Mechanism of miR-21 targeting Smad7 in pulmonary fibrosis of A549 cells induced by beryllium sulfate
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摘要:[背景] 铍致肺纤维化发病机制未明且没有特效治疗方法，微小RNA（miRNA）在铍致肺纤维化进程中或可发挥作用。
[目的] 构建微小RNA-21（miR-21）干扰细胞系，探讨miR-21对硫酸铍（BeSO4）所致人肺腺癌肺泡基底上皮细胞（A549细胞）纤维化的影响以及潜在的作用机制。
[方法] 通过在线数据库miRBase预测miR-21靶基因并通过双荧光素酶报告基因实验验证。用miR-21干扰慢病毒转染A549细胞后，用嘌呤霉素筛选出稳定细胞系。使用BeSO4染毒A549细胞建立肺纤维化体外模型，BeSO4浓度为10 μmol·L−1，染毒时间为48 h。将细胞分为对照组、模型组、miR-21干扰组和miR-21干扰对照组。采用实时荧光定量PCR法检测miR-21 mRNA相对表达水平。采用蛋白免疫印迹检测TGF-β1/Smads通路相关蛋白[Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Smad7和转化生长因子-β1（TGF-β1）]表达水平，肌成纤维细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和细胞外基质主要成分Ⅰ型胶原蛋白（COL-Ⅰ）和Ⅲ型胶原蛋白（COL-Ⅲ）的蛋白相对表达水平。
[结果] miRBase预测miR-21与Smad7有结合点位，双荧光素酶报告基因实验结果显示miR-21靶基因为Smad7。miR-21干扰A549细胞系构建成功。与对照组相比，模型组miR-21 mRNA相对表达量升高了97.57%，Smad7蛋白相对表达量下降了15.48%，Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、TGF-β1、α-SMA、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的蛋白相对表达量分别升高了13.55%、35.72%、18.35%、35.75%、25.52%、31.58%、24.61%和11.66%，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。相较于干扰对照组，干扰组miR-21 mRNA相对表达水平降低28.96%，Smad7蛋白相对表达量升高了19.07%，Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、TGF-β1、α-SMA、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的蛋白相对表达量降低了8.01%、19.95%、14.56%、19.37%、11.95%、10.96%、18.81%和31.36%，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。模型组与干扰对照组的各基因及蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。
[结论] 在铍化合物诱导的肺纤维化体外模型中，miR-21可能通过靶向Smad7调控TGF-β1/Smad信号通路促进了纤维化的发生。
Abstract:[Background] The pathogenesis of beryllium-induced pulmonary fibrosis is unknown and there is no specific treatment for the disease as yet. MicroRNA (miRNA) may play a role in the process of beryllium-induced pulmonary fibrosis.
[Objective] To construct a microRNA-21 (miR-21) interfering cell line, and to investigate the effect of miR-21 on beryllium sulfate (BeSO4)-induced fibrosis in human lung adenocarcinoma alveolar basal epithelial cells (A549 cells) and its potential mechanism.
[Methods] The miR-21 target genes were predicted by the online database miRBase and verified by experiments using dual luciferase reporter gene. After transfecting A549 with miR-21interference lentivirus, puromycin was used to select a stable cell line. An in vitro model of pulmonary fibrosis was established using BeSO4 infecting A549 cells with a concentration of 10 μmol·L−1 and an exposure time of 48 h. Then the treated cells were divided into control group, model group, miR-21 interference group, and miR-21 interference control group. Real-time fluorescent quantitative PCR (RT-qPCR) was used to detect the relative expression level of miR-21 gene. Western blotting was used to detect the relative expression levels of TGF-β1/Smads pathway related proteins [Smad2, Smad3, p-Smad2, p-Smad3, Smad7, and transforming growth factor-β1 (TGF-β1)], myofibrosis cell marker α-smooth muscle actin (α-SMA), andextracellular matrix collagen-I (COL-I) and collagen-Ⅲ (COL-Ⅲ).
