锰是人类生命活动必需微量元素之一^[1]，是各种生理过程的重要参与者，但过量锰暴露可导致锰中毒。慢性锰中毒主要见于长期吸入锰烟尘的职业人群^[2]。贵州省是一个锰矿大省，目前锰矿储存量位居全国第一。据统计，省内从事锰矿开采加工企业有36家（截至2021年2月），从事锰矿作业的职业人群也在逐年增加^[3]。且随着我国汽油无铅化的普及以及锰矿的开采，环境中锰浓度随之增高，环境人群锰暴露机会增加^[4]。而锰中毒的患者可产生帕金森病样症状，如精神障碍、认知功能障碍及运动障碍等，这些典型症状的出现主要与神经元损伤有关^[5]。据研究，锰暴露工人的神经毒性主诉症状发生率高达32.7%，严重影响着锰暴露职业人群的健康^[6]。

锰暴露后神经递质的分泌出现障碍，这是锰中毒引起神经损伤的重要原因之一。那么锰暴露是如何影响递质的分泌，现在还没有确切的结论。Sec1/Munc18-like（SM）蛋白是一类在膜泡运输、神经递质释放中起着重要调控作用的亲水性蛋白质，能够与Ｎ-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor, SNAREs）复合体中的细胞突触融合蛋白（Syntaxin）蛋白结合，调节SNAREs复合体的装配，并与SNAREs协同促进整个膜融合过程，这对神经递质分泌十分重要^[7]。而SM蛋白可以分为四个亚家族，突触融合蛋白结合蛋白18-1（synapse fusion protein binding protein 18-1, Munc18-1）是SM蛋白家族在脑中起主要作用的亚型，在多种膜融合和膜转运过程中扮演重要角色^[8-9]。突触前膜胞内蛋白13-1（presynaptic membrane intracellular protein 13-1, Munc13-1）在近年的研究中被发现与Munc18-1共同作用于SNAREs复合体的组装和形成，在神经递质释放的过程中同样发挥重要作用^[10]。目前，有学者指出锰中毒可干扰SNAREs复合物的形成来影响神经递质的分泌^[11]，但是这个过程是否与Munc18-1和Munc13-1蛋白有关？Munc18-1和Munc13-1与SNAREs复合物形成密切相关的蛋白是否参与锰致神经毒性的过程？目前尚未见相关报道。

因此，本实验采用氯化锰（MnCl₂）作用于人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y细胞），从体外细胞层面，观察染锰对SH-SY5Y细胞Munc18-1、Munc13-1、Syntaxin蛋白的影响，探索锰中毒致神经递质分泌障碍的机制，为丰富锰中毒致神经损伤的分子机制提供依据。

1.   材料与方法

1.1   细胞株

SH-SY5Y细胞株来源于中国典型培养物保藏中心，批号：AC18001424。

1.2   实验试剂和仪器

MnCl₂、DMSO（美国Sigma），胎牛血清、DMEM培养液、胰蛋白酶（美国Gibco），青链霉素、MTT细胞毒性检测试剂盒、MTT蛋白浓度测定试剂盒（中国索莱宝生物），人多巴胺（dopamine, DA）酶联免疫试剂盒（中国基因美生物），兔抗Syntaxin 1、Munc13-1、Munc18-1、β-actin（内参）多克隆抗体（英国Abcam）。酶标仪（Multiskan，美国Themo Scientific），CO₂培养箱（HERAcell，美国Themo Scientific），显微镜（TE2000-U，日本Nikon），高速冷冻离心机（5417R，德国Eppendorf），凝胶成像仪（Chemi Doc^TMXRS⁺，美国Bio-Rad），基础电泳仪（PowerPac Basic，美国Bio-Rad），实时荧光定量PCR仪（CFX96，美国Bio-Rad）。

1.3   实验方法

1.3.1   细胞培养和实验分组

将SH-SY5Y细胞复苏后进行传代培养，接种于含10%胎牛血清、100 IU·mL⁻¹青霉素、100 μg·mL⁻¹链霉素的DMEM高糖培养基中，37 ℃、5% CO₂条件下培养。待细胞生长状态最佳时加入含MnCl₂的培养液，锰处理浓度分别为0、50、100、200、400、600、800 μmol·L⁻¹ 7种浓度，根据预实验细胞存活率（MTT法）的结果及参考文献[12-13]，正式实验设置对照组（0 μmol·L⁻¹ MnCl₂）、低浓度染锰组（100 μmol·L⁻¹ MnCl₂）、中浓度染锰组（200 μmol·L⁻¹ MnCl₂）、高浓度染锰组（400 μmol·L⁻¹ MnCl₂）。染毒24 h后，收集细胞进行后续实验。

