氟是生物体所必需的微量元素，过量的氟主要蓄积在硬组织中（骨组织及牙），主要表现为氟斑牙和氟骨症，继续累积还会造成其他组织器官的损伤^[1-2]。现有研究多是关于氟斑牙及四肢躯干氟骨症的研究，但目前对颌骨氟蓄积的特征了解甚少。颌骨是全身骨组织的同源发生组织，且是口腔中的重要框架结构和牙齿存在所依赖的不可缺少的组织基础。流行病学调查发现氟中毒患者牙周组织健康状况不良^[3]。王海慧等^[4]的临床观察也发现氟斑牙患者颌骨骨密度显影性状也与正常人群颌骨X线表现不同，提示可能与颌骨氟蓄积有关。了解颌骨氟蓄积特征及骨损害特点，有利于预防控制慢性氟中毒的发生，以及改善慢性氟中毒患者口腔正畸、种植修复、牙周组织健康维护等治疗的效果。

因此，本课题组选取慢性氟中毒大鼠的股骨为参照，观察牙氟、颌骨氟蓄积特征，并初步探讨三种氟易感硬组织中氟蓄积可能存在的联系。

1.   对象与方法

1.1   动物、仪器与试剂

1.1.1   实验动物

3周龄SD大鼠（SPF级）共计144只，雌雄各半，体重（60±5） g，温度22 ℃~24 ℃，湿度55%~60%，12 h光照/12 h黑暗的环境，自由进食，饲养于贵州医科大学实验动物中心，动物质量合格证编号为SCXK（湘）2019-0014。实验方案经贵州医科大学实验动物伦理委员会批准（批准号为2000890）。

1.1.2   主要实验仪器及设备

pH计（PHS-3C型，中国上海仪电科学仪器股份有限公司），雷磁复合氟电极（CSB-F-2型，中国长沙益天实验仪器有限公司春花制作中心），微溶池（CSB，中国长沙益天实验仪器有限公司春花制作中心），电子天平（AR2140型，中国上海奥豪斯公司），台式离心机（80-2型，中国上海医疗器械有限公司手术器械厂）。

1.1.3   主要实验试剂

NaF（优级纯，纯度≥99%，美国Sigma-Aldrich），NaOH、冰乙酸、二水合柠檬酸三钠、磷酸氢二铵（分析纯，中国天津市科密欧化学试剂有限公司），氯化钠（优级纯，中国天津市科密欧化学试剂有限公司），10%福尔马林（中国南昌雨露实验器材公司），乙二胺四乙酸二钠（中国北京索莱宝科技有限公司）。

1.2   方法

1.2.1   实验分组

采用随机数字表法将实验动物随机均分为2组，正常对照组及染氟组，每组72只。以染毒后慢性氟中毒模型建立成功的时间为依据，在染毒3、5、7个月后进行氟中毒水平监测，分为3、5、7个月组，共3个时间亚组，每个亚组24只，雌雄各半。

1.2.2   饮水型慢性氟中毒模型建立

正常对照组自由饮用来自贵州地区消毒过滤的纯净水（含氟量＜0.08 mg·kg⁻¹ ，低于国家水质标准1 mg·kg⁻¹），染氟组自由饮用150 mg·L⁻¹的NaF水溶液，建立饮水型慢性氟中毒模型。模型建立成功的标志以氟斑牙的出现及血氟、尿氟的明显升高为标准，氟引起大鼠切牙氟牙症表现与人类氟牙症表现极为相似^[5]，本研究应用人氟牙症分级标准评价大鼠氟牙症特征，具体分级表现见表1^[6]。

表  1 

氟斑牙分级

Table  1. 

Classification of dental fluorosis

分级	表现
0级	釉质呈半透明乳白色，表面光滑、有光泽
I级	牙面横向出现细小规则的棕、白色相间横纹
II级	不规则棕、白色相间横纹，横纹间白垩部分变宽，棕纹在某些区域中断，但仍多于50%的牙面
III级	白垩区更多，棕色橫纹少于50%的牙面并且牙面有微小的独立的窝状缺损，但牙形态无明显改变
IV级	整个牙面呈白垩粉笔样改变，牙缘常断缺

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1.2.3   样本收集及测定

据观察时间点3、5、7月采集尿液及血液，处死前一天禁饮禁食，使用代谢笼（用粪尿分离装置直接收集实验动物自然排出的尿液的一种密封式饲养笼）收集各组大鼠24 h尿液，按照WS/T 89—2015《尿中氟化物测定离子选择电极法》测定尿氟浓度。用10%（质量分数）水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，心脏采全血，置于离心机4 ℃、3000 r·min⁻¹（离心半径为5 cm），离心10 min，收集血清，按照WS/T 212—2001《血清中氟化物的测定离子选择电极法》测定血氟浓度。取其下颌骨、牙，取股骨并剥离表面附着软组织，剔骨，磷酸缓冲液冲洗，采用高温灰化-氟离子选择电极法检测氟离子含量。

