），p-STAT3/STAT3值降低54%（P<0.05）。与对照组相比，C188-9干预组p-STAT3蛋白表达量和p-STAT3/STAT3值差异无统计学意义。
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图 2 各组BV2细胞STAT3和p-STAT3蛋白表达情况（n=3）a：与对照组比较，P<0.05；b：与Al(mal)3高剂量组比较，P<0.05。Figure 2. Expression of STAT3 and p-STAT3 proteins in BV2 cells of each group (n=3)a: Compared with the control group, P<0.05; b: Compared with the high-dose group of Al(mal)3, P<0.05.2.4 各组BV2细胞NLRP3炎症小体的表达情况
NLRP3炎症小体变化结果显示，随着Al(mal)3浓度的增加，NLRP3、cleaved-casepase-1和ASC蛋白表达量增加。与对照组相比，Al(mal)3高剂量组NLRP3蛋白表达量增加75%（P<0.05），Al(mal)3中、高剂量组cleaved-casepase-1蛋白表达量分别增加28%、35%（P<0.05），Al(mal)3低、中、高剂量组ASC表达量分别增加22%、25%、53%（P<0.05）。与Al(mal)3高剂量组相比，C188-9干预组NLRP3、cleaved-casepase-1、ASC蛋白表达量分别降低30%、19%、32%（P<0.05）。C188-9干预组与对照组相比，NLRP3、cleaved-casepase-1和ASC蛋白表达量差异无统计学意义。见图3。
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图 3 各组BV2细胞NLRP3炎症小体蛋白表达情况（n=3）a：与对照组比较，P<0.05；b：与Al(mal)3高剂量组比较，P<0.05。Figure 3. Expression of NLRP3 inflammasome protein in BV2 cells in each group (n=3)a: Compared with the control group, P<0.05; b: Compared with the high-dose group of Al(mal)3, P<0.05.2.5 各组BV2细胞促炎因子IL-1β、IL-18和抗炎因子IL-10的含量
促炎因子IL-1β、IL-18蛋白变化结果显示，IL-1β和IL-18的含量随着Al(mal)3浓度的增加而呈现增加的趋势，与对照组相比，IL-1β在Al(mal)3中、高剂量组含量分别增加18%、21%（P<0.05），IL-18在Al(mal)3高剂量组的含量增加10%（P<0.05）。与Al(mal)3高剂量组相比，C188-9干预组IL-1β含量差异无统计学意义，IL-18的含量降低23%（P<0.05）。与对照组相比，IL-1β在C188-9干预组的含量差异无统计学意义，IL-18在C188-9干预组的含量降低6%（P<0.05）。抗炎因子IL-10蛋白结果显示，随着染铝浓度的增加，与对照组相比，IL-10表达呈现降低的趋势，但各组间差异均无统计学意义，见图4。
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图 4 各组细胞的促炎因子IL-1β、IL-18和抗炎因子IL-10的含量（n=3）a：与对照组比较，P<0.05；b：与Al(mal)3高剂量组比较，P<0.05。Figure 4. Levels of pro-inflammatory factors IL-1β and IL-18 and anti-inflammatory factor IL-10 in each group (n=3)a: Compared with the control group, P<0.05; b: Compared with the Al(mal)3 high-dose group, P<0.05.3. 讨论
铝是公认的神经系统毒物，铝暴露可引起学习记忆功能损害，同时铝与神经退行性疾病有关[16]。铝神经毒性的机制与氧化应激[17]、炎症反应、tau蛋白增加等有关。有研究表明铝盐促使氧化应激水平增加，炎症反应加重，脑组织损害[18]。研究表明给小鼠注射氢氧化铝，小鼠脑铝增多，小鼠脑中小胶质细胞数量显著增加，神经行为发生变化[19]。上述研究提示铝的神经毒性与小胶质细胞的炎症反应密切相关。
小胶质细胞作为CNS关键的免疫细胞，通过分泌重要的免疫介质如促炎细胞因子IL-1β、IL-6等协调神经炎症[20]。NLRP3具有广泛特异性，是用途最广泛的先天免疫受体。多项研究报道，多种刺激可以激活NLRP3-半胱氨酸蛋白酶（caspase 1, CASP1）炎性体通路并释放促炎因子免疫细胞中的IL-1β，参与先天免疫反应。有研究表明小鼠暴露于铅会增加小鼠海马区小胶质细胞中NLRP3的表达，并且增加了casepase-1剪切体的表达以及IL-1β的表达[21]。研究还表明锰暴露会引起BV2小胶质细胞NLRP3炎症体及相关蛋白表达增高[22]。提示金属离子可以活化小胶质细胞，激活NLRP3炎症小体释放炎症因子。本研究结果中各组BV2细胞中随着Al(mal)3浓度的增加，NLRP3、cleaved-casepase-1和ASC蛋白表达量有不同程度增加；Al(mal)3高剂量组IL-1β和IL-18的含量也有增加（P<0.05）。这表明铝暴露能引起BV2细胞的NLRP3炎症小体的活化，激活炎症反应，并且促炎反应增强。
小胶质细胞分为M1和M2表型，过度的M1激活和M2功能障碍会导致小胶质细胞极化失衡，从而放大神经炎症导致神经元损伤。活化的M1表型可以在体外被诱导表达各种促炎因子，如IL-1β、CD68和CD16[23]。而M2表型可以表达抗炎介质如IL-10和CD206。因此，本研究选取CD68和CD206作为M1和M2的标志物。结果表明与对照组相比，Al(mal)3低、中、高剂量组BV2细胞M1型标志蛋白CD68的表达显著增高，而Al(mal)3高剂量组M2型标志蛋白CD206的表达降低。提示麦芽酚铝可导致小胶质细胞以M1型活化为主。上述结果提示铝可以引起小胶质细胞活化，激活NLRP3炎症小体释放炎症因子。