[Results] The miRBase predicted that miR-21 had a binding site with Smad7, and the results of the dual luciferase reporter gene experiment showed that the target gene of miR-21 was Smad7. The construction of miR-21 interfered with A549 cell line was successful. Compared with the control group, the relative expression of miR-21 gene in the model group increased by 97.57%; the relative expression of Smad7 protein in the model group decreased by 15.48%; the relative protein expression of Smad2, Smad3, p-Smad2, p-Smad3, TGF-β1, α-SMA, COL-I, and COL-Ⅲ increased by 13.55%, 35.72%, 18.35%, 35.75%, 25.52%, 31.58%, 24.61%, and 11.66% respectively (P<0.05). Compared with the interference control group, themiR-21 gene expression level in the interference group decreased by 28.96%; the relative expression of Smad7 protein increased by 19.07%; the relative protein expression of Smad2, Smad3, p-Smad2, p-Smad3, TGF-β1, α-SMA, COL-I, and COL-Ⅲ decreased by 8.01%, 19.95%, 14.56%, 19.37%, 11.95%, 10.96%, 18.81%, and 31.36% repectively (P<0.05). There was no statistically significant difference in the gene abd protein expression levels of each gene between the model group and the interference control group (P>0.05).
[Conclusion] In an in vitro model of pulmonary fibrosis induced by beryllium compounds, miR-21 may promote fibrosis by targeting Smad7 to regulate the TGF-β1/Smad signaling pathway.
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Keywords:
- microRNA-21 /
- Smad7 /
- beryllium sulfate /
- pulmonary fibrosis /
- transforming growth factor-β1
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铍是一种有毒元素，广泛用于原子能、航空航天、电子、石油、光学仪器、医疗等行业[1]。铍及其化合物是全身毒物，可经皮肤、黏膜和呼吸道进入人体，并主要在肺部蓄积[2]。职业接触铍或其化合物可导致急性铍病和慢性铍病[3]。近年来，随着生产技术的提高和个人防护的加强，急性铍病的发生率大大降低，但长期暴露于低浓度铍引起的慢性铍病仍时有发生，这是一种以肺纤维化为主要表现的疾病[4]。肺纤维化的主要病理特征是成纤维细胞增殖以及细胞外基质沉积[5]，不可逆且无特异性疗法。研究发现，转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）是一种明确致纤维化的关键细胞因子[6]，主要通过TGF-β1/Smads信号通路调节多种生物过程，包括胚胎发生、细胞分化、器官发生和免疫反应等[7]。在生理条件下，TGF-β1是肺形态发生和体内平衡所必需的，而异常的TGF-β1信号已被证明是肺纤维化进展的核心[8]。
微小RNA（microRNA, miRNA）是一种长度为20~22个核苷酸且不编码蛋白质的单链RNA，可以通过与靶基因信使RNA的3'非翻译区（untranslated regions, UTR）结合来调节靶基因的表达[9]，研究表明，miRNA在多种器官组织纤维化、癌症等多种疾病中异常表达[10]，说明miRNA在疾病过程发挥中关键作用。
本研究首先通过双荧光素酶报告基因实验验证Smad7是否为miRNA-21（miR-21）靶基因，然后通过BeSO4染毒A549细胞建立铍及其化合物致纤维化体外模型，并转染miR-21干扰慢病毒构建稳定细胞系，检测相关因子[Smad2、Smad3、磷酸化Smad2（phospho-Smad2, p-Smad2）、磷酸化Smad3（phospho-Smad3, p-Smad3）、Smad7、肌成纤维细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）、TGF-β1、细胞外基质主要成分Ⅰ型胶原蛋白（collagen-Ⅰ, COL-Ⅰ）及Ⅲ型胶原蛋白（collagen-Ⅲ, COL-Ⅲ）]的表达，探讨miR-21在BeSO4所致A549细胞纤维化中的作用及可能机制。
