Effect of exogenous trivalent iron ions on tau phosphorylation and aggregation in SH-SY5Y cells
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摘要:背景
脑内大量的铁沉积可通过氧化应激、神经炎症、线粒体功能异常引发神经元损害。铁沉积与阿尔茨海默病（AD）的病理发生也密切相关，tau蛋白过度磷酸化导致的神经原纤维缠结是AD的重要病理特征之一。
目的探讨外源性三价铁离子对人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y细胞）活性及tau过度磷酸化和聚集的影响。
方法采用Fe3+浓度为10、100、200和400 mg·L−1的三氯化铁（FeCl3）处理SH-SY5Y细胞，通过CCK8法检测细胞存活率。用10和200 mg·L−1染毒24 h，通过普鲁士蓝（Perl's）铁染色法测定胞内铁含量。转染tau-P301L质粒构建tau过表达的AD样细胞模型，10、200 mg·L−1染毒SH-SY5Y细胞及tau过表达的SH-SY5Y细胞24 h后，采用免疫印迹检测磷酸化tau（p-tau）蛋白表达的差异。将磷酸缓冲盐溶液（PBS）稀释后的FeCl3、人源性tauR3及FeCl3和tauR3共同在37 ℃孵育，通过硫磺素T（ThT）荧光定量法在12、24、36、48、60、72、84和96 h检测荧光强度，反映tau蛋白聚集水平。同时，FeCl3和tauR3共同孵育96 h后，在透射电子显微镜（TEM）下观察tau聚集形成纤维的情况。
结果FeCl3染毒SH-SY5Y细胞24 h后，各组间细胞存活率的差异有统计学意义（
F =8.63，P < 0.01）。200、400 mg·L−1染毒组细胞存活率分别是对照组的80.1%、68.7%（P < 0.05）。与对照组细胞相比，胞内铁染色后200 mg·L−1染毒组细胞胞浆主要呈黄褐色，且200 mg·L−1 染毒组阳性细胞率增加12.9%（P < 0.01）。FeCl3染毒SH-SY5Y细胞24 h后，各组间p-tau（Ser396）表达有统计学意义（F =11.6，P < 0.01）。与对照组相比，200 mg·L−1染毒组p-tau（Ser396）蛋白表达量上调72.7%（P < 0.01）。FeCl3染毒tau过表达的SH-SY5Y细胞24 h后，各组间p-tau（Ser396）表达有统计学意义（F =27.8，P < 0.01）。与tau组相比，tau + 200 mg·L−1染毒组p-tau（Ser396）蛋白表达量上调44.6%（P < 0.05）。tauR3和FeCl3共同孵育84和96 h后tauR3 + FeCl3组荧光强度比tauR3组增加49.9%和53.7%（P < 0.01）。TEM下也观察到孵育96 h后，与tauR3组相比，FeCl3 + tauR3组聚集加重，且形成tau纤维沉积。结论外源性三价铁离子可能抑制SH-SY5Y细胞活性，促进转染tau-P301L质粒的SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化，且加重了tauR3的聚集和纤维的产生。
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关键词:
- SH-SY5Y细胞 /
- 外源性三价铁离子 /
- 神经原纤维缠结 /
- tau蛋白过度磷酸化 /
- tau蛋白聚集
Abstract:BackgroundA large amount of iron deposition in the brain can cause neuronal damage by inducing oxidative stress, neuroinflammation, and abnormal mitochondrial function. In addition, iron deposition is also reported to be closely related to the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). The neurofibrillary tangles aggregated by tau hyperphosphorylation are one of the important pathological features of AD.
ObjectiveTo investigate potential effect of exogenous trivalent iron ions on neuronal activity in human neuroblastoma (SH-SY5Y) cells and tau hyperphosphorylation and aggregation.
