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摘要:背景
溴敌隆是国内外广泛使用的第二代抗凝血类杀鼠剂，在生命早期暴露会导致神经发育毒性，但对于神经发育的毒性机制作用尚不明确。
目的探究溴敌隆暴露导致斑马鱼胚胎神经发育毒性及可能的作用机制。
方法将斑马鱼胚胎随机分为4组，分别为对照组（二甲基亚砜）以及0.39、0.78、1.18 mg·L−1溴敌隆暴露组。暴露时间为受精后4~120 h。暴露至24 h记录每分钟内斑马鱼胚胎自主抽动次数，至120 h记录斑马鱼幼鱼120 min内的运动情况，检测幼鱼体内的乙酰胆碱酯酶（AChE）活性，通过荧光定量PCR方法检测神经发育相关基因（
elavl3 、gap43 、mbp 、syn2a ）表达情况。结果与对照组相比，24 h时1.18 mg·L−1溴敌隆暴露组的斑马鱼胚胎自主抽动次数下降40%（
P <0.05）。120 h时，当溴敌隆暴露浓度达到0.78、1.18 mg·L−1时，运动总距离相较于对照组分别下降60%、69%（P <0.05、P <0.01），运动总时间相较于对照组分别下降34%、65%（P <0.05、P <0.01）。与对照组相比，1.18 mg·L−1暴露组AChE活性升高36%（P <0.05）。荧光定量PCR测试结果表明：与对照组相比，神经发育关键基因elavl3、syn2a 和mbp 的基因表达在1.18 mg·L−1暴露组分别下调66%、69%、65%（P <0.01），gap43 基因表达在溴敌隆浓度为0.78 mg·L−1时上调56%（P <0.01），在浓度为1.18 mg·L−1时，表达量下调34%（P <0.05）。结论溴敌隆暴露抑制斑马鱼胚胎自主抽动、运动行为能力，斑马鱼神经发育相关基因表达下调，阻碍神经传导递质释放，从而对斑马鱼产生神经发育毒性作用。
Abstract:BackgroundBromadiolone is the second-generation anticoagulant rodenticide widely used all over the world. Exposure to bromadiolone in early life stage can lead to neurodevelopmental toxicity, but its toxic mechanism of neurodevelopment is not clear so far.
ObjectiveTo investigate the developmental neurotoxicity and mechanism of bromadiolone to zebrafish embryos.
MethodsZebrafish embryos were randomly divided into four groups: a solvent control group (dimethylsulphoxide) and three bromadiolone exposure groups (0.39, 0.78, and 1.18 mg·L−1). The exposure period was from 4 h to 120 h post-fertilization. The number of spontaneous movement per minute was recorded at 24 h post-treatment. The locomotor ability of zebrafish larvae and the activity of acetylcholinesterase (AChE) were tested at 120 h post-treatment. The relative expression levels of neurodevelopment-related genes (
elavl3 ,gap43 ,mbp , andsyn2a ) were measured by fluorescence quantitative PCR.ResultsCompared with the control group, the number of spontaneous movement per minute at 24 h decreased significantly in the 1.18 mg·L−1 bromadiolone exposure group (
P <0.05). Compared with the control group, the total distance travelled of the zebrafish larvae in the 0.78 and 1.18 mg·L−1 bromadiolone exposure groups decreased by 60% and 69% respectively (P <0.05,P <0.01), and the total movement time decreased by 34% and 65% respectively (P <0.05,P <0.01). The AChE activity in the 1.18 mg·L−1 bromadiolone exposure group increased by 36% when compared with the control group (P <0.05). The fluorescence quantitative PCR results showed that compared with the control group, the expression levels of neurodevelopment-related geneselavl3 ,syn2a , andmbp were significantly down-regulated by 66%, 69%, and 65% in the 1.18 mg·L−1 bromadiolone exposure group respectively (P <0.01), the expression level ofgap43 was up-regulated by 56% in the 0.78 mg·L−1 bromadiolone exposure group (P <0.01) and down-regulated by 34% in the 1.18 mg·L−1 bromadiolone exposure group (P <0.05).ConclusionBromadiolone exposure could inhibit spontaneous movement and locomotive behavior, down-regulate the expression levels of neurodevelopment-related genes, hinder the release of neurotransmitters, and result in neurodevelopmental toxicity in the early-staged zebrafish.
