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摘要:
聚六亚甲基胍(PHMG)是一种被广泛使用的胍类消毒剂。自韩国发生加湿器消毒剂(主要成分是PHMG)肺损伤事件以来,其吸入毒性引起了研究者的重视与关注。目前国内关于吸入PHMG毒性的研究较少,本文在国内外研究基础上对PHMG的吸入毒性及其他毒性做一综述,系统性介绍了目前已经报道的PHMG毒性,包括吸入毒性及其毒性机制和其他可能毒性如肝脏毒性、心血管毒性、免疫毒性以及生殖和发育毒性,揭示了不规范使用PHMG对机体的影响及其可能的机制,为我国合理使用PHMG消毒剂和后续开展相关研究奠定理论基础与提供科学依据。
Abstract: Polyhexamethyl guanidine (PHMG) is a widely used guanidine disinfectant. Since a lung injury incident induced by humidifier disinfectant (PHMG was identified as a main component) was reported in Korea, its inhalation toxicity has attracted the attention of researchers. At present, there are few domestic studies on inhalation toxicity of PHMG. In this paper, based on the domestic and foreign studies of PHMG, the toxicities of PHMG, including inhalation toxicity and associated toxic mechanism, and other potential toxicities, such as liver toxicities, cardiovascular toxicity, immunotoxicity, and reproductive and developmental toxicity, were systematically introduced, revealing that the effects of use of PHMG in a non-standard manner on the body and its possible mechanisms, which could provide reference for the use of PHMG properly and to lay a theoretical foundation and provide a scientific basis for follow-up study.
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Keywords:
- polyhexamethyl guanidine /
- humidifier /
- disinfectant /
- inhalation toxicity /
- mechanism
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聚六亚甲基胍(polyhexamethylene guanidine, PHMG)是一种无色、无臭和无腐蚀性的胍类消毒剂,一般以盐酸盐、磷酸盐和丙酸盐等盐类形式存在[1]。早期PHMG的毒理学研究中,急性经口和经皮毒性研究显示SD大鼠暴露于PHMG磷酸盐(PHMG phosphate, PHMG-P)的半数致死剂量分别为610 mg·kg−1和大于2000 mg·kg−1;局部毒性研究显示PHMG-P对家兔皮肤无刺激作用;遗传毒性研究显示PHMG-P对小鼠骨髓嗜多染红细胞无致微核作用[2-3]。因此,PHMG消毒剂因其低毒、稳定、易溶于水和强杀菌能力等特性而被广泛应用于医疗卫生、家庭生活、食品工业、水产和畜牧养殖等各个领域[4],其具体使用范围包括空气消毒、环境及普通物体表面消毒、皮肤黏膜消毒、瓜果蔬菜消毒和餐饮具消毒等。