MethodsSH-SY5Y cells were treated with ferric chloride (FeCl3) at four concentrations (10, 100, 200, and 400 mg·L−1). Cell survival rate was then detected by CCK8 assay. Intracellular iron content was determined prussian blue (Perl's) by iron staining after 24 h exposure to FeCl3 at 10 or 200 mg·L−1. Transfection of tau-P301L plasmid was conducted to construct an AD-like cell model for tau overexpression. The differences in the expression of the phosphorylated tau (p-tau) protein in SH-SY5Y cells and SH-SY5Y cells with tau overexpression were detected by Western blotting after 24 h exposure to FeCl3 at 10 and 200 mg·L−1. After dilution with phosphate buffered saline (PBS), FeCl3, human tauR3, and FeCl3 + tauR3 were incubated at 37℃, and the fluorescence intensity reflecting tau aggregation level was measured by thioflavin T(ThT) method at 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, and 96 h, respectively. Meanwhile, after 96 h coincubation of FeCl3 and tauR3, the fibers formed by tau aggregation were observed under a transmission electron microscope (TEM).
ResultsAfter 24 h of FeCl3 exposure, the cell survival rate of SH-SY5Y cells among all groups was statistically different (
F =8.63,P <0.01). The cell survival rates in the 200 and 400 mg·L−1 groups were 80.1% and 68.7% of the control group, respectively (P <0.05). Compared with the control group, the nuclei of the 200 mg·L−1 FeCl3 group were mainly yellowish-brown after iron staining and the positive cell rate was up-regulated by 12.9% (P <0.01). After 24 h of FeCl3 exposure , the p-tau (Ser396) protein expression was statistically different among all groups (F =11.6,P <0.01). Compared with the control group, the p-tau protein expression level of SH-SY5Y cells in the 200 mg·L−1 group was up-regulated by 72.7% (P <0.01). After FeCl3-treated SH-SY5Y cells with tau overexpression for 24 h, the p-tau (Ser396) protein expression was statistically different among all groups (F =27.8,P <0.01). Compared with the tau group, the p-tau (Ser396) protein expression level of SH-SY5Y cells in the tau + 200 mg·L−1 group was up-regulated by 44.6% (P <0.05). Compared with the tauR3 group, the fluorescence intensities