1.3.2   MTT法检测细胞增殖

将SH-SY5Y细胞悬液按照5×10⁴个·mL⁻¹的密度接种到96孔板中（100 μL·孔⁻¹），放入5% CO₂培养箱37 ℃培养过夜。待细胞贴壁后，观察其密度及生长状态，弃去96孔板中的培养液，用含不同浓度（0、100、200、400 μmol·L⁻¹）MnCl₂的培养液处理细胞，24 h后每孔加入20 μL MTT工作液（避光操作），继续培养4 h，弃除掉所有含MTT工作液的培养基，每孔中添加DMSO 150 μL，至结晶完全溶解，并用酶标仪于490 nm处检测光密度（D）值，计算细胞的存活率。细胞存活率（%）=D_{实验组均值}/D_{对照组均值}×100%。

1.3.3   DA质量浓度（浓度）的测定

当细胞贴壁生长至80%左右时，加入MnCl₂染毒，24 h后收集细胞培养液于﹣80 ℃保存。按照酶联免疫吸附试验试剂盒操作说明书，配制标准品制作标准曲线、每孔加样、加酶、温育、洗涤、显色、终止。

1.3.4   实时荧光定量PCR法检测目标基因表达水平

细胞培养结束后，用Trizol法提取细胞总RNA，按照说明书反转录为cDNA。使用 TB Green™Premix Ex Taq™ Ⅱ实时定量PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR分析，Syntaxin-1基因的特异引物见表1。20 μL反应体系：TB Green™Premix Ex Taq™ Ⅱ 10 μL，正向、反向引物各 0.8 μL，RNase Free dH₂O 6 μL，cDNA模板 2 μL，去干扰荧光染料 Rox Reference Dye 0.4 μL。扩增反应程序：95 ℃ 预变性30 s，95 ℃变性5 s，52 ℃退火35 s，72 ℃延伸90 s，共40个循环。用2^−ΔΔCt方法计算Syntaxin-1基因的相对表达量。

表  1  引物序列信息（5’-3’）

Table  1.  Information of primer sequence (5'-3')

基因(Gene)	引物(Primer)
Syntaxin-1	正向(Forward)：TGATGATGATGTCGCTCTCACC
	反向(Reverse)：TGTCAATGAAGCCTCGAATCTCC
β-actin	正向(Forward)：CTCCATCCTGGCCTCGCTGT
	反向(Reverse)：GCTGTCACCTTCACCGTTCC

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1.3.5   Western blotting法检测目标蛋白的表达

用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，使用BCA蛋白试剂盒进行蛋白浓度测定，测定后统一定量至2 g·L⁻¹。加入蛋白上样缓冲液，100 ℃变性8 min。用SDS-PAGE电泳、转膜后，5%的脱脂奶粉室温封闭2 h，兔抗人多克隆抗体（1∶2000）一抗4 ℃孵育过夜后，第2天洗涤后加辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗（1∶3 000）室温下孵育2 h，充分洗涤后将ECL均匀覆盖在PVDF膜上，避光反应5 min，使用凝胶成像仪拍摄图像，采用Image J （V1.8.0）软件对蛋白条带进行灰度分析。

1.4   统计学分析

用SPSS 20.0建立数据库进行统计分析。对实验数据进行正态性检验和方差齐性检验，非正态性分布的数据对其进行对数转换，结果均以$\overline x\pm s $表示。用单因素方差分析检验组间差异，进行两两比较时，方差齐，用LSD检验；方差不齐，用Games-Howell检验。指标相关性分析用Pearson检验。检验水准α=0.05。

2.   结果

2.1   不同浓度的MnCl₂对SH-SY5Y细胞存活率的影响

MnCl₂染毒24 h后，对照组、各染毒组细胞存活率分别为100%、（94.27±7.13）%、（89.65±8.41）%、（77.07±3.02）%。与对照组比，中、高浓度染锰组细胞存活率明显下降（P<0.05）；与低、中浓度染锰组比，高浓度染锰组细胞存活率明显下降（P<0.05）。

2.2   各组细胞培养基中DA浓度

经MnCl₂染毒24 h后，与对照组和低浓度染锰组比，中、高浓度染锰组分泌到培养基中的DA浓度均明显下降（P<0.05），见图1。

图  1  锰染毒后多巴胺浓度（A）和Syntaxin-1 mRNA表达水平（B）（$ \bar x\pm \mathit{s} $，n=3）

*：与对照组比较，P<0.05，#：与低浓度染锰组比较，P<0.05。

Figure  1.  Dopamine level (A) and Syntaxin-1 mRNA expression level (B) after manganese exposure ($\bar x\pm \mathit{s} $, n=3)

* : Compared with the control group, P<0.05, # : Compared with the low-dose manganese group, P<0.05.