1.3   统计学分析

利用SPSS 26.0统计软件进行分析，应用Origin 2019绘制统计图。计数资料用 $ \bar x \pm s $表示。雌雄差异及正常组与染氟组差异比较时，采用独立样本t检验；不同时间点之间的差异比较，采用单因素方差分析。检验水准为α=0.05。

2.   结果

2.1   饮水型慢性氟中毒大鼠模型建立情况

染氟组大鼠饲以150 mg·L⁻¹的NaF水溶液，持续喂养3个月后，大鼠均出现约II级氟斑牙表现，见图1。检测后发现大鼠血氟、尿氟、颌骨氟、股骨氟、牙氟含量均高于正常对照组（均P＜0.05），见表2，表明饮水型慢性氟中毒大鼠建模成功。

图  1 

染氟3个月后正常对照组（A）与染氟组（B）大鼠氟斑牙表现情况

Figure  1. 

Dental fluorosis in normal control group (A) and fluoride group (B) after 3 months of fluoride exposure

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表  2 

大鼠不同生物样本中氟离子蓄积情况及变化趋势（ $ \bar x \pm s $，n=24）

Table  2. 

Fluoride accumulation and change trends in selected biological samples of rats ( $ \bar x \pm s $, n=24)

氟含量	3个月			5个月			7个月
	正常对照组	染氟组		正常对照组	染氟组		正常对照组	染氟组
尿氟/(mg·L−1)	12.68±5.94	44.89±25.91^		16.95±9.40	45.76±23.02^		9.86±3.38*#	21.66±9.01*#
血氟/(mg·L−1)	0.42±0.12#	1.45±0.40#^		0.55±0.18*	0.61±0.09*^		0.22±0.06#	0.38±0.08*#^
颌骨氟/(mg·kg−1)	1097.36±470.34	3145.02±765.82#^		1501.62±460.26	6485.02±2141.98*b^		2113.18±634.49*#	8420.36±1728.56*#b^
股骨氟/(mg·kg−1)	1279.24±817.64	3640.55±699.42^		1373.30±271.35	4914.99±1529.41a^		1790.84±438.21	6091.99±1384.97*#a^
牙氟/(mg·kg−1)	453.09±173.43b	1550.20±77.73ab^		1030.85±806.39	3365.21±1462.27a^		1604.80±160.43*	4702.08±1417.06*a^
[注] 同一生物样本，相同观察时间，^：与正常对照组比较，P < 0.05; 同一生物样本同组间比较，*：与3月比较， P < 0.05；#：与5月比较， P < 0.05；同一观察时间，硬组织比较，a：与颌骨比较， P < 0.05，b：与股骨比较， P<0.05。

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2.2   雌、雄大鼠氟离子蓄积比较

在染氟3、5、7个月后，分别比较各时间点染氟组大鼠的血氟、尿氟、股骨氟、颌骨氟、牙氟蓄积均无显著的性别差异（均P＞0.05），见图2。因此，后续将雌鼠、雄鼠数据合并处理。

图  2 

染氟组雌、雄大鼠氟离子蓄积比较（ $ \bar x \pm s $，n=12）

Figure  2. 

Comparison of fluoride accumulation in female and male rats with fluoride exposure ( $ \bar x \pm s $, n=12)

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2.3   正常对照组大鼠氟离子蓄积分布特征

在7个月观察期内，血、尿中氟离子维持低水平存在，尿氟含量先升后降，总体表现为降低趋势，血氟含量则经过小幅升高后下降，较初始水平更低，但差异无统计学意义。硬组织中氟离子含量在数值上远高于血、尿中氟离子含量，在观察期内，股骨中氟离子含量保持稳定，颌骨及牙表现出氟蓄积增加的时间正效应（P＜0.05），呈现氟蓄积增加趋势；从组织中氟离子累积时间来看，牙蓄氟稍晚于股骨，在3个月观察时间点，牙氟含量低于股骨氟含量（P＜0.05），至7个月观察期终末时，未发现股骨、颌骨、牙中氟含量差异。见表2。

2.4   染氟组大鼠氟离子蓄积分布特征

染氟组大鼠持续饲氟后，在7个月观察期内，血、尿中氟蓄积呈现逐渐降低趋势。硬组织中氟离子含量在数值上远高于血、尿中氟离子含量，三种硬组织均表现出氟蓄积增加的时间正效应，7个月时的氟蓄积量均高于3个月，差异均有统计学意义（均P＜0.05），提示氟蓄积增加趋势，且累积增幅大于正常对照组，其中，颌骨氟增幅最大，持续染氟至5个月后，发现颌骨中氟含量远高于股骨及牙齿中氟含量（P＜0.05）。从组织中氟离子累积时间来看，与正常对照组氟蓄积情况类似，牙蓄氟稍晚于骨骼，在3个月观察时间点，牙氟均低于股骨氟及颌骨氟（均P＜0.05）。见表2。