in the 84 and 96 h tauR3 + FeCl3 groups were up-regulated by 49.9% and 53.7% (P <0.01) respectively. After 96 h of coincubation, compared with the tauR3 group, FeCl3 + tauR3 aggravated tau aggregation and formed fiber deposition under TEM.ConclusionExogenous trivalent iron ions may inhibit SH-SY5Y cell viability, promote the phosphorylation of tau in SH-SY5Y cells transfected with tau-P301L plasmid, and aggravate tauR3 aggregation and fiber production.
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正常情况下，铁在维持机体正常生理功能中起着重要的作用，如参与细胞代谢、酶促反应及神经递质合成等生理活动；同时，铁也是血红蛋白、肌红蛋白等蛋白的重要组成部分，参与氧气和二氧化碳的运输[1-3]。然而当机体发生铁代谢功能紊乱时，会诱导氧化应激反应、细胞损伤和神经毒性等，进而影响中枢神经系统功能[1，4]。目前发现，脑内铁沉积与神经退行性疾病如阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）的发生发展密切相关[2]。有研究表明AD患者脑组织中的神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles, NFTs）与铁沉积存在良好的共定位[5]，而NFTs是AD最主要的脑病理特征之一[6]，NFTs主要是由神经元胞内过度磷酸化tau蛋白（hyperphosphorylated tau protein, p-tau）的聚集产生[7]。在正常神经元内，tau主要存在于轴突中[8]，维持着细胞微管蛋白的稳定[9-10]。p-tau是tau蛋白翻译后修饰最常见的形式[11]，tau蛋白的过度磷酸化促使其从微管脱离，聚集形成配对的螺旋纤维，进一步聚积诱导产生NFTs，最终导致轴突运输的障碍和神经元的损害及死亡[12-13]。
近年来，越来越多的研究聚焦到AD与铁的关系，磁共振成像显示AD患者海马、尾状核及苍白球等特定脑区铁的含量高于正常老化的脑区[14]。而且有研究报道，给予APP/PS1小鼠饮高剂量的含铁水可以加重学习和记忆能力损害[15]。然而，具体机制尚不明确，本研究通过外源性给予FeCl3干预，观察外源性三价铁离子对人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y细胞）活性及p-tau表达的影响，并通过FeCl3与tauR3共同孵育检测了外源性三价铁离子对tau聚集的改变，其中tauR3是tau蛋白聚集的核心片段，二者共孵育模拟了AD患者脑内铁与tau相互作用。
1. 材料与方法
1.1 仪器和试剂
SH-SY5Y细胞（来源于武汉博士德，中国），FeCl3（麦克林，中国），RPMI 1640培养基（Hyclone，美国），胎牛血清（Excell Bio，澳大利亚），青-链霉素混合液、胰蛋白酶、磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline, PBS）、RIRP裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、高灵敏度化学发光检测试剂盒、5×loading buffer缓冲液、Tris-glycine-SDS电泳缓冲液、山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG、β-actin抗体（武汉博士德，中国），Lipo 8000转染试剂、Cell Counting Kit-8（CCK8）检测试剂盒、蛋白marker（碧云天，中国），10×电泳转移缓冲液、20×TBST缓冲液、普鲁士蓝（Perl's）染色试剂盒（增强型）（北京索莱宝，中国），p-tau（Ser396）抗体（abcam，美国），硫磺素T（Thioflavin T, ThT）（Abcam，美国），tau-P301L质粒（淼灵生物，中国）。
CO2恒温细胞培养箱（SANYO，日本），高速冷冻离心机（Eppendorf，德国），荧光显微镜（Olympus，日本），酶标仪（Bio Tek，美国），摇床（其林贝尔，中国），电泳仪及转膜仪（BIO-RAD，美国），凝胶成像系统（Azure Biosystems，美国），透射电子显微镜（JEM-1011，日本）。
1.2 细胞培养及处理
1.2.1 细胞培养
SH-SY5Y细胞培养于37 ℃的5% CO2细胞培养箱中，用含有15%胎牛血清和1%青-链霉素混合液的RPMI 1640培养基培养。次日换液，第三天用PBS冲洗并用0.25%的胰蛋白酶消化传代。