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2.3   Syntaxin-1 mRNA表达水平

经MnCl₂染毒24 h后，Syntaxin-1 mRNA表达在所有浓度组中差异未见统计学意义（P＞0.05），见图1。

2.4   Munc18-1、Munc13-1和Syntaxin-1的蛋白表达水平

经MnCl₂染毒24 h后，各浓度组Munc13-1、Munc18-1 和Syntaxin-1蛋白表达水平见图2。与对照组比较，低、中、高浓度染锰组Munc13-1的蛋白表达量逐渐降低，以中、高浓度染锰组降低显著（P＜0.05）；与低浓度染锰组比较，高浓度染锰组Munc13-1的蛋白表达量明显减少（P＜0.05）；与中浓度染锰组比较，高浓度染锰组Munc13-1的蛋白表达量变化不明显。与对照组比较，低、中、高浓度染锰组Munc18-1的蛋白表达量上升（P＜0.05）；与低浓度染锰组比较，中、高浓度染锰组Munc18-1的蛋白表达量明显升高（P＜0.05）；与中浓度染锰组比较，高浓度染锰组Munc18-1的蛋白表达量明显升高（P＜0.05）。在所有浓度组中，Syntaxin-1的蛋白表达均不具有统计学差异（P＞0.05）。

图  2  锰染毒后Munc18-1、Munc13-1和Syntaxin-1蛋白相对表达量（$ \bar x\pm \mathit{s} $，n=3）

A：不同浓度MnCl₂染毒24 h蛋白条带图；B：不同染毒浓度组蛋白相对表达量直条图。*：与对照组比较，P<0.05；#：与低浓度染锰组比较，P<0.05；☨：与中浓度染锰组比较，P<0.05。

Figure  2.  Relative expression levels of Munc18-1, Munc13-1, and Syntaxin-1 proteins after manganese exposure ($\bar x\pm s $, n=3)

A: Protein bands at 24 h after exposure to MnCl₂ at different concentrations; B: Bar chart of histone relative expression at different concentrations. *: Compared with the control group, P<0.05; #: Compared with the low-dose manganese group, P<0.05; ☨: Compared with the medium-dose manganese group, P<0.05.

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2.5   指标相关性分析

结果显示，MnCl₂染毒浓度与Munc13-1蛋白表达呈负相关（r=−0.898，P＜0.05），与Munc18-1蛋白表达呈正相关（r=0.678，P＜0.05）；DA浓度与Munc13-1蛋白表达呈正相关（r=0.932，P＜0.05），与Munc18-1蛋白表达呈负相关（r=−0.817，P＜0.05）。

3.   讨论

DA是儿茶酚胺类神经递质，调控着中枢神经系统多种生理功能^[14]。研究提示，许多神经退行性疾病可能与DA失衡有关^[15-16]。本实验观察到，随着MnCl₂浓度增加，SH-SY5Y细胞培养基中的DA浓度呈逐渐降低的趋势，说明MnCl₂的染毒抑制了神经细胞中DA的释放。Syntaxin-1是SNAREs复合物的重要组成部分^[17]，而SNAREs复合物是神经递质释放和分泌过程中的核心成分。本研究显示，SH-SY5Y神经细胞在锰染毒后，在mRNA水平，与正常对照组比较，染锰组Syntaxin-1 mRNA表达量的差异没有统计学意义。Western blotting检测其蛋白表达情况，与正常对照组比较，染锰组Syntaxin-1的蛋白表达量没有明显变化。由此可见，无论是从基因还是蛋白水平，锰染毒对Syntaxin-1的表达量均无明显影响，推测锰中毒致DA分泌减少不是通过影响Syntaxin-1表达产生的。

Munc18-1和Munc13-1蛋白在多种膜融合和膜转运过程中扮演重要的角色。据研究，Munc18-1可抑制神经递质的释放。例如，在突触前神经细胞中加入Munc18-1的部分肽段后，能够明显抑制突触囊泡的融合^[12]；而Munc13-1促进神经递质的释放，实验证实敲除Munc13-1会导致神经元功能以及神经递质分泌的缺陷^[18]。同时，Munc18-1和Munc13-1与Syntaxin-1之间的联系近年来也逐渐得到证实。据报道，敲除PC12细胞中Munc18-1基因，发现Syntaxin-1失去膜定位，杂乱的堆积在核周边，在表达野生型Munc18-1后恢复了Syntaxin-1的错位分布^[19-20]。另有研究发现，Munc13-1可以与Syntaxin-1蛋白linker区域的RI残基相互作用，使Syntaxin-1的复合物转变为开放状态，故Munc18-1和Munc13-1还可能在空间构象上影响Syntaxin-1^[21-22]。故本研究对Munc18-1和Munc13-1蛋白进行检测，结果显示，与对照组相比，Munc13-1蛋白的表达随着染锰浓度的增加呈递减趋势，Munc18-1蛋白的表达呈增长趋势，而且Munc13-1与Munc18-1的变化均与DA分泌的减少存在一定相关性。

结合上述结果，本研究推测，虽然在24 h这个时间段上，Syntaxin-1的基因和蛋白的表达量在锰染毒后与对照比较无变化，但其有可能受到Munc18-1和Munc13-1调控，发生构象上的改变，间接影响SNAREs复合物的形成，降低DA的释放。那么，在锰染毒中，Munc18-1和Munc13-1是如何影响Syntaxin-1构象变化的，具体机制有待进一步研究。

综上，本研究发现了锰染毒SH-SY5Y细胞致多巴胺的分泌抑制，与其上调Munc18-1和下调Munc13-1蛋白的表达水平有关，这可能影响Syntaxin-1构象变化，成为锰致神经损伤的原因之一。