手臂振动综合征（hand-arm vibration syndrome, HAVS）是由于长期接触手传振动而引起的慢性、进行性疾病，表现为手部末梢循环障碍、手臂神经功能障碍等病变^[1]，其典型表现为以血管损伤为病理基础的振动性白指。研究表明，长期接触手传振动可导致手部组织压力增加、血管内皮损伤，引起局部血管痉挛收缩^[2]。目前，不少研究通过代谢组学来探索高血压^[3]、糖尿病^[4]、心肌缺血^[5]等疾病与代谢之间的关联，但对于HAVS代谢过程的研究鲜少报道。HAVS是一种多灶性疾病，所涉及的代谢途径十分复杂，目前仍未阐明。代谢组学可反映出生物体在一定时期内受到刺激前后所有小分子代谢物的组成、含量、代谢水平等变化^[6]。超高效液相色谱串联飞行时间质谱联用（ultra-performance liquid chromatography-tandem time-of-flight mass spectrometry, UPLC-QTOF/MS）是一种新兴的代谢组学研究方法，具有样品检测要求低、样品制备过程简单、灵敏度高等优点，可以提高检测的准确度，实现未知化合物组分的鉴定^[7-8]。从代谢组学角度探讨HAVS所涉及的代谢途径有助于深入了解HAVS的发生发展机制。

研究发现，大鼠尾巴对振动引起的生物动力学反应与人类手指的生物动力学反应相似^[9]。大鼠鼠尾振动模型可用来研究振动对于周围血管以及神经组织等的损伤，是HAVS研究中具有良好表征的动物模型^[10-11]。因此，本研究通过UPLC-QTOF/MS，对前期研究建立的同批次大鼠鼠尾振动模型血清进行代谢组学分析，探索局部振动引起大鼠体内血液的代谢物变化情况及其发挥作用的相关代谢通路，为进一步深入研究HAVS的作用机制提供参考依据。

1.   对象与方法

1.1   主要仪器

六度空间HK-75MPT电磁振动台（东莞贝尔），动物固定器（渝中雄雁），Xevo G2-S Q-TOF飞行时间质谱仪（美国Waters），ACQUITY I CLASS超高效液相色谱仪（美国Waters），D3024R冷冻离心机（美国Scilogex），MX-S漩涡振荡器（美国Scilogex）。

1.2   动物及分组

选取32只7~8周龄的SPF级雄性SD大鼠，初始体重为（211.3±11.1）g，随机选取14只大鼠作为对照组（Ctrl组），剩余18只大鼠随机分为7 d振动组、14 d振动组，每组9只。将各组大鼠在同一房间进行适应性喂养一周后用于鼠尾振动模型制备，室温保持在（25±2）℃，12 h光暗循环的光照条件，控制环境参数（如电磁振动台噪声不高于70 dB）等。本次动物实验已获得广东药科大学实验动物伦理委员会批准（批号：gdpulac2021212）。

1.3   建立大鼠鼠尾振动模型及振动暴露条件

在实验期间，每只大鼠都被置于一个单独的可限制其头部和身体运动的固定器，并用透气胶贴将鼠尾固定在振动台上^[12]。振动暴露条件：7 d组连续接振7 d，14 d组连续接振14 d，均4 h·d⁻¹，振动频率为125 Hz，频率计权加速度为4.9 m·s⁻²，振动方向为线性垂直振荡；Ctrl组以相同实验条件置于振动台上，但不接触振动。

1.4   动物处理与采血

按每100 g体重腹腔注射3%戊巴比妥钠1 mL 麻醉大鼠，腹主动脉取血，采血管静置2 h后，再置于4 ℃冰箱内3~4 h，待血液凝固后，4 ℃、3 500 r·min⁻¹（离心半径15 cm）离心10 min，取上清液置于离心管中，放置于−80 ℃超低温冰箱保存待用。

1.5   代谢组学样品制备

样本处理前在4 ℃条件下缓慢解冻，准确量取100 μL血清置于离心管中，加入300 μL预冷甲醇（含0.1%甲酸），涡旋振荡10 s，超声10 min，然后在−20 ℃下静置1 h，取出后在室温下涡旋振荡10 s，4 ℃下14000 r·min⁻¹（离心半径15 cm）离心10 min，取上清液置于离心管中，重复静置、涡旋、离心步骤2次，然后取200 μL上清液于进样瓶中，保存于−20 ℃冰箱中待测。分别从每份按上述条件制备的样品中取10 μL上清液混合均匀，作为质量控制样品；在分析开始前连续进样10次质控样品用于观察仪器状态和平衡系统；在分析过程中每分析8次样品插入1次质控样品，用于评价分析过程中系统的稳定性。