1.2.2 tau-P301L质粒转染
SH-SY5Y细胞接种至6孔板，每孔含1×106个细胞。次日换液，每孔加入125 μL 1640培养基、2.5 μg tau-P301L质粒和4 μL转染试剂。24 h后在荧光显微镜下检测转染效果，观察标记的荧光蛋白及出现荧光的细胞数量。
1.2.3 FeCl3染毒
将FeCl3溶解在完全培养基中，参考Askri等[16]给予Fe3+浓度为10、100、200和400 mg·L−1的FeCl3进行染毒，同时设立对照组。
1.3 CCK8法检测细胞活性
取对数生长期的细胞制备细胞悬液，接种于96孔板中，每孔含1×10⁴个细胞。24 h后分别加入Fe3+浓度为0、10、100、200和400 mg·L−1的FeCl3，参考Zhang等染毒24 h后，检测细胞活力[17]。每孔缓慢加入100 μL含10% CCK8溶液的完全培养基，避免产生气泡，1.5 h后用酶标仪测定450 nm处的光密度值，计算细胞的存活率。
1.4 Perl's染色法
Perl's染色法主要显示三价铁，不显示二价铁，三价铁与酸化的亚铁氰化钾溶液反应生成普鲁士蓝沉淀，对于含铁量不丰富的组织和细胞，利用级联放大原理对结果进行放大显示，阳性细胞（含铁细胞）为黄棕色或黄褐色，常规细胞为红紫色或蓝色。取对数生长期的细胞制备细胞悬液，接种于12孔板中，每孔含1×105个细胞。24 h后分别加Fe3+浓度为0、10和200 mg·L−1的FeCl3。染毒24 h后4%多聚甲醛固定，蒸馏水冲洗；滴加Perl's染色工作液（Perl's A液：Perl's B液=1∶1），37 ℃孵育20 min；蒸馏水轻轻冲洗，再滴加孵育工作液（孵育浓缩液∶孵育稀释液=1∶9）；37 ℃孵育15 min，1×PBS浸洗，滴加增强工作液（增强A液：增强B液=19∶1），37 ℃孵育15 min；1×PBS浸洗，滴加复染液染色；蒸馏水浸洗。乙醇梯度脱水，二甲苯透明，镜检。
1.5 免疫印迹检测蛋白水平
参考Ye等方法通过检测p-tau含量以观察tau的磷酸化水平[18]。Fe3+浓度为0、10、200 mg·L−1 的FeCl3染毒SH-SY5Y细胞及转染tau-P301L质粒后tau过表达的SH-SY5Y细胞，即分为对照组，10 mg·L−1 染毒组，200 mg·L−1染毒组，tau组，tau+10 mg·L−1 染毒组和tau+200 mg·L−1 染毒组，24 h后收集细胞，并加含1%磷酸酶抑制剂和1%蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，4 ℃放置15 min充分裂解，离心半径6 cm，13000 r·min−1、4 ℃离心25 min，取裂解上清测蛋白浓度，参考BCA蛋白定量试剂盒说明书。调齐各样品蛋白浓度后，按照说明加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100 ℃高温变性5 min，冷却至温室。样品经12% SDS-PAGE凝胶电泳，电泳参数设置为浓缩胶80 V，30 min；分离胶110 V，90 min。接着半干式转至PVDF膜上，在5%脱脂奶粉中室温封闭2 h，并放于摇床上。剪取目的条带，放于一抗中，4 ℃摇床孵育过夜。次日TBST洗涤4次，每次10 min；再用二抗常温孵育90 min；TBST洗涤5次，每次10 min。最后，对洗涤后的条带进行ECL化学发光显影。
1.6 ThT荧光定量法检测荧光强度
设置对照组、tauR3组、FeCl3组和FeCl3+tauR3组共四组，tauR3组为20 μmol·L−1 tauR3，20 μmol·L−1 ThT和5 μmol·L−1肝素共孵育。FeCl3组加入10 μmol·L−1 FeCl3、20 μmol·L−1 ThT和5 μmol·L−1肝素；FeCl3 + tauR3组加入10 μmol·L−1 FeCl3、20 μmol·L−1 tauR3、20 μmol·L−1 ThT和5 μmol·L−1肝素；对照组加PBS。上述每组样品取200 μL加至不透明的96孔板，37 ℃孵育，重复三次实验。ThT荧光在440 nm被激发，在12、24、36、48、60、72、84和96 h于480 nm处检测并记录荧光强度。
1.7 TEM观察tau聚集
设置tauR3组和FeCl3 + tauR3组共两组，tauR3组加入20 μmol·L−1 tauR3和5 μmol·L−1肝素；FeCl3 + tauR3组加入10 μmol·L−1 FeCl3、20 μmol·L−1 tauR3和5 μmol·L−1肝素，两组样品在37 ℃孵育96 h后各取10 μL加到200目铜网，室温静置3 min，用滤纸吸掉多余样品，用1%磷钨酸负染2 min，静置20 min，电子显微镜下观察聚集并拍照。
1.8 统计学分析
通过SPSS 22.0和Graphpad Prism 8进行统计学分析并作图，数据以