然而,自韩国发生加湿器消毒剂致肺损伤事件以来[5-6],PHMG的吸入毒性开始引起人们的重视与关注。2020年7月,韩国社会灾难调查特别委员会公布调查结果,称在1994—2011年期间,韩国约627万人使用过加湿器消毒剂,其中约67万人因此而健康受损,1.4万人因此而死亡[7]。由此可见,PHMG的吸入毒性不容小觑。目前,已有不少关于PHMG吸入毒性的流行病学与毒理学研究,本文将在此基础上对PHMG的吸入毒性及其他毒性研究进展做一综述。
1. 吸入毒性
2011年春季,韩国暴发不明原因的急性肺损伤事件。患者临床表现有咳嗽和呼吸困难等症状;影像学检查显示患者肺部先呈现多发性灶斑片状实变,随后呈现弥漫性小叶中央磨玻璃不透明结节表现;常规的抗感染治疗与免疫抑制疗法均无效[8]。韩国疾病预防控制中心(Korean Center for Disease Control and Prevention, KCDC)基于此事件开展了病例对照流行病学研究,于同年11月宣布加湿器消毒剂的使用与肺损伤之间存在因果关联[6]。据此,韩国卫生和福利部发布了将加湿器消毒剂从市场上撤出的命令,并且在随后的两年里未监测到加湿器消毒剂致肺损伤事件发生[9]。
春季与冬季是使用加湿器的高峰期,特应性皮炎患者中有超70%的人以及孕妇中有超50%的人使用加湿器[10]。加湿器消毒剂于1994年开始进入韩国市场,主要为氯甲基异噻唑/甲基异噻唑;随后相继出现了PHMG-P和低聚2-(2-乙氧基)乙氧乙基氯化胍[11-13]。市售的PHMG加湿器消毒剂质量浓度(后称“浓度”)一般为1.25 g·L−1,正常用法是将10 mL PHMG加入2 L水中,即使用浓度为0.00625 g·L−1[14]。KCDC对从含PHMG-P消毒剂的加湿器中逸散出来的气溶胶颗粒粒径进行测量,发现其直径在30~80 nm范围内,提示PHMG-P可以进入人体肺部[6]。Lee等[15]对居民实际接触PHMG的量进行了暴露评估,假设卧室风量是50 m3,加湿器每天消耗4 L含PHMG-P消毒剂的水,据此预估PHMG-P室内空气质量浓度为0.056 mg·m−3。而Park等[16]基于卧室风量是27 m3,加湿器每天消耗5 L含PHMG-P消毒剂的水,估算出PHMG-P室内空气浓度为0.945 mg·m−3。由于研究者对空气中PHMG-P浓度评估不一,因此在许多加湿器消毒剂毒性评估中,将室内空气中PHMG-P浓度设定为0.1 mg·m−3[17-18]。此外,大多数患者每天使用加湿器的时间为8 h,至少使用4个月[19]。Shim等[20]研究了吸入PHMG气溶胶颗粒后在生物体内的分布代谢情况,具体方法是将SD大鼠吸入铟-111标记的PHMG,用放射分析方法检测大鼠体内PHMG的分布情况;研究发现,大鼠在吸入铟-111标记的PHMG后,PHMG主要分布在大鼠的肺中,并且在吸入168 h即7 d后,仍有约74%的PHMG在肺中;结果表明,PHMG在肺中大量沉积和缓慢清除可能是其对人体产生吸入毒性的重要原因。