1.6   技术检测条件

实验采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱进行分离，柱温为40 ℃，流速为0.4 mL·min⁻¹，流动相A为超纯水（含0.1%甲酸），流动相B为乙腈（含0.1%甲酸），进样量为5 μL。梯度洗脱程序如下。初始比例为乙腈∶水=10%∶90%，保持0.2 min；第二步比例为乙腈∶水=50%∶50%，保持2.8 min；第三步比例为乙腈∶水=99%∶1%，保持5 min；第四步比例为乙腈∶水=10%∶90%，保持2 min。样品经液相分离后采用飞行时间质谱仪进行分析，电喷雾离子源正负模式分别扫描一次。扫描模式：全信息串联质谱；离子源温度：120 ℃；毛细管电压：0.5 kV；锥孔电压：25 V；碰撞电压：20~40 V；扫描时间：0.2 s；扫描范围：质荷比50~1200。

1.7   数据处理及分析

质谱数据经MassLynx4.1软件采集后导入Progenesis QI v2.0软件进行峰对齐、峰提取和去卷积等预处理。代谢物结构鉴定采用精确质量数匹配和二级谱图匹配的方式，检索人类代谢组学数据库。将经处理后的正负离子模式代谢物数据合并，归一化后导入MetaboAnalyst 5.0在线网站进行无监督的主成分分析（principal components analysis, PCA），以及导入SIMCA 14.1 软件进行有监督正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA），Ctrl组与振动组进行新复极差法检验（Dunnett-t检验）。VIP值（variable importance in the projection）为每一个变量对OPLS-DA模型的贡献值；差异倍数（fold change, FC）为某一代谢物在两组间平均表达量的比值，表示代谢物浓度在样本间的差异。最终根据VIP＞1，FC≥1.2或FC≤0.8和P＜0.01筛选出差异性代谢物，并将差异代谢物导入MetaboAnalyst 5.0进行代谢通路分析。利用MetaboAnalyst 5.0以及结合在线数据库分别对Ctrl vs 7 d及Ctrl vs 14 d的差异性代谢物进行代谢通路富集分析，其中通路影响值（Impact）越大表示两组间代谢差异的显著性越高，Impact＞0.1以及P＜0.05则被认为是潜在的目标代谢途径。

2.   结果

2.1   多元统计分析

采用PCA无监督模式对大鼠血清样本间差异进行分析，由图1A显示，Ctrl组的代谢轮廓和7 d组呈现出部分重叠，7 d组和14 d组呈现出部分重叠，而Ctrl组与14 d组无交叉重叠。表明局部振动可影响大鼠体内正常代谢，并且随振动时间的增长，大鼠体内代谢逐渐紊乱。

图  1  三组间大鼠血清代谢物PCA图（A）及血清代谢物OPLS-DA图（B）

Figure  1.  Principal components analysis (A) and orthogonal partial least squares-discriminant analysis (B) of three groups of rat serum metabolites

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OPLS-DA分析（图1B）显示，Ctrl组、7 d组以及14 d组间样本无交叉重叠，存在显著差异，区分明显。模型参数为解释能力R²Y=0.914，预测能力Q²=0.58，表明该差异性模型具有良好的稳定性及预测能力，可用于进一步筛选差异性代谢物。

2.2   差异性代谢物分析

经UPLC-QTOF/MS对大鼠鼠尾振动模型血清进行代谢组学分析，共检测到1438种代谢物。在OPLS-DA分析后，基于VIP＞1，FC≥1.2或FC≤0.8和P＜0.01筛选出差异性代谢物，与Ctrl组相比，7 d组和14 d组分别有26种和119种差异性代谢物；其中，7 d组和14 d组有24种共同差异性代谢物。结合在线数据库将Ctrl vs 7 d与Ctrl vs 14 d之间具有显著影响的差异性代谢物进行信息鉴定。Ctrl vs 7 d以及7 d vs 14 d的主要差异性代谢物为二高-γ-亚麻酸酯、2-羟基丙酸等脂肪酸及其衍生物、磷酰胆碱衍生物等；Ctrl vs 14 d主要的差异性代谢物为二高-γ-亚麻酸酯、2-羟基丙酸等脂肪酸及其衍生物、葡萄糖醛酸、磷酰胆碱衍生物、前列腺素E₂、花生四烯酸衍生物等。考虑到差异代谢物较多，故表格仅展示对代谢通路分析有影响的差异代谢物以及P＜0.005的差异代谢物，详见表1。