$\bar{x}\pm s $ 表示，采用one-way ANOVA方差分析和重复测量方差分析进行组间比较，通过Tukey检验进行多重比较，检验水准α=0.05。2. 结果
2.1 FeCl3对SH-SY5Y细胞活性的影响
外源性三价铁离子染毒24 h后，FeCl3处理各组间细胞活性的差异有统计学意义（F=8.63，P < 0.01）。200、400 mg·L−1染毒组细胞存活率分别为80.1%、68.7%，与对照组相比，细胞活性明显降低（P < 0.05）。见图1。
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图 1 FeCl3染毒后SH-SY5Y细胞存活率与对照组比较，*：P < 0.05，**：P < 0.01。Figure 1. SH-SY5Y cell survival rate after exposure to FeCl3Compared with the control group, *: P < 0.05, **: P < 0.01.2.2 FeCl3染毒对SH-SY5Y细胞内铁含量的影响
铁染色结果显示，对照组细胞核与胞浆多为紫蓝色；10 mg·L−1 染毒组细胞核少数为黄棕色，多为紫蓝色；而200 mg·L−1 染毒组细胞核与胞浆多呈黄棕色或褐色，见图2A，说明胞内为三价铁。各组间阳性细胞率差异有统计学意义（F=17.7，P < 0.01）。与对照组相比，200 mg·L−1 染毒组阳性细胞率增加12.9%（P < 0.01），见图2B。
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图 2 FeCl3染毒后SH-SY5Y细胞内铁含量**：与对照组比较，P < 0.01。A：Perl's染色图；B：阳性细胞相对表达量。Figure 2. SH-SY5Y cell iron content after exposure to FeCl3**: Compared with the control group, P < 0.01. A: Perl's staining; B: Positive cell rate.2.3 FeCl3对SH-SY5Y细胞p-tau蛋白的影响
FeCl3染毒SH-SY5Y细胞24 h后，各组间p-tau（Ser396）表达差异有统计学意义（F=11.6，P < 0.01)。与对照组相比，200 mg·L−1 染毒组p-tau（Ser396）蛋白表达量上升72.7%（P < 0.01）。见图3A、3B。
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图 3 FeCl3染毒后p-tau蛋白表达水平A、C：免疫印迹图；B、D：p-tau蛋白相对表达量。与对照组比较，**：P < 0.01；***：P < 0.001；#：与tau组比较，P < 0.05。Figure 3. Expression levels of p-tau protein after exposure to FeCl3A and C: Western blotting bands; B and D: Relative expressionlevel of p-tau. Compared with the control group, **: P < 0.01, ***: P < 0.001; #: Compared with the tau group, P < 0.05.SH-SY5Y细胞过表达tau后，FeCl3染毒24 h，各组间p-tau（Ser396）表达差异有统计学意义（F=27.8，P < 0.01）。神经元tau蛋白的过度磷酸化被认为是AD重要的病理特征之一，也是临床诊断的重要指标，通过检测p-tau含量观察tau的磷酸化水平。与对照组相比，tau、tau+10 mg·L−1、tau+200 mg·L−1 三组p-tau（Ser396）蛋白表达量分别上升276%、344%和418%（P < 0.01）。提示tau过表达AD样细胞模型构建成功，同时，与tau组相比，tau+200 mg·L−1染毒组p-tau（Ser396）蛋白表达量上升44.6%（P < 0.05）。见图3C、3D。
2.4 FeCl3对tau核心片段tauR3聚集的影响
ThT荧光定量法显示，FeCl3组与对照组相比没有明显差异，提示FeCl3不会引发ThT荧光强度增强，而与对照组相比，12、24、36、48、60、72、84和96 h tau组荧光强度增加123%、150%、167%、179%、186%、198%、185%和199%（P < 0.001），提示12 h后tauR3发生聚集。此外，与tau组相比，84和96 h时tau+FeCl3组荧光强度增加49.9%和53.7%（P < 0.01），见图4A。TEM结果也显示FeCl3和tauR3共孵育聚集加重，且形成tau纤维的沉积，见图4B和4C。
