昼夜节律是指生物体的生理、生化和行为呈现以24 h为周期的变化，在器官水平上分为中枢节律和外周节律，中枢节律是指下丘脑视交叉上核中细胞的昼夜节律。光照是最重要的中枢授时因子，并通过激素释放等机制使机体各器官昼夜节律保持同步化^[1]。细胞昼夜节律呈现自主性，在基因层面由多个转录-翻译正、负反馈环路构成，转录因子脑和肌肉组织芳香烃受体核转运体类似蛋白1（brain and muscle ARNT-like protein 1, BMAL1）和昼夜活动输出周期障碍蛋白（circadian locomotor output cycles kaput, CLOCK）异二聚体与染色体上增强子区域（enhancer-box, E-box）结合，激活包括节律抑制因子Rev-erbα的转录，REV-ERBα蛋白进入细胞核抑制Bmal1转录，形成最重要的负反馈环路，维持昼夜节律的稳定性^[2-3]。该环路还在体温调节、胰岛素分泌、葡萄糖稳态和脂质代谢等生理功能调节中发挥重要作用^[4-5]。

肝脏是重要的代谢器官，肝细胞对脂肪酸的摄取、氧化、合成及释放过程在基因转录水平受到昼夜节律基因的精细调控^[6-7]。REV-ERBα作为串联昼夜节律与代谢的重要因子，其缺失将导致肝脏脂肪变性^[8-9]，而Bmal1缺失将加重小鼠高脂饮食诱导的胰岛素抵抗和肝脏脂质沉积^[10]。肝脏Bmal1特异敲除小鼠肝脏和血液中甘油三酯（triglycerides, TG）和胆固醇含量升高，重新在肝脏表达Bmal1能够缓解上述症状^[7，11]。本课题组前期通过改变实验室光照周期引起小鼠昼夜节律紊乱，发现4周处理导致小鼠在光照期空腹血糖和肝糖原含量升高，部分肝脏糖和脂质代谢相关基因表达的时相前移，如Foxo1和Pparα分别前移2.54 h和1.06 h^[12]。

双酚A（bisphenol A, BPA）是大量生产并在生活中广泛使用的工业化学品，其在人群中的检出率已经超过90%^[13]，BPA可干扰肝脏的脂质代谢稳态^[14-15]。美国国家健康与营养调查（2005—2014年）的数据显示，相对于尿液BPA含量最低四分位的人群，尿液BPA含量处于第三、第四分位的人群非酒精性脂肪肝风险分别升高69%（OR=1.69，95%CI=1.39~2.04）和44%（OR=1.44，95%CI=1.19~1.76）^[16]。韩国国家环境健康调查（2015—2017年）的研究结果类似，尿液中BPA含量最高的四分位人群，相对于尿液含量最低的四分位人群，非酒精性脂肪肝风险升高32%（OR=1.32，95%CI=1.03~1.70）^[17]。基于中国人群的队列研究观察到成年人尿液BPA浓度与中心型肥胖、糖脂代谢紊乱的发病风险呈正相关^[18-20]。

动物实验也观察到BPA暴露可引起肝脏脂质代谢紊乱。早期一项研究发现6周龄雄性CD-1小鼠经食物暴露于5、50、500、5000 μg·kg⁻¹·d⁻¹ BPA 28 d，在低剂量范围内（5、50 μg·kg⁻¹·d⁻¹）肝脏TG含量增加，肝脏脂质合成基因（Fas、Acaca、Scd等）表达升高，Pparα表达水平下降，而Pparγ表达水平上升，转录因子Srebp1c、Srebp2和Chrebp表达水平升高^[21]。但在既往研究中，有关BPA暴露引起肝脏脂质沉积的结果也有不同报道。Marmugi等^[22]在2014年发表的研究中报道雄性CD-1小鼠在经口暴露50、500 μg·kg⁻¹·d⁻¹ BPA 8个月后观察到肝脏重量无明显变化，但肝脏总胆固醇（total cholesterol, TC）含量增加，胆固醇合成基因Lss、Hmgcr和Sqle表达上调；Lin等^[23]观察到雄性C57BL/6J小鼠经口给予50 μg·kg⁻¹·d⁻¹ BPA 90 d后肝脏重量增加，肝脏TG含量增加而TC水平未见明显变化。