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Keywords:
- anticoagulant rodenticide /
- bromadiolone /
- zebrafish /
- neurodevelopmental toxicity
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近年来，由于杀鼠剂的不规范投放，导致人、畜等中毒的案例屡见报道[1-2]。溴敌隆是典型的第二代香豆素衍生物类抗凝血杀鼠剂，因其具有广谱、高效以及适口性好等优点，被广泛应用于农村和城市灭鼠。但也正是其大量使用，溴敌隆残留对土壤、水体等生态环境造成了一定的污染。有研究表明，溴敌隆已经从土壤、鼠类尸体等介质进入小麦等农作物[3]，甚至家畜[4]等大型动物体内，对人类的生命健康构成了潜在的威胁。与其他抗凝血类灭鼠剂的毒性作用机理类似，溴敌隆为维生素K拮抗剂，主要通过干扰正常机体维生素K循环，导致维生素K依赖的凝血因子缺乏，最终引起机体凝血功能障碍，从而达到毒杀的效果[5]。截至目前，针对溴敌隆的研究大多集中于生物基质中的含量检测[6-7]、病例救治[8]以及鼠类的防治[9]等领域，关于溴敌隆对非靶向动物的神经毒性的研究鲜有人报道。此前有报道称溴敌隆中毒会引起患者出现头晕、步态不稳等症状[10-11]，对中枢神经系统造成一定的损害。可见，溴敌隆对神经系统具有一定的毒性作用，但具体机制不甚明了。因此，开展以溴敌隆为代表的抗凝血类杀鼠剂对神经系统的毒性作用机制的研究十分必要。
斑马鱼除具有生长发育周期短，实验成本低，脑部结构易于观察以及与人类基因相似度高等诸多优点外，斑马鱼胚胎和幼鱼对外源物质较为敏感，使得从发育学、运动行为学等角度评估化合物对斑马鱼的神经毒性成为可能，被广泛用于评估各种环境污染物的神经毒性等研究领域[12-13]。本研究通过检测斑马鱼胚胎的自主抽动、乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase, AChE）活性、运动行为能力以及神经系统发育相关基因（elavl3、gap43、mbp、syn2a）的表达情况，以期从运动行为能力、神经传导递质、神经发育相关基因表达等角度探究溴敌隆对斑马鱼幼鱼的神经毒性及作用机制，为进一步评估溴敌隆对非靶向动物的毒性作用机制提供借鉴和参考。
1. 材料与方法
1.1 实验动物
实验用斑马鱼为野生型AB品系，亲代购自中科院国家斑马鱼资源中心（中国湖北武汉）。培养条件为水温（28.5±0.3） ℃，pH为7.0~7.5，光/暗周期设置为14 h∶10 h，每日投喂2次活体丰年虾。在收集胚胎的前1天17时按雌雄比例1∶2或1∶1放进交配缸，用透明隔板将雌鱼与雄鱼隔开，放入恒温培养箱中。第2天上午8时光照30 min后移去隔板，记录产卵时间，收集并清洗受精胚胎，置于培养箱中，温度设置为（28±1） ℃，于4 h后置于显微镜下挑除死亡胚胎，选取正常发育受精胚胎分组暴露于不同质量浓度（后称浓度）的溴敌隆溶液中。
1.2 主要试剂与仪器
溴敌隆（中国北京北方伟业计量技术研究院），二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO； 中国国药集团化学试剂有限公司）。AChE活性检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司。实验前，用DMSO将溴敌隆配制成5000 mg·L−1的母液，逐级稀释到所需实验浓度，0 ℃避光保存。暴露溶液均为现配现用，确保各浓度组中DMSO最终体积分数小于0.02%（经预实验，DMSO体积分数为0.02%时对照组的斑马鱼胚胎发育指标，如自主抽动次数、运动行为学指标以及体内AChE活性及相关基因表达与空白组相比差异无统计学意义）。