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图 4 FeCl3染毒后tauR3聚集情况A：相对荧光强度；B、C：tauR3组、tauR3+FeCl3组TEM结果图。***：与对照组比较，P < 0.001；##：与tauR3组比较，P < 0.01。Figure 4. tauR3 aggregation after exposure to FeCl3A: Relative fluorescence intensity; B and C: TEM observation of the tauR3 group and the tauR3+FeCl3 group. ***: Compared with the control group, P < 0.001; ##: Compared with the tauR3 group, P < 0.01.3. 讨论
铁是地壳中含量仅次于铝的第二丰富的金属[4]。在人类活动和自然环境的共同作用下，我国部分地区地下水铁含量明显超标[19-20]。饮用水中的铁过量，容易在机体中积累造成慢性中毒[21]。虽然铁是人体必不可少的微量元素，但过量的铁仍会引发机体异常，甚至出现相关代谢性疾病。正常情况下，铁被人体吸收后，可以通过血脑屏障进入脑中，主要以Fe3+的形式与转运蛋白结合被细胞所摄取[22-23]。而当脑内铁稳态失衡尤其铁超载，导致胞内铁代谢异常，会引发神经毒性。已有研究表明，胞内Fe3+含量过多，会发生芬顿反应，进而产生Fe2+和活性氧，诱导氧化应激，损伤神经元[4]。随年龄增长，脑内容易出现铁过量，引起不同脑区铁沉积，最终出现认知功能的受损[24]。最新有研究发现，高铁饮食干预APP/PS1小鼠，加重认知损害，且脑中tau含量明显增高[25]，说明铁过量可能和AD的tau病理有关。但铁与AD的tau病理之间的关系及相互作用机制不清楚，本研究着重在体外模型及分子生物学上进行验证，观察外源性Fe3+是否具有抑制神经元活性和促进tau磷酸化、聚集的作用。
外源性给予细胞三价铁离子如氯化铁、柠檬酸铁铵等是构建细胞铁超载模型最常用的方式之一。为了证实铁引起的tau蛋白磷酸化和聚集是铁影响SH-SY5Y细胞活性的因素，首先需要证实tau蛋白有抑制神经元细胞活性的作用。SH-SY5Y细胞过表达tau是体外实验中研究AD及其他神经退行性疾病的经典细胞模型[26]。Zhao等[27]已经证实通过观察SH-SY5Y细胞过表达tau的细胞毒性实验，发现与SH-SY5Y细胞对照组相比，tau过表达后神经元细胞活性明显受到抑制。因此，本研究首先通过CCK8法观察了不同浓度FeCl3对SH-SY5Y细胞活性的研究，结果显示随着FeCl3浓度升高，细胞活力逐渐下降，且Fe3+在200 mg·L−1浓度及以上时细胞活性明显降低，这一结果从体外实验验证了铁过量诱导神经元损伤的可能浓度，为后续FeCl3干预浓度的选择奠定重要的实验基础。同时，提示FeCl3对神经元细胞活性有抑制作用，与tau过表达后抑制细胞活性一致[27]，且神经元损伤程度与FeCl3浓度呈剂量依赖性升高。接着，需要证实的是FeCl3是否参与tau蛋白的磷酸化和聚集。
tau蛋白的异常聚集是诱导AD脑内NFTs产生的主要缘由[7]。AD患者脑组织中NFTs与铁沉积共定位[5]提示铁可能促进NFTs的形成，那么FeCl3诱导神经元活性下降是否与tau的磷酸化和异常聚集有关呢？tau蛋白表达异常最常见的突变基因之一是17号染色体tau-P301L突变[28]。tau-P301L突变可以引发蛋白在396残基上的磷酸化，其主要发生在tau蛋白功能异常的早期阶段，与tau蛋白聚集关系密切[29]，在AD病理中也发挥着重要作用[30]。因此，本研究分别给予SH-SY5Y细胞以及tau-P301L质粒转染的SH-SY5Y细胞FeCl3染毒，选用p-tau（Ser396）抗体通过免疫印迹观察了FeCl3对神经元p-tau表达的影响。首先我们发现与对照组相比，200 mg·L−1 染毒组SH-SY5Y细胞p-tau蛋白表达量显著上调，提示上述FeCl3抑制SH-SY5Y细胞活性可能与FeCl3诱导的p-tau蛋白表达升高有关。然后构建tau蛋白异常磷酸化的AD样细胞模型，通过转染tau-P301L质粒增加SH-SY5Y胞内p-tau含量[31]，促使其从微管蛋白上脱落，形成游离状态[32]，神经元tau蛋白的过度磷酸化被认为是AD重要的病理特征之一，也是AD临床鉴别诊断重要标记物[33]，参考Ye等我们通过检测p-tau含量观察了tau的磷酸化水平，以反映神经元损害程度[18]。结果也显示，与tau组相比，tau + 200 mg·L−1 染毒干预组p-tau蛋白表达量显著升高，也证实了外源性三价铁离子促进了tau蛋白过度磷酸化，结合上述Zhao等[27]证实过表达tau（P301L）抑制神经元细胞活性，那么提示外源性三价铁离子可能通过诱导神经元p-tau蛋白表达升高，进而抑制神经元的细胞活性。