3.   讨论

慢性氟中毒时，机体为了消除过多摄入的氟离子，会有90%的氟沉积在骨骼和牙齿中，并且处于终生蓄氟状态，导致氟斑牙和氟骨症的发生。颌骨与全身骨具有组织同源性，慢性氟中毒环境下也会受累^[7]。与全身运动大骨不同，颌骨主施咀嚼、语言、进食吞咽等口颌面细小运动，且颜面表情肌、唇颊舌等口周运动肌的补偿作用丰富，颌骨自身的骨骼功能表现不及全身骨明确和突出，因而慢性氟病损影响容易被忽略。目前关于氟相关骨损害的研究报道多见于四肢长骨及全身中轴骨^[2]。关于颌骨氟蓄积的研究报道较少。

颌骨是牙齿存在不可或缺的组织基础。口腔正畸、种植修复、牙周组织健康维护及牙周病治疗、颞下颌关节疾病等均依赖颌骨的组织状态和骨微结构环境^[8-9]。大量研究发现高氟摄入后，颌骨骨质形态等会发生变化。Schultz等^[10]发现高氟区马鹿的下颌骨变形，牙槽骨吸收伴随严重的牙周破坏。国内学者研究发现氟斑牙患者上颌牙槽骨颊侧骨皮质和骨松质密度降低^[11]；然而，国外学者研究结果表明，氟摄入量高会导致无牙颌个体下颌骨骨密度增加^[12]。因此，深入研究颌骨慢性氟中毒损害是口腔环境疾病研究领域的重要部分。

颌骨在人体生长发育过程中表现为终生改建状态，具有高度的增殖性，体外和体内的成骨能力较长骨及中轴骨更强，其血液循环、营养供应更加丰富^[13]；因此，推测颌骨氟蓄积代谢可能较四肢长骨更活跃。

本研究发现大鼠自然饮水状态下，股骨、颌骨和牙齿三种硬组织氟离子分布情况相近，其氟离子含量在数值上均高于血、尿氟离子水平。这提示大鼠体内氟离子分布在硬组织中有积累趋势，颌骨和牙齿的累积趋势较股骨明显，推测颌骨和牙齿的蓄氟敏感性更高。而血、尿组织中氟离子随组织液代谢，保持较低水平表达。

慢性氟中毒环境下，骨、牙硬组织氟离子含量均升高，超过正常对照水平。其中，颌骨随染氟时间延长，表现高氟离子富集。相较于颌骨，股骨氟蓄积较缓，染氟5个月后才开始表现氟离子含量增加，且观察期内总累积量低于颌骨。牙齿的蓄氟趋势与股骨基本一致，氟中毒早期（3个月）低于股骨，后期（7个月）总累积水平与股骨无统计学差异，但也明显低于颌骨水平。

本研究在氟中毒造模成功后，继续同浓度（剂量）染氟，选取隔月重复观察以上三种硬组织氟蓄积变化。结果发现所观察的三种硬组织氟离子含量均表现时间依赖的正增长变化，且未出现蓄积饱和的平台期。这提示硬组织可持续受氟中毒环境影响，相应损害也可能表现持续进展。颌骨的蓄氟饱和阈值可能较股骨等全身长骨更高。该蓄氟特征可能源自颌骨丰富的松质骨结构，以及终生活跃的骨生长和改建特性。确切的颌骨氟离子代谢机制还有待实验观察和证实。

牙齿与颌骨不仅存在结构关联，颌骨还提供牙齿发生的起源环境^[14]。牙齿通过牙周组织与颌骨连接。大量研究围绕氟斑牙展开，认为氟斑牙是慢性氟中毒早期的体征表现^[15]。此外，股骨也是氟骨相损害最常受累的靶器官^[16]。通过对比，本研究发现牙齿和股骨的氟蓄积趋势相似，与慢性氟中毒同时纳入牙齿和长骨的损害作为诊断判别标准相呼应，提示牙齿和长骨（股骨）病损表征与组织中氟离子含量直接相关。氟斑牙的程度具有一定的剂量依赖性，即氟中毒早期，染氟时间越长，饲氟浓度越高，氟斑牙程度越重。但该依赖关系为弱相关关系，且氟斑牙程度有一定自限性，牙发育达一定成熟阶段后，不再受染氟环境影响而变化^[17]。本研究结果显示，从牙齿氟蓄积趋势看，先表现低水平蓄积，逐渐增高且缓慢维持，因此，可以从牙齿氟蓄积水平佐证和解释氟斑牙病变程度的规律。另一方面，这也说明氟斑牙的损害表观较颌骨病损表观更显见，提示口腔临床应该早期关注慢性氟中毒可能导致的颌骨病损，其可能表现为颌骨氟离子累积水平变化，而非简单直接地对应复杂的隐匿变化。本课题组也将同时展开对颌骨氟病损特征的相关研究，研究结果将陆续整理发表。

本研究结果表明：股骨、颌骨、牙齿等硬组织是氟敏感组织。与股骨比较，颌骨富集氟离子的敏感性和蓄积能力更强，牙齿则表现相对滞后的氟蓄积特征。