1. 材料与方法
1.1 材料
人肺腺癌肺泡基底上皮细胞（A549细胞）和人胚肾细胞系（293T细胞）购于中国科学院上海细胞库，胎牛血清（BI，以色列），细胞基础培养基（DMEM，BI，以色列），磷酸盐缓冲液（HyClone，美国），BeSO4·4H2O（上海易恩，中国）。兔抗人α-SMA、TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ多克隆抗体（Proteintech，美国），兔抗人Smad2、Smad7多克隆抗体（Affinity，美国），兔抗人Smad3、p-Smad2、p-Smad3多克隆抗体（CST，美国），β-actin（北京博奥森，中国），miRNA提取试剂TRIZOL（Ambion，美国），miRNA cDNA第一链合成试剂盒（北京天根，中国），miRNA荧光定量检测试剂盒（北京天根，中国）。
1.2 miR-21靶基因预测及验证
通过生物信息学方法，用在线靶基因预测数据库miRBase预测miR-21的靶基因是否为Smad7，根据miR-21与Smad7的3' UTR的结合位点，合成Smad7的野生型（wild type, WT）和突变型（mutation type, MU）3' UTR，然后将其分别克隆至载体pSI-Check2中，构建质粒pSI-Check2-WT-Smad7和pSI-Check2-MU-Smad7。将WT和MU质粒以及miR-21模拟物（miR-21 mimic）或miRNA阴性对照（miR-NC）分组转染进293T细胞，设置Smad7-WT+miR-NC组、Smad7-WT+miR-21 mimic组、Smad7-MU+miR-NC组和Smad7-MU+miR-21 mimic组。于转染48 h后，使用荧光素酶检测试剂盒和检测仪检测荧光素酶活性，实验结果以检测到的萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性的比值进行分析，比值显著降低则可判断 Smad7 是miR-21的靶基因。
1.3 细胞培养和染毒
A549细胞和293T细胞均用含10%（体积分数）胎牛血清、1%双抗的DMEM高糖培养基培养于5%（体积分数）CO2、37℃培养箱。取处于对数生长期的细胞进行后续试验。待A549细胞达到约60%融合度时，更换为浓度为10 μmol·L−1 BeSO4的DMEM高糖培养基进行染毒处理48 h。
1.4 慢病毒感染A549细胞
1.4.1 最佳感染复数（multiplicity of infection, MOI）筛选
用胰酶将A549细胞消化后，按照每孔1×104个细胞接种至24孔板中，贴壁后以MOI=10、20、40和80进行慢病毒转染，于感染72 h后应用荧光显微镜观察并最终选择感染效率大于80%且细胞状态良好的最低MOI进行下一步实验。
1.4.2 嘌呤霉素浓度筛选
以每孔1×105个细胞将A549细胞接种到6孔板中，细胞汇合率达到80%时，更换含有不同浓度嘌呤霉素（1、2、4、6和8 μg·mL−1）的完全培养基，取嘌呤霉素处理48 h后能杀死所有细胞的最低浓度用于正式实验。前期实验结果显示最适浓度为2 μg·mL−1。
1.4.3 慢病毒转染及稳转细胞系构建
使用荧光显微镜下呈绿色荧光的miR-21 干扰慢病毒转染A549细胞实现miR-21的抑制，将A549细胞接种到6孔板中，细胞密度为1×105个·孔−1。细胞汇合率达到30%~50%时按筛选出的最佳MOI加入适量病毒，于感染4 h后补全培养液，24 h换液。于72 h后加入2 μg·mL−1嘌呤霉素筛选掉未被病毒感染的细胞，嘌呤霉素筛选48 h后更换培养液用0.25%的胰酶将细胞消化下来，转移至75 cm2培养瓶培养，得到干扰稳定细胞株。
1.5 miR-21 mRNA表达水平检测
将细胞分为4组：对照组、模型组、miR-21干扰组和干扰对照组，模型组、miR-21干扰组和干扰对照组加入浓度为10 μmol·L−1 BeSO4的DMEM高糖培养基培养48 h，对照组使用等量DMEM高糖培养基培养48 h，使用miRNA提取试剂盒提取总miRNA并参照反转录试剂盒说明书合成cDNA，然后进行PCR扩增，引物序列见表1。反应条件为95℃预变性，15 min；94℃变性20 s，60℃退火，延伸34 s，40个循环。以U6为内参，计算基因相对表达量。
表 1实时荧光定量PCR引物序列
Table 1.Primer sequences of RT-qPCR
引物名称 引物序列 U6 正向引物：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGAAT-3' U6 反向引物：3'-GGAACGCTTCACGAATTTG-5' miR-21 正向引物：5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3' 1.6 Smad、TGF-β1、α-SMA、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白表达水平检测
按照蛋白提取试剂盒说明书提取细胞总蛋白并使用BCA蛋白定量法检测总蛋白浓度，蛋白上样量为30 μg，采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜条件300 mA，转膜时间由相对分子量确定，转膜完毕后用含5%脱脂奶粉的含吐温20的三乙醇胺缓冲盐水溶液缓冲液封闭1 h，使用对应特异性一抗4℃孵育过夜，含吐温20的磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤3次，二抗孵育1 h，PBST缓冲液洗涤3次，用化学发光凝胶成像仪曝光，并用凝胶图像Image J 1.52软件测定灰度值，以目的蛋白/内参蛋白（β-actin）计算目的蛋白的相对表达量。