为评估吸入PHMG是否可以造成模型动物肺损伤以及其中涉及的毒理机制,在对人体接触PHMG水平暴露评估的基础上,研究者开展了相关的动物实验研究。Park等[18,21]采用经鼻吸入方式使SD大鼠吸入1.6 mg·m−3 PHMG-P,每天6 h,每周5 d,持续4周,CT扫描大鼠肺部呈现与患者相似的肺损伤表现;组织病理学结果亦与患者相似,为典型的细支气管中心破坏伴炎症和纤维化,包括肺泡巨噬细胞增加、鳞状上皮化生和上皮细胞坏死。在另一项亚急性毒性研究中采用了与上述相同的染毒方式,使SD大鼠吸入1.5 mg·m−3 PHMG-P,每天4 h,每周5 d,持续3周,大鼠肺部炎性细胞因子水平和纤维连接蛋白mRNA表达增加,同样提示了大鼠肺部出现了炎症和纤维化;同时,在其利用空气-液体界面方法培养人肺源性细胞系研究PHMG-P毒性作用时,发现PHMG-P促进细胞因子白介素-6(interleukin-6, IL-6)、IL-8和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)表达和增加可促进肺成纤维细胞增殖的转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)水平以及诱导细胞产生活性氧[17]。Jung等[22]发现PHMG诱导人肺泡上皮细胞A549中与细胞死亡相关的基因表达,抑制抗氧化基因表达。上述研究提示了细胞因子介导的炎症反应、TGF-β表达增加和氧化应激可能是PHMG诱导肺纤维化的机制[23-26]。为了深入探讨机制,Kim等[27]用c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)抑制剂抑制JNK激活,发现PHMG诱导A549细胞产生炎性细胞因子的水平降低,提示了PHMG可能是通过激活JNK信号通路诱导肺上皮细胞产生炎症反应。MUC5AC是气道中主要的黏液蛋白基因,与阻塞性呼吸系统疾病的发生有关;PHMG增加人支气管杯状细胞中MUC5AC基因和蛋白的水平,但当分别抑制JNK、p38和toll样受体(Toll-like receptor, TLR)时,均可降低MUC5AC的水平,提示PHMG通过TLR-p38和JNK信号通路诱导MUC5AC过表达,进而造成肺纤维化[28]。在Park等[29]的研究中揭示了PHMG通过氧化应激介导DNA损伤抑制肺上皮细胞增殖和促使肺上皮细胞凋亡。Jeong等[30]用荧光素异硫氰酸酯(fluorescein isothiocyanate, FITC)与PHMG-P合成了PHMG-P-FITC与A549细胞共培养;发现PHMG-P迅速定位于细胞内质网上,引起内质网应激介导的细胞凋亡。Lee等[31]在一项病例对照研究中,发现使用PHMG加湿器消毒剂致肺损伤的病例组患者Notch同源物1(Notch homolog 1, Notch1)表达水平高于未使用PHMG加湿器消毒剂的对照组患者,差异有统计学意义;同时,在动物实验研究中,亦发现PHMG通过Akt/Notch信号诱导上皮间充质转化,结合流行病学与毒理学研究进一步揭示了PHMG诱导肺纤维化的机制[32]。本节以韩国加湿器致肺损伤事件为切入点,通过流行病学研究证实了吸入PHMG与肺损伤之间的因果关联,通过毒理学研究发现PHMG通过促进肺部细胞因子表达、氧化应激和内质网应激等诱导肺部炎症与肺纤维化。
2. 肝脏毒性
2006年8月—2007年5月期间,在俄罗斯的44个地区有12500人因饮用非法廉价的“伏特加”(一种含PHMG-P的非饮用类酒精产品)而中毒入院,其中有1175名患者死亡。中毒患者表现出头晕、恶心、呕吐、食欲缺乏、乏力、黄疸和皮肤瘙痒等症状;与传统的酒精性肝病相比,肝活检表现出不同的局部胆汁淤积。通过对其中579例患者的临床表现和实验室检查结果分析,推断胆汁淤积性肝炎可能与酒精中含PHMG的成分有关联[33]。2011年,Solodum等[34]对俄罗斯无登记或者低成本的酒精产品进行化学成分分析并做毒理学评价,在一些酒精产品中PHMG浓度高达515 mg·L−1,超出毒理学研究关注的水平,提示了这些酒精产品中因含有较高浓度的PHMG而不宜饮用;即使是适量饮用,可能也会使PHMG水平超出可接受的每日摄入量。