昼夜节律紊乱与BPA暴露是肝脏脂质沉积的独立危险因素，但二者的联合效应并不清楚。课题组前期研究发现光照周期改变和BPA暴露均可促进雌性小鼠肝脏脂质沉积，其机制可能与肝脏Acaca、Cyp7α1、Srebp1c和Srebp2基因mRNA表达水平改变有关，但基因之间交互调控机制未得到深入研究^[24]。

本研究以雌性C57BL/6J小鼠为研究对象，首先观察昼夜节律核心基因及肝脏脂质代谢调节基因表达的昼夜节律；然后在12 h/12 h的实验室光照周期中，选择开灯3 h后（光照期）和关灯3 h后（黑暗期）两个时间点进行BPA染毒，探索不同昼夜节律时间点BPA暴露对小鼠肝脏脂质代谢的影响及机制。

无特定病原体（specific pathogen free, SPF）雌性C57BL/6J小鼠购于广东省医学实验动物中心，合格证号为：NO.44007200067346，饲养于广州市疾病预防控制中心屏障级实验动物设施，室温（22±2）℃，相对湿度50%~75%，严格控制光照/黑暗（12 h/12 h），开灯时间为当地时间早上7点，关灯时间为当地时间晚上7点。实验期间动物自由饮水进食。实验前小鼠经检疫程序在屏障设施环境中适应喂养2周。本实验方案由广州市疾病预防控制中心动物伦理委员会审查批准，批准日期2019-03-08。

分别以北京时间7：00和19：00为光照开始（记为ZT0）和结束（记为ZT12）时间。首先开展昼夜节律基线实验，采用随机数表法根据体重随机将小鼠分为7个组，每组5只，分别在ZT0、ZT4、ZT8、ZT12、ZT16、ZT20、ZT24（即下一个周期的ZT0）时间点处死，获取小鼠基因昼夜节律振荡情况，确定后续实验染毒时间。随后开展BPA染毒实验，光照期染毒时间点为ZT3，黑暗期染毒时间点为ZT15。采用随机数表法根据体重将30只雌性C57BL/6J小鼠随机分为6组，每组5只。BPA（美国Sigma-Aldrich）溶解于玉米油中，染毒剂量为50、500 μg·kg⁻¹·d⁻¹，分别在ZT3、ZT15给予灌胃处理，每天1次，连续4周。

在每周第1天进行体重测定，第2周开始单笼饲养小鼠观察活动情况。

在实验结束时，小鼠提前禁食24 h，不禁水。对于基线实验小鼠，从ZT0开始，ZT24截止，每隔4 h处死一组小鼠。对于BPA染毒实验小鼠，在ZT3处死。根据体重，每只行1%戊巴比妥钠（美国Sigma-Aldrich）溶液腹膜内注射麻醉，经下腔静脉采血，离心后收集血浆。采血完毕后，收集肝脏并称重，样品液氮急冻后保存于−80 ℃冰箱。

取收集的血浆，解冻后，采用葡萄糖检测试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol, LDL-C）检测试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol, HDL-C）检测试剂盒、TG检测试剂盒、TC检测试剂盒（广州东林）在全自动生化分析仪（美国Drew Scientific）测定血浆葡萄糖、LDL-C、HDL-C、TG、TC水平。取收集的肝组织，按照组织TG酶法测定试剂盒（北京普利莱）说明书操作步骤，加入裂解液研磨成匀浆，取上清稀释5倍后，用酶标仪在550 nm波长下测定各孔光密度，计算肝组织TG含量，采用蛋白浓度校正含量。