表  1  部分差异性代谢物鉴定信息

Table  1.  Partial differential metabolites

中文名称(Chinese name)	英文名称(English name)	FC	P	VIP
二高-γ-亚麻酸酯	Dihomo-γ-linolenate	0.618	0.009	2.434
1-酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱	1-Acyl-sn-glycero-3 -phosphocholine	0.798	0.007	3.339
溶血磷脂酰胆碱(20∶2)	Lysophosphatidylcholine(20∶2)	0.736	0.004	3.224
胆甾烷-3, 7, 12, 25-四醇- 3-葡萄糖醛酸	Cholestane-3, 7, 12, 25-tetrol-3-glucuronide	0.462	0.005	9.504
2-羟基丙酸	2-Hydroxypropanoic acid	2.081	0.000	1.768
2-羟基丁酸	2-Hydroxybutyric acid	2.019	0.002	1.658
丙酸	Propanoic acid	0.460	0.000	1.780
花生四烯酸	Arachidonic acid	0.435	0.006	0.435
前列腺素E2	Prostaglandin E2	0.427	0.001	0.427
前列腺素D2	Prostaglandin D2	0.390	0.034	0.390
心磷脂	Cardiolipin	0.381	0.004	0.381
皮质醇	Cortisol	0.369	0.001	0.369
5α-雄甾烷-3α, 17β-二醇	5 Alpha-androstan-3alpha, 17beta-diol	0.396	0.003	0.396

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2.3   代谢通路分析

代谢通路富集分析结果如图2所示。7 d组中显著变化的代谢途径是甘油磷脂代谢（P＜0.001，Impact=0.017）以及不饱和脂肪酸的生物合成（P=0.031，Impact＜0.001），对代谢通路具有影响的差异性代谢物有二高-γ-亚麻酸酯以及1-酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱；14 d组显著变化的代谢途径为丙酸盐代谢（P=0.004，Impact＜0.001）、戊糖和葡萄糖醛酸盐相互转化（P=0.038，Impact＜0.001）及花生四烯酸代谢（P=0.003，Impact=0.333），对代谢物通路具有影响的差异性代谢物有2-羟基丁酸、丙酸、前列腺素D₂、前列腺素E₂以花生四烯酸。

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  2  大鼠血清代谢通路富集分析及网络图

A：7 d组差异性代谢物通路富集分析；B：14 d组差异性代谢物通路富集分析；在同一图例中P值越小，圆点颜色越深；Impact值越大，圆点越大；C：7 d组、14 d组代谢通路网络图：橙色椭圆代表代谢途径；绿色矩形代表差异性代谢物；蓝色矩形代表不同的振动组；京都基因和基因组百科全书编号表示差异性代谢物：C034242，二高-γ-亚麻酸酯；C04230，1-酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱；C00696，前列腺素D₂；C00584，前列腺素E₂；C00219，花生四烯酸；C05984，2-羟基丁酸；C00163，丙酸。

  2.  Metabolic pathway enrichment analysis and metabolic network of differential metabolites in rat serum

A: Pathway enrichment analysis of 7 d group's differential metabolites; B: Pathway enrichment analysis of 14 d group's differential metabolites; in the same legend, the smaller the P value, the darker the dot; the larger the impact value, the larger the dot; C: Metabolic network of the 7 d group and the 14 d group; orange oval represents metabolic pathway; green rectangle represents differential metabolites; blue rectangle represent different vibration groups; Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes number represents differential metabolites: C034242, dihomo-γ-linolenate; C04230, 1-acyl-sn-glycero-3-phosphocholine; C00696, prostaglandin D₂; C00584, prostaglandin E₂; C00219, arachidonic acid; C05984, 2-hydroxybutanoic acid; C00163, propanoic acid.

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根据P＜0.05，Impact＞0.1可被认为潜在的目标代谢途径，在7 d组中无法判定潜在的目标代谢途径，在14 d组中大鼠血清中代谢变化主要与花生四烯酸代谢有关。

3.   讨论

本研究通过非靶向代谢组学对大鼠鼠尾振动模型血清进行代谢轮廓、差异性代谢物及相关代谢通路的分析，从代谢组学角度研究局部振动引起大鼠体内的代谢变化。

本研究通过UPLC-QTOF/MS对大鼠血清进行代谢组学分析结果显示，局部振动可影响大鼠体内正常代谢，并在14 d组中，引起大鼠代谢紊乱与花生四烯酸代谢相关，其中二高-γ-亚麻酸酯、花生四烯酸、前列腺素E₂等差异性代谢物具有显著影响。研究表明，二高-γ-亚麻酸酯是一种不多饱和脂肪酸，是花生四烯酸合成代谢的中间产物，具有抗血栓的作用^[13]。花生四烯酸是一种含有四个双键的二十碳不饱和脂肪酸，是细胞膜磷脂结构中的天然成分，其主要由血管内皮细胞及平滑肌细胞产生^[14]。花生四烯酸参与维持血管稳态以及调节血管张力^[15-16]，可通过环氧合酶等酶促反应调节内皮细胞及平滑肌细胞^[17]。前列腺素E₂以及前列腺素D₂，则是花生四烯酸在环氧合酶的作用下产生的代谢物，参与血管中炎症反应、血管舒缩功能及血管生成等作用^[18-19]。

此前，本课题组在同批大鼠鼠尾振动模型研究中，观察大鼠鼠尾中动脉血管病理切片发现，与Ctrl组相比，7 d组鼠尾中动脉血管壁皱缩，血管内皮细胞排列紊乱，部分内皮细胞脱落，弹性筋膜层出现断裂，部分血管平