1.7 统计学分析
采用SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料使用Mean±SD表示，组间差异采用单因素方差分析和LSD法检验，检验水准α=0.05。
2. 结果
2.1 miR-21靶基因的预测及验证
经在线数据库miRBase预测，Smad7与miR-21存在结合位点，因此推测Smad7是miR-21的靶基因，见表2。双荧光素酶报告基因实验结果显示，与对应NC组相比，miR-21下调Smad7-WT+miR-21 mimic的荧光素的表达（P＜0.05），说明Smad7是miR-21的直接靶基因，见图1。
表 2miRBase预测miR-21与Smad7结合序列
Table 2.Predictions on the binding sequences of miR-21 and Smad7 by miRBase
基因名称 序列 Smad7 5'-AUAAGCUA-3' miR-21 3'-UAUUCGAU-5' 2.2 miR-21干扰稳定细胞株构建
A549细胞按MOI=10、20、40、80感染慢病毒后，通过荧光显微镜观察转染效率，发现MOI=40时感染效率大于80%且细胞状态良好，最终选择MOI=40为最适感染复数，如图2。
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图 2不同慢病毒转染A549细胞的效率
Figure 2.Transfection efficiencies of different lentiviruses on A549 cells
2.3 A549细胞中miR-21的表达变化
与对照组相比，模型组的miR-21 mRNA表达水平升高97.57%，与干扰对照组相比，miR-21干扰组miR-21 mRNA表达水平下降28.96%，差异均有统计学意义（P＜0.05），而模型组与干扰对照组的miR-21表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。
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图 3BeSO4处理A549细胞48 h后miR-21 mRNA相对表达水平
*：与对照组相比，P<0.05；#：与干扰对照组相比，P<0.05。 Figure 3.Relative expression levels of miR-21 mRNA in A549 cells treated with BeSO4 for 48 h
2.4 A549细胞中Smad的蛋白表达水平
与对照组相比，模型组的Smad7蛋白表达水平下降了15.48%，Smad2、Smad3、p-Smad2和p-Smad3的蛋白表达水平分别升高了13.55%、35.72%、18.35%和35.75%；相较于干扰对照组，miR-21干扰组的Smad7蛋白表达水平升高了19.07%，而Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3的蛋白表达水平分别下降了8.01%、19.95%、14.56%、19.37%，差异均有统计学意义（P＜0.05），模型组与干扰对照组相比，各蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4。
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图 4BeSO4处理A549细胞48 h后Smad蛋白相对表达水平
*：与对照组相比，P<0.05；#：与干扰对照组相比，P<0.05。 Figure 4.Relative expression levels of Smad in A549 cells treated with BeSO4 for 48 h
2.5 A549细胞中TGF-β1、α-SMA、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的蛋白表达水平
与对照组相比，模型组的TGF-β1、α-SMA、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的蛋白表达水平分别升高了25.52%、31.58%、24.61%和11.66%。相较于干扰对照组，miR-21干扰组TGF-β1、α-SMA、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的蛋白表达水平分别下降了11.95%、10.96%、18.81%和31.36%，差异均有统计学意义（P＜0.05）。模型组与干扰对照组相比，各蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5。
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图 5BeSO4处理A549细胞48 h后各组TGF-β1、α-SMA、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白相对表达水平
*：与对照组相比，P<0.05；#：与干扰对照组相比，P<0.05。 Figure 5.Relative expression levels of TGF-β1, α-SMA, COL-Ⅰ, and COL-Ⅲ in A549 cells treated with BeSO4 for 48 h
3. 讨论