STAT3与炎症小体的活化有关。STAT3是STAT家族的重要成员，通过磷酸化激活。研究发现鲁索利替尼抑制了蛋白酪氨酸激酶（janus-activated kinase, JAK）表达从而降低了STAT3的磷酸化，从而抑制了NLRP3炎症小体的表达，脑组织中局部STAT3缺乏也降低了NLRP3炎症小体的表达，表明NLRP3炎症小体可能受STAT3通路调控[10]。本研究结果发现Al(mal)3高剂量组STAT3蛋白表达量增高虽未出现显著变化，但p-STAT3蛋白表达量增加，p-STAT3/STAT3值增加，表明铝可能通过激活STAT3从而活化小胶质细胞炎症反应。
为了进一步验证上述结果，本研究利用STAT3的抑制剂C188-9进行干预实验。在对BV2细胞进染毒后，Al(mal)3剂量组细胞活力比对照组显著降低，采用C188-9干预后细胞活力较Al(mal)3高剂量组显著增加，以上结果表明C188-9干预后对BV2细胞具有保护作用。C188-9干预后与Al(mal)3高剂量组相比，C188-9干预组CD68蛋白表达下降，而CD206的蛋白表达升高。C188-9干预组STAT3的蛋白表达基本不变，p-STAT3蛋白的表达降低（P<0.05），p-STAT3/STAT3值降低（P<0.05），NLRP3、cleaved-casepase-1、ASC蛋白表达量降低（P<0.05），IL-18的含量降低（P<0.05），IL-10的含量未见升高。以上这些结果表明STAT3参与小胶质细胞的活化，C188-9抑制了p-STAT3蛋白的表达，从而抑制了NLRP3炎症小体蛋白表达，下调了促炎因子的含量。Ji等[24]研究通过给予STAT3抑制剂（S31-201）等通路的抑制剂研究脑出血后在V-set和免疫球蛋白结构域包含4（V-set and immunoglobulin domain-containing 4, VSIG4）介导的神经炎症作用，发现VSIG4在小鼠脑出血后通过JAK-STAT3-锌指蛋白A20途径减弱NLRP3并改善神经炎症。Wang等[25]在抗抑郁药物米氮平对BV2细胞的作用研究中发现其可以通过抑制BV2小胶质细胞中NLRP3炎症小体的激活来防止异氟醚诱导的促炎因子IL-1β和IL-18的产生。上述研究表明抑制STAT3活化可以抑制NLRP3的活化从而影响促炎因子。本实验中IL-10的作用有待进一步研究。本研究探讨了铝对BV2细胞通过STAT3通路导致炎症反应中炎症因子的变化，但炎症反应的调控机制还有很多，需要进一步研究多种通路对铝致神经炎症反应的作用以及通路与通路间的相互作用。
综上所述，铝能引起BV2小胶质细胞的炎症反应，其机制可能与STAT3调控NLRP3炎症小体分泌炎症因子有关，且BV2细胞的炎症反应以促炎反应为主。
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图 1 各组BV2细胞M1型标志蛋白CD68和M2型标志蛋白CD206的表达（n=3）
a：与对照组比较，P<0.05；b：与Al(mal)3高剂量组比较，P<0.05。
Figure 1. Expression of M1 type marker protein CD68 and M2 type marker protein CD206 in BV2 cells of each group (n=3)
a: Compared with the control group, P<0.05; b: Compared with the Al(mal)3 high-dose group, P<0.05.
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图 2 各组BV2细胞STAT3和p-STAT3蛋白表达情况（n=3）
a：与对照组比较，P<0.05；b：与Al(mal)3高剂量组比较，P<0.05。
Figure 2. Expression of STAT3 and p-STAT3 proteins in BV2 cells of each group (n=3)
a: Compared with the control group, P<0.05; b: Compared with the high-dose group of Al(mal)3, P<0.05.
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图 3 各组BV2细胞NLRP3炎症小体蛋白表达情况（n=3）
a：与对照组比较，P<0.05；b：与Al(mal)3高剂量组比较，P<0.05。
Figure 3. Expression of NLRP3 inflammasome protein in BV2 cells in each group (n=3)
a: Compared with the control group, P<0.05; b: Compared with the high-dose group of Al(mal)3, P<0.05.
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图 4 各组细胞的促炎因子IL-1β、IL-18和抗炎因子IL-10的含量（n=3）
a：与对照组比较，P<0.05；b：与Al(mal)3高剂量组比较，P<0.05。
Figure 4. Levels of pro-inflammatory factors IL-1β and IL-18 and anti-inflammatory factor IL-10 in each group (n=3)
a: Compared with the control group, P<0.05; b: Compared with the Al(mal)3 high-dose group, P<0.05.
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