取收集的小鼠肝组织，加入Trizol（美国Thermo Fisher）提取总RNA并定量分析后，采用逆转录试剂盒（日本Takara）将RNA逆转录为cDNA。采用实时荧光定量PCR法测定脂质代谢及昼夜节律相关基因的表达。按照说明书设计总量为10 μL的反应体系，每个样品设3个复孔。所有操作均在冰上进行。运行参数：①50 ℃、2 min，95 ℃、10 min，1个循环；②95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，重复40个循环；③95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，1个循环；获得熔解曲线。内参为β-肌动蛋白（β-actin），计算2^−ΔΔCt获得目的基因的相对表达水平。引物由上海捷瑞生物技术公司合成。本研究检测脂质代谢基因Chrebp、Srebp1c、Fasn、Acc1、Cpt1α、Ldlr和昼夜节律相关基因Bmal1、Clock、Rev-erbα。引物序列见表1。

采用SigmaPlot 14.0进行余弦分析和曲线拟合分析基因的节律性，绘制昼夜节律相位图。采用SPSS 21.0软件进行统计分析，GraphPad 7.0绘制图。不同组别不同时间点体重比较采用重复测量设计资料的方差分析；多组间血浆生化指标、肝脏TG、基因表达水平比较采用单因素方差分析，组间均数两两比较采用LSD检验或Dunnett T3检验。检验水准α=0.05（双侧）。

昼夜节律相关基因Bmal1、Clock、Rev-erbα及脂质代谢的转录因子编码基因Chrebp、Srebp1c转录呈现节律性。Bmal1、Clock和Chrebp转录水平峰相位在ZT0，Rev-erbα转录水平峰相位在ZT8，Srebp1c表达水平峰相位在ZT20。见图1。

实验期间，各组小鼠精神状态良好，饮食进水正常。不同灌胃时间点各BPA染毒组小鼠体重与各自的对照组相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

与对照组相比，BPA染毒组小鼠血浆葡萄糖、LDL-C、TG、TC差异无统计学意义（P> 0.05）。与对照组相比：ZT3染毒时50 μg·kg⁻¹·d⁻¹ BPA染毒组小鼠血浆HDL-C含量降低了14.56%（P<0.05）；ZT3染毒时BPA染毒组小鼠肝脏TG含量没有明显变化（P=0.056），但ZT15染毒时50 μg·kg⁻¹·d⁻¹ BPA组的小鼠肝脏TG含量增加了115.20%（P<0.05）。见图3。

在脂质代谢基因表达方面，ZT3染毒时50、500 μg·kg⁻¹·d⁻¹ BPA组小鼠Srebp1c mRNA表达较对照组分别下调了38.60%、32.66%（P<0.05），而在ZT15染毒时分别上调了75.48%和74.23%（P<0.05）；ZT15染毒时50、500 μg·kg⁻¹·d⁻¹ BPA组Chrebp mRNA表达较对照组分别上调了86.40%和135.40%（P<0.05），500 μg·kg⁻¹·d⁻¹ BPA组Acc1 mRNA表达较对照组上调了74.20%（P<0.05）。见图4。

在昼夜节律相关基因表达方面，ZT3染毒时50 μg·kg⁻¹·d⁻¹ BPA组小鼠Bmal1 mRNA表达较对照组上调了119.96%，Rev-erbα mRNA表达下调了55.87%（P<0.05），而ZT15染毒时50、500 μg·kg⁻¹·d⁻¹组小鼠Bmal1 mRNA表达较对照组分别下调了59.56%、27.81%，500 μg·kg⁻¹·d⁻¹组小鼠Rev-erbα mRNA表达上调了33.27%（P<0.05）。见图5。