生化培养箱（LBI-400，中国上海龙跃），体式显微镜（Olympus-SZX7，日本奥林巴斯），斑马鱼行为分析仪（DanioVision，荷兰诺达思），全自动样品冷冻研磨仪（JXFSTPRP-CL，中国上海净信），冷冻离心机（LEGEND MICRO 21R，美国赛默飞世尔），酶标仪（FlexStation 3，美国赛默飞世尔），荧光定量PCR仪（CFX-96，美国Bio-Rad）。
1.3 胚胎暴露实验
随机挑选受精4 h后发育正常、大小相近的斑马鱼胚胎进行染毒暴露实验。参考经济合作与发展组织鱼类胚胎急性水生毒性实验进行暴露实验[14]，间隔24 h更换新配制的暴露溶液，以保证浓度恒定。前期通过毒理学实验，可计算得出120 h溴敌隆对斑马鱼胚胎的半数致死浓度（median lethal concentration, LC50）为1.56 mg·L−1。参考顾杰等[15]以及何梦婷等[13]的研究，确定0.25LC50、0.5LC50、0.75LC50作为实验暴露浓度，即以DMSO（对照组）以及0.39、0.78、1.18 mg·L−1的溴敌隆进行暴露。设置3组平行实验，采用6孔细胞培养板为实验容器，每孔放置30枚胚胎，暴露溶液每24 h更换一次，实验期间孔板需盖板盖，以保证各组浓度保持不变。暴露期间水温保持（28±1） ℃，光/暗周期设置为14 h∶10 h，及时挑出死亡胚胎以防对其他胚胎造成污染，并统计。
1.4 自主抽动分析
每个浓度组随机挑选10枚暴露至24 h的斑马鱼胚胎，通过显微镜视频记录1 min内胚胎的自主抽动情况，重复3次，使用DanioScope 1.2软件统计胚胎的自主抽动次数。
1.5 运动行为能力实验
每个浓度组随机挑选12尾溴敌隆暴露120 h后具有运动行为能力的斑马鱼幼鱼通过DanioVision高通量斑马鱼行为分析系统进行测试。参考Nery等[16]的实验方法，将随机挑选出的幼鱼放置在24孔细胞培养板中进行行为能力测试，每孔放置1尾斑马鱼幼鱼。光刺激条件设定为前10 min黑暗适应，之后每10 min进行一次明暗交替，记录总时长为120 min的运动行为数据，实验结束后用Ethovision XT 14软件统计和分析。
1.6 AChE活性测量
每个暴露组随机取100尾暴露120 h后的斑马鱼幼鱼，用去离子水清洗2~3次，加入300 μL预冷的0.1 mol·L−1磷酸盐缓冲溶液，置于2.5 mL离心管内0℃匀浆400 s，加入700 μL磷酸盐缓冲溶液进行清洗转移。0℃下5000 r·min−1（离心半径5 cm）离心10 min，取上清液待测。用酶标仪在412 nm波长依序测量各孔的光密度，采用Bradford法测量AChE活性。
1.7 荧光定量PCR检测神经发育相关基因的相对表达量
溴敌隆暴露120 h后，每个暴露组取50尾斑马鱼幼鱼置于冰上匀浆，用TRIzol试剂抽提总RNA，逆转录为cDNA，引物序列见表1。PCR反应程序设定如下：cDNA模板2.0 μL，正、反向引物（10 μmol·L−1）各1.0 μL，荧光预混液12.5 μL，双蒸水8.5 μL。95 ℃预变性3 min，95 ℃变性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s（循环40次）。设定对照组幼鱼的syn2a、gap43、elavl3和mbp的mRNA相对表达量为1.0±0.0，结果采用相对Ct法（2−ΔΔCt）确定mRNA的相对表达量。
表 1 荧光定量PCR引物序列Table 1. The sequences of fluorescent quantitative PCR primers引物名称 正向（5′→3′） 反向（5′→3′） syn2a TGGTTATTGACGAGCCCCAG TCGCCAAACTCAGCCTGTTC gap43 ATAGACAAACCAGACGCTGC TACATTGCACTGGTCCTCCG elavl3 AATCAAGGTGTCTTACGCCAGG ACCGAATGAAACCTACCCCG mbp GGAGCTTTGTGTCCTCTCCT GCGTCTCTGTGGCGATCTAA 1.8 统计学分析