动物实验中,SD大鼠吸入铟-111标记的PHMG 1 h后,用放射分析方法检测大鼠体内PHMG的分布情况。相对于肾脏和心脏等其他器官而言,大鼠肝脏中第7天仍可检测出PHMG,提示肝脏可能是PHMG诱导毒性的重要靶器官[20]。Yushkov等[35]用50 mg·kg−1剂量对大鼠进行一次性腹腔注射,分别于1、2、3、7 d后将大鼠安乐死。血常规检测发现,PHMG升高大鼠血液中中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和红细胞沉降率水平;2~3 d后,大鼠出现中毒性肝炎,胆红素和谷草转氨酶水平升高。在一项亚慢性毒性实验中,分别用0.006、0.012、0.036 mg·kg−1三个剂量的PHMG对SD大鼠灌胃90 d,三个剂量均可引起大鼠轻度中央周围肝细胞变性[36]。将斑马鱼饲养于含0.3% PHMG的环境中,谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平均升高,肝脏脂肪堆积[37]。
为了进一步研究PHMG肝毒性及其可能的机制,将人肝脏来源的HepG2细胞与PHMG共培养72 h,发现PHMG降低HepG2细胞活力,呈时间和浓度依赖效应;PHMG降低HepG2细胞中线粒体膜电位并且激活凋亡信号通路;此外,PHMG诱导HepG2细胞产生内质网应激,表现为C/EBP(CCAAT enhancer binding protein)同源蛋白(CHOP)和磷酸化的肌醇酶1α水平的升高;经内质网应激抑制剂牛磺熊去氧胆酸预处理可预防上述改变,提示PHMG通过诱导肝细胞产生内质网应激介导细胞凋亡,可能是其肝毒性的重要机制[38]。本节从俄罗斯居民因误服含PHMG的酒精产品中毒事件切入,提示PHMG可能具有肝毒性,并且通过动物实验和细胞实验证实了PHMG通过诱导肝脏细胞线粒体损伤和内质网应激,介导肝脏细胞凋亡,进而发挥肝毒性。
3. 心血管毒性
在Kim等[37]的消毒剂急性心血管毒性研究中,将从青年男性血清中分离出的低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)与0.3% PHMG在37℃,5% CO2条件下共培养,用光谱与电泳进行结果分析。与对照组比较,经PHMG处理的LDL,其共轭二烯含量增加了26%;且通过琼脂糖凝胶电泳实验发现PHMG组LDL的迁移速度更快;上述实验结果表明PHMG增加了LDL氧化修饰;在LDL摄取实验中,PHMG使人单核巨噬细胞系THP-1细胞摄取氧化修饰的LDL的量增加了1.5倍。研究提示了氧化修饰的LDL越多,巨噬细胞吞噬的越多,则产生致动脉粥样硬化的泡沫细胞越多。将斑马鱼饲养于含0.3% PHMG的水溶液中,Masson三色染色显示,从斑马鱼动脉球部纵切面上可以看到PHMG使胶原积累增加;同时活性氧荧光探针-二氢乙啶染色显示PHMG组产生的活性氧水平最高;上述结果揭示了PHMG促使胶原积累可能与其诱导机体产生氧化应激有关联。本节通过体外实验介绍了PHMG可能有增加动脉粥样硬化的风险,还需体内实验进一步证实。
4. 免疫毒性
在PHMG吸入毒性和心脏毒性等研究中,均有炎症反应的参与,提示PHMG可能对机体的免疫系统有一定的影响。Song等[39]分别用0.9 mg·kg−1和1.5 mg·kg−1两个剂量的PHMG-P给C57BL/6小鼠进行一次性气管滴注,分别于第7天和第14天观察小鼠脾脏和胸腺的变化;与对照组相比,小鼠脾脏于第7天质量降低,但于第14天恢复至正常。小鼠胸腺在第7天和第14天质量均降低;组织学观察发现小鼠胸腺细胞数量降低,皮质和髓质减少。此外,PHMG-P抑制小鼠胸腺中T细胞表达的T-box(T-box expressed in T cells, T-bet)和GATA结合蛋白3(GATA binding protein 3, GATA3)的基因表达,而T-bet和GATA3分别是辅助性T淋巴细胞1(T helper 1, Th1)和辅助性T淋巴细胞2(T helper 2, Th2)发育的关键调控因子[40-41],据此推断PHMG-P可异常调节T细胞的分化,影响T细胞的发育。