BPA是一种具有类雌激素效应的环境内分泌干扰物，人群流行病学研究显示BPA暴露与肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝等相关^[25]，课题组前期动物实验也发现BPA暴露可导致肝脏脂质沉积^[21，24]。本研究旨在比较不同昼夜节律时间点BPA染毒对小鼠肝脏脂质代谢的影响，发现黑暗期BPA染毒上调小鼠昼夜节律关键基因Rev-erbα，下调Bmal1，上调脂质代谢基因Srebp1c和Chrebp及其靶基因Acc1表达水平，促进肝脏脂质沉积；而在光照期染毒则下调Rev-erbα，上调Bmal1，进而抑制Srebp1c转录，肝脏脂质沉积不显著。

近年来许多研究表明外源性化学物的毒性与染毒时间存在一定的关联，在相同的剂量、染毒方式下，由于不同昼夜节律时间点机体对外源化学物的敏感性不同，从而造成毒效应的不同，融合时间生物学和毒理学研究方法探讨外源性化学物与机体内源性昼夜节律相互作用的“时间毒理学”的概念逐渐受到重视^[26-27]。本研究显示ZT15 BPA染毒时小鼠肝脏TG含量升高，ZT3染毒时则没有这种改变，表明小鼠黑暗期暴露于BPA对肝脏脂质代谢影响更大。肝脏昼夜节律与脂质代谢密切相关，但调节机制尚未阐明。SREBP1c和ChREBP是调节肝脏脂肪从头合成（de-novo lipogenesis, DNL）的主要转录因子，直接激活脂肪酸合成酶基因Acc1和Fasn的转录，促进DNL，引起肝脏脂质沉积^[28]。昼夜节律抑制因子REV-ERBα作为核受体直接参与脂质代谢基因的转录调控，也可通过与其他昼夜节律因子构成的转录-翻译反馈环路间接参与肝脏代谢的调控^[29-30]。昼夜节律因子BMAL1通过Srebp1c、Chrebp调节胆固醇和脂质稳态相关基因的表达，肝脏Bmal1特异敲除小鼠肝脏中Srebp1c、Chrebp表达下降^[31-32]。本研究观察到ZT15染毒时，小鼠肝脏Rev-erbα mRNA表达水平在BPA染毒组中升高，Bmal1 mRNA表达水平在BPA染毒组降低，Srebp1c、Chrebp mRNA表达水平显著上调，靶基因Acc1 mRNA表达水平也相应地上调，而在ZT3染毒时BPA暴露未引起上述基因mRNA表达水平发生显著变化，提示小鼠肝脏在ZT15时间点对BPA更敏感。Nguyen等^[33]的研究中观察到生命早期BPA暴露干扰肝脏昼夜节律信号通路及脂质代谢通路，显示肝脏昼夜节律和脂质代谢均为BPA的毒性靶点。有研究提示REV-ERBα可以抑制BPA主要代谢解毒酶尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸基转移酶2B（uridine 5'-diphospho-glucuronosyltransferase, UGT2B）活性^[34]，有助于解释ZT15染毒时BPA对小鼠肝脏脂质代谢影响更加显著的现象。

本研究的不足之处包括：一是采用灌胃染毒对小鼠造成紧张刺激可能会影响代谢指标，虽然组间处理方式一致，具有可比性，但不能排除染毒方式与染毒时间的交互作用；二是采用单一性别小鼠，无法观察性别差异；三是仅在两个时间点观察BPA暴露的毒性效应，没有全面评价脂质代谢的昼夜节律变化。

综上，本研究观察了小鼠正常情况下肝脏基因昼夜表达水平变化规律，发现黑暗期（ZT15）暴露BPA更容易引起肝脏脂质沉积。通过mRNA检测发现在ZT15时间点染毒，BPA处理影响昼夜节律基因Rev-erbα和Bmal1的表达，扰乱了昼夜表达规律，DNL基因Srebp1c和Chrebp及其靶基因Acc1表达水平升高，促进了肝脏脂质沉积。本研究提示在化学品毒性测试时应根据毒性终点的昼夜节律选择合适的染毒时间。