资料数据使用SPSS 20软件进行统计分析，以均数±标准差表示。在满足正态分布和方差齐性的前提条件下，各染毒组间比较用单因素方差分析，进一步使用最小显著性差异法进行两两比较，检验水准为α=0.05。
2. 结果
2.1 溴敌隆对斑马鱼胚胎自主抽动的影响
不同浓度的溴敌隆暴露24 h后斑马鱼胚胎的自主抽动测试结果如图1所示。结果显示，0.39、0.78 mg·L−1暴露组的斑马鱼胚胎自主抽动次数相较于对照组分别下降5%和25%（P>0.05），当暴露浓度达到1.18 mg·L−1时，自主抽动次数相较于对照组下降40%，具有统计学意义（P<0.05）。
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图 1 溴敌隆暴露对斑马鱼胚胎自主抽动的影响（$ \bar x \pm s $ ，n=10）与对照组相比，*：P<0.05。Figure 1. Effects of exposure to bromadiolone on spontaneous movement of zebrafish embryos ($ \bar x \pm s $ , n=10)2.2 溴敌隆对斑马鱼幼鱼运动行为的影响
图2是溴敌隆暴露120 h后在120 min内的斑马鱼幼鱼运动行为能力测试结果。结果显示，与对照组相比，0.39 mg·L−1暴露组的斑马鱼幼鱼的运动总距离（图2A）下降17%，运动总时间（图2B）下降15%（P>0.05），当溴敌隆暴露浓度达到0.78、1.18 mg·L−1时，运动总距离相较于对照组分别下降60%、69%，运动总时间相较于对照组分别下降34%、65%，差异均具有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。
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图 2 溴敌隆暴露对斑马鱼幼鱼运动行为能力的影响（$ \bar x \pm s $ ，n=12）A：运动总距离；B：运动总时间。与对照组相比，*：P<0.05；**：P<0.01。Figure 2. Effects of exposure to bromadiolone on locomotive behavior of zebrafish larvae ($ \bar x \pm s $ , n=12)2.3 溴敌隆对斑马鱼幼鱼AChE活性的影响
溴敌隆暴露120 h后斑马鱼幼鱼体内的AChE活性的测试结果见图3。结果显示，0.78 mg·L−1溴敌隆暴露组的AChE活性较对照组上升17%（P>0.05），当溴敌隆浓度达到1.18 mg·L−1时，AChE活性升高36%（P<0.05）。
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图 3 溴敌隆暴露对斑马鱼幼鱼体内AChE活性的影响（$ \bar x \pm s $ ，n=3）与对照组相比，*：P<0.05。Figure 3. Effects of exposure to bromadiolone on AChE activity of zebrafish larvae ($ \bar x \pm s $ , n=3)2.4 溴敌隆对斑马鱼幼鱼神经发育相关基因的影响
溴敌隆暴露120 h后，与对照组相比，0.39 mg·L−1和0.78 mg·L−1暴露组的elavl3基因相对表达未出现明显下调（P>0.05），但1.18 mg·L−1暴露组下调66%（P<0.01）（图4A）。0.39 mg·L−1暴露组gap43基因的相对表达量上调18%，但无统计学意义（P>0.05），0.78 mg·L−1暴露组上调56%（P<0.01），但当暴露浓度达到1.18 mg·L−1时，相对表达量下调34%（P<0.05）（图4B）。各暴露组mbp基因的相对表达均受到抑制，0.39 mg·L−1暴露组下调40%（P<0.05），0.78 mg·L−1暴露组下调30%（P<0.05），当浓度达到1.18 mg·L−1时下调65%（P<0.01）（图4C）。0.39 mg·L−1暴露组syn2a基因的相对表达量下调22%，0.78 mg·L−1暴露组下调5%，但均无统计学意义（P>0.05），当浓度达到1.18 mg·L−1时，其相对表达量下调69%（P<0.01）（图4D）。