在Kim等[42]的PHMG-P致炎症反应及其机制的研究中,将小鼠来源的巨噬细胞系RAW264.7与PHMG-P共培养。PHMG-P具有细胞毒性,呈剂量依赖性,在培养第6小时和第24小时,其半数致死浓度分别为11.15 mg·mL−1和0.99 mg·mL−1。进一步研究表明,PHMG-P诱导巨噬细胞分泌促炎性因子IL-6、IL-8和IL-1β。机制研究中发现,PHMG-P通过降解核因子κB抑制蛋白α(nuclear factor kappaB inhibitor-alpha, IκB-α),激活核因子κB信号通路,进而促使炎症因子的释放。本节介绍了吸入PHMG可干扰T细胞发育以及体外实验发现PHMG可诱导巨噬细胞产生炎症反应,但目前关于吸入PHMG对免疫系统影响的研究有限,还需进一步研究其对机体免疫系统的影响及其可能的机制。
5. 生殖与发育毒性
在韩国“加湿器消毒剂致肺部疾病”事件中,孕妇因在冬季长期使用加湿器,并且因其在妊娠期黄体酮水平增加,其潮气量和呼吸频率均高于非孕妇,因而更容易患由加湿器消毒剂引起的广泛性肺部疾病[12]。此外孕期暴露于有害的环境因素不仅会影响孕妇本身,还可能会对胎儿产生影响[43]。在流行病学研究中发现,PHMG-P诱导的致命性特发性肺部疾病主要发生在孕妇和产妇中,并且婴儿和幼童肺部疾病也有报道[44]。在动物研究方面,Lee等[45]将受孕的SD雌鼠随机分成四组,分别吸入0.00、0.14、1.60、3.20 mg·m−3四个浓度的PHMG-P,每天吸入6 h,至分娩结束,发现3.20 mg·m−3的PHMG-P可降低胎鼠体重以及延缓胎鼠骨骼骨化;在用灌胃方式给予受孕SD雌鼠不同剂量PHMG-P的研究中,同样发现在最高剂量组即120 mg·kg−1组,仔鼠的体重降低[44]。Kim等[46]将斑马鱼胚胎分别饲养于不同浓度的商用加湿器消毒剂(主要成分是PHMG-P)混合液和仅有PHMG-P的环境中,均表现出体长缩短、胚胎凝固和未孵化即死亡的现象;机制研究揭示了PHMG-P可能是通过诱导斑马鱼产生氧化应激和干扰甲状腺激素系统的平衡,引起胚胎发育迟缓。本节通过加湿器消毒剂事件,提示吸入PHMG可能影响婴幼儿发育;通过动物实验发现无论是吸入PHMG还是口服PHMG,均可影响胚胎发育。
6. 小结与展望
合理规范使用化学消毒剂可控制病原微生物和遏制传染病流行;若不规范使用,可能成为健康隐患。PHMG因其不易挥发,所以在用作加湿器消毒剂之前,未对其进行呼吸毒性和其他特殊靶器官毒性评估,导致了后续的加湿器消毒剂肺损伤事件和其他毒性作用。目前韩国已经禁止生产和使用PHMG类消毒剂,欧盟则在PHMG类似产品上标注了禁止喷雾使用[47]。PHMG在我国具有广泛的用途,其实际使用浓度相对安全;我国虽然没有将PHMG作为加湿器消毒剂,但在其他一些用途上具有潜在吸入的可能性,如职业人群暴露、用于空气消毒、喷雾类消毒产品和被添加到某些治疗鼻炎的喷雾剂中等[48]。
本综述结合国内外研究系统性介绍了PHMG目前的毒性研究进展,可为监管及科学使用PHMG消毒剂和进一步开展PHMG的暴露评估及后续研究提供理论基础和科学依据。不过目前的研究中尚存在以下几个方面的问题:(1)吸入PHMG对呼吸系统的影响大部分聚焦在对下呼吸道的影响,对上呼吸道的影响研究较少;(2)目前主要是研究吸入PHMG对呼吸系统的影响,对其他系统如免疫和心血管等系统影响的研究虽有涉及,但还需进一步研究其中的机制。在接下来的研究中,需要深入探讨吸入PHMG对其他系统的影响,为全面评估PHMG吸入毒性提供科学依据。
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