肺纤维化的标志是成纤维细胞增殖和细胞外基质过度沉积，细胞外基质会取代功能性组织并破坏器官结构[11]。研究表明，生物化学刺激能引起肺泡巨噬细胞、成纤维细胞等释放多种细胞因子，其中TGF-β1被认为与肺纤维化的发生和形成关系最为密切，它是纤维化病变的起始因子[12]，Smad是TGF-βⅠ型受体激活的信号传导效应物。磷酸化的Smad2、Smad3易位到细胞核后调控靶基因的表达，而Smad7可抑制TGF-β I型受体对Smad2和Smad3的磷酸化，还可招募泛素连接酶，并将泛素连接酶募集到激活的I型受体，导致受体通过蛋白酶体途径降解[13]。TGF-β1/Smad信号传导在肺纤维化中起至关重要的作用。
miRNA是机体生长发育、免疫调节等过程中的重要调节因子，在器官纤维化中起关键调节作用。研究表明，在肺组织纤维化过程中大量miRNA表达异常，其中miR-21已经是一种明确的促纤维化因子[14]。Liu等[15]研究发现，miR-21可通过靶向抑制Smad7表达，促进博来霉素诱导的小鼠肺纤维化。在本研究中，生物信息数据库和双荧光素酶报告基因实验结果显示，与NC组相比，miR-21下调Smad7-WT+miR-21 mimic组的荧光强度，说明Smad7是miR-21的直接靶基因。
本研究结果显示，与对照组相比，模型组中的miR-21 mRNA表达升高，且TGF-β1、α-SMA、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的蛋白表达水平均升高，提示BeSO4诱导A549细胞发生了纤维化。TGF-β1已被证明通过在细胞核中将pri-miR-21加工成pre-miR-21来介导miR-21的转录后激活[16]。因此BeSO4可能是通过诱导TGF-β1表达升高激活了miR-21。同时Smad7的蛋白表达水平下降，p-Smad2、p-Smad3的蛋白表达水平升高。而在抑制了miR-21表达后，相较于干扰对照组，miR-21干扰组miR-21 mRNA表达水平降低，Smad7的蛋白表达水平升高，而Smad2、Smad3的磷酸化减少，TGF-β1、α-SMA、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的蛋白表达水平均降低，说明纤维化情况得到改善。与Li等[17]研究结果一致。与模型组相比，转染了阴性对照病毒的干扰对照组中各因子的基因和蛋白表达水平均无差异，证明转染的阴性对照病毒未在BeSO4致A549细胞纤维化中发生作用。
以上结果表明，在铍化合物诱导的肺纤维化体外模型中，miR-21可能通过靶向Smad7调控TGF-β1/Smad信号通路促进了纤维化的发生。这一过程在抑制了miR-21的表达之后得到了改善。但由于已知miR-21具有多个靶点，因此不能完全排除可能受miR-21干扰影响的其他途径，需要进一步研究。此外本研究仅限于体外铍致肺纤维化模型，今后将会在铍致纤维化小鼠体内模型中进一步深入研究miR-21对TGF-β1/Smad信号通路的调控作用。
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图 2
不同慢病毒转染A549细胞的效率
Figure 2.
Transfection efficiencies of different lentiviruses on A549 cells
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图 3
BeSO4处理A549细胞48 h后miR-21 mRNA相对表达水平
*：与对照组相比，P<0.05；#：与干扰对照组相比，P<0.05。 Figure 3.
Relative expression levels of miR-21 mRNA in A549 cells treated with BeSO4 for 48 h
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图 4
BeSO4处理A549细胞48 h后Smad蛋白相对表达水平
*：与对照组相比，P<0.05；#：与干扰对照组相比，P<0.05。 Figure 4.
Relative expression levels of Smad in A549 cells treated with BeSO4 for 48 h
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图 5
BeSO4处理A549细胞48 h后各组TGF-β1、α-SMA、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白相对表达水平
*：与对照组相比，P<0.05；#：与干扰对照组相比，P<0.05。 Figure 5.
Relative expression levels of TGF-β1, α-SMA, COL-Ⅰ, and COL-Ⅲ in A549 cells treated with BeSO4 for 48 h
表 1
实时荧光定量PCR引物序列
Table 1
Primer sequences of RT-qPCR
引物名称 引物序列 U6 正向引物：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGAAT-3' U6 反向引物：3'-GGAACGCTTCACGAATTTG-5' miR-21 正向引物：5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3' 
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表 2
miRBase预测miR-21与Smad7结合序列
Table 2
Predictions on the binding sequences of miR-21 and Smad7 by miRBase
基因名称 序列 Smad7 5'-AUAAGCUA-3' miR-21 3'-UAUUCGAU-5'
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