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图 4 溴敌隆暴露对斑马鱼幼鱼神经发育相关基因表达的影响（$ \bar x \pm s $ ，n=3）A：elavl3基因相对表达量；B：gap43基因相对表达量；C：mbp基因相对表达量；D：syn2a基因相对表达量。与对照组相比，*：P<0.05；**：P<0.01。Figure 4. Effects of exposure to bromadiolone on the expressions of neurodevelopment-related genes of zebrafish larvae ($ \bar x \pm s $ , n=3)3. 讨论
溴敌隆作为目前应用最为广泛的第二代抗凝血高效杀鼠剂之一，其对鼠类的毒杀作用机理已经被学者们研究得较为详细[17]，但对非靶向动物的毒性作用，尤其是对水生动物的神经毒性作用以及相关机制的研究鲜有人报道。Wang等[13]通过核磁共振成像手段发现溴敌隆中毒患者的脑部形态改变，推测可能是由于维生素K1的缺失影响脑神经细胞的相关蛋白的合成，从而引起中枢神经紊乱，但并未深入研究毒性机制。本研究考察了在不同浓度溴敌隆暴露下对斑马鱼胚胎自主抽动、斑马鱼幼鱼运动行为能力的影响，以及幼鱼体内的AChE活性以及神经发育相关基因的变化情况，尝试从分子生物学层面对溴敌隆引起的神经毒性作用机制进行探究。
斑马鱼的运动行为能力与神经系统发育密切相关，运动行为特征能够体现斑马鱼的神经发育情况，斑马鱼胚胎早期的自主抽动和幼鱼的运动行为能力常被用作评估药物神经毒性的重要指标[18-19]。自主抽动是斑马鱼胚胎发育至24 h时，尾部出现的有规律抽动，不受大脑神经元的控制，是能够观察到斑马鱼胚胎的最初始神经活动。本次实验研究显示，经溴敌隆染毒后，斑马鱼胚胎的自主抽动在高浓度（1.18 mg·L−1）暴露组受到抑制，表明溴敌隆可能通过影响斑马鱼胚胎的脊柱神经元细胞而改变其自主抽动，对斑马鱼胚胎早期发育具有一定的神经毒性作用。不仅如此，本研究通过运动行为学实验发现，当溴敌隆暴露浓度达到0.78 mg·L−1和1.18 mg·L−1时，斑马鱼的运动总距离和运动总时间受到抑制，表明溴敌隆对斑马鱼幼鱼的运动神经发育具有一定的抑制作用。AChE是与神经传导有关的酶，对斑马鱼胚胎的神经发育至关重要，是常被用于评估神经毒性的生理学指标之一[20]，AChE活性增强，则抑制兴奋的传导；相反，减弱时，表现为过度兴奋。本实验研究发现，幼鱼体内AChE活性在高浓度暴露组（1.18 mg·L−1）被诱导，说明AChE活性的增强可能导致斑马鱼幼鱼肌肉的收缩和行为反应变得迟钝[21]，以致斑马鱼幼鱼的运动行为能力下降。
为进一步探究溴敌隆对斑马鱼胚胎神经毒性的机制，本研究对神经发育相关基因（elavl3、gap43、mbp、syn2a）的表达情况进行了测试。参与编码特异性神经元RNA结合蛋白HuC的elavl3基因在神经元分化和维持中起到重要作用，是斑马鱼早期神经元发育的标志基因之一[22]。mbp基因被认为是神经发育的重要标志物之一，它主要负责调控中枢神经系统轴突中的髓鞘发育水平[23]。神经元特异性突触小泡相关基因syn2a在斑马鱼胚胎早期中枢神经系统发育阶段神经递质释放中起着重要作用[24]。此前，王伟等[25]研究表明，将斑马鱼胚胎暴露于25 μmol·L−1的双酚A后，elavl3、mbp以及syn2a基因表达下调，致使斑马鱼胚胎出现神经发育毒性。本研究中，经溴敌隆暴露处理后，elavl3、mbp和syn2a基因表达均出现不同程度的下调，表明溴敌隆染毒可能导致了斑马鱼胚胎神经系统的正常分化和发育，从而产生了神经毒性作用。gap43是一种神经组织特异性细胞质蛋白，常用作神经损伤后再生时重新诱导轴突生长的标志[26]。本研究发现，随着溴敌隆浓度的增大，gap43基因的表达量呈现先上升后下降的趋势，这可能是低浓度溴敌隆暴露引起斑马鱼胚胎的神经元损伤，诱导gap43基因的表达，但高浓度的溴敌隆致使神经损伤再生机制失效，从而导致gap43基因下调。因此，gap43基因的表达异常表明溴敌隆暴露对斑马鱼胚胎的神经发育产生了毒性效应。