tau蛋白共有六个亚型（N0R3、N1R3、N2R3、N0R4、N1R4、N2R4）[34]，组成的氨基酸为352~441个[35]。tau蛋白共有四个区域：n端区域、富含脯氨酸区、微管蛋白结合区域和C端区域[35-36]，微管蛋白区域包括三（R1、R3、R4）或四（R1~R4）个重复肽，其中R3的聚集浓度最低，速度最快，存在于六个亚型中[37-38]，是引发聚集的核心片段，因此本研究选用tauR3片段做聚集实验。ThT实时荧光定量检测显示，在一定时间范围内，随时间延长，tauR3孵育荧光强度逐渐增强，发生聚集反应，而单独FeCl3孵育ThT荧光强度未发生明显变化，说明单独FeCl3孵育不发生聚集，而FeCl3与tauR3共孵育相较于tauR3组的荧光强度明显增加，提示在FeCl3的干预下，tauR3聚集反应进一步加重，这与Li等[38]的研究结果一致。此外，我们发现将孵育时间延长到96 h，观察到随时间增加，荧光强度逐渐增强，并通过TEM也观察到FeCl3加剧了tauR3的纤维聚集。这些结果进一步提示外源性三价铁离子可以促进了tau蛋白聚集，有利于神经元NFTs的形成。综合以上分析，外源性三价铁离子可能通过诱导神经元p-tau蛋白表达升高和聚集，进而抑制神经元细胞活性，加重神经元NFTs的形成。当然，外源性三价铁离子也可能进入胞内通过芬顿反应，产生大量Fe2+和活性氧，诱导氧化应激，造成神经元的损伤[4]。
本研究存在一些局限性：体外模型与人体存在一定差异，外源性三价铁离子影响p-tau的机制仍需进一步探究。设置总tau蛋白含量的检测有利于排除由于tau蛋白上调而导致的p-tau蛋白增加，可以更好的反映p-tau的来源。
综上所述，本研究揭示外源性三价铁离子对SH-SY5Y细胞活性的损害可能与其促进p-tau表达和tau聚集有关。这将为铁沉积加剧AD样脑内tau病理提供新的的依据，而抑制铁超载有可能成为治疗tau样病理的一种潜在策略，本研究将继续通过体内体外实验探究，完善铁超载与tau病理的相关机制。
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图 1 FeCl3染毒后SH-SY5Y细胞存活率
与对照组比较，*：P < 0.05，**：P < 0.01。
Figure 1. SH-SY5Y cell survival rate after exposure to FeCl3
Compared with the control group, *: P < 0.05, **: P < 0.01.
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图 2 FeCl3染毒后SH-SY5Y细胞内铁含量
**：与对照组比较，P < 0.01。A：Perl's染色图；B：阳性细胞相对表达量。
Figure 2. SH-SY5Y cell iron content after exposure to FeCl3
**: Compared with the control group, P < 0.01. A: Perl's staining; B: Positive cell rate.
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图 3 FeCl3染毒后p-tau蛋白表达水平
A、C：免疫印迹图；B、D：p-tau蛋白相对表达量。与对照组比较，**：P < 0.01；***：P < 0.001；#：与tau组比较，P < 0.05。
Figure 3. Expression levels of p-tau protein after exposure to FeCl3
A and C: Western blotting bands; B and D: Relative expressionlevel of p-tau. Compared with the control group, **: P < 0.01, ***: P < 0.001; #: Compared with the tau group, P < 0.05.
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图 4 FeCl3染毒后tauR3聚集情况
A：相对荧光强度；B、C：tauR3组、tauR3+FeCl3组TEM结果图。***：与对照组比较，P < 0.001；##：与tauR3组比较，P < 0.01。
Figure 4. tauR3 aggregation after exposure to FeCl3
A: Relative fluorescence intensity; B and C: TEM observation of the tauR3 group and the tauR3+FeCl3 group. ***: Compared with the control group, P < 0.001; ##: Compared with the tauR3 group, P < 0.01.
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1. 牛侨. 探究环境因素损害神经机制，尝试预防性干预措施. 环境与职业医学. 2023(03): 237-238 . 
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