综上所述，溴敌隆暴露可导致斑马鱼胚胎神经发育相关基因表达下调，阻碍神经传导递质的释放，抑制斑马鱼幼鱼的运动行为能力，最终导致斑马鱼神经发育毒性。尽管本研究对溴敌隆暴露引起的神经发育毒性的机制进行了初步探究，但仍然存在不足，如对斑马鱼神经发育相关基因和神经传导机理的研究不够充分和细致，对神经毒性的机理解释仍存在不确定因素，还需进一步研究。
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图 1 溴敌隆暴露对斑马鱼胚胎自主抽动的影响（
$ \bar x \pm s $ ，n=10）与对照组相比，*：P<0.05。
Figure 1. Effects of exposure to bromadiolone on spontaneous movement of zebrafish embryos (
$ \bar x \pm s $ , n=10)![]()
图 2 溴敌隆暴露对斑马鱼幼鱼运动行为能力的影响（
$ \bar x \pm s $ ，n=12）A：运动总距离；B：运动总时间。与对照组相比，*：P<0.05；**：P<0.01。
Figure 2. Effects of exposure to bromadiolone on locomotive behavior of zebrafish larvae (
$ \bar x \pm s $ , n=12)![]()
图 3 溴敌隆暴露对斑马鱼幼鱼体内AChE活性的影响（
$ \bar x \pm s $ ，n=3）与对照组相比，*：P<0.05。
Figure 3. Effects of exposure to bromadiolone on AChE activity of zebrafish larvae (
$ \bar x \pm s $ , n=3)![]()
图 4 溴敌隆暴露对斑马鱼幼鱼神经发育相关基因表达的影响（
$ \bar x \pm s $ ，n=3）A：elavl3基因相对表达量；B：gap43基因相对表达量；C：mbp基因相对表达量；D：syn2a基因相对表达量。与对照组相比，*：P<0.05；**：P<0.01。
Figure 4. Effects of exposure to bromadiolone on the expressions of neurodevelopment-related genes of zebrafish larvae (
$ \bar x \pm s $ , n=3)表 1 荧光定量PCR引物序列
Table 1 The sequences of fluorescent quantitative PCR primers
引物名称 正向（5′→3′） 反向（5′→3′） syn2a TGGTTATTGACGAGCCCCAG TCGCCAAACTCAGCCTGTTC gap43 ATAGACAAACCAGACGCTGC TACATTGCACTGGTCCTCCG elavl3 AATCAAGGTGTCTTACGCCAGG ACCGAATGAAACCTACCCCG mbp GGAGCTTTGTGTCCTCTCCT GCGTCTCTGTGGCGATCTAA 
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1. 安浩，张宴. 微塑料和三氯生对斑马鱼的神经毒性效应研究. 能源环境保护. 2023(04): 131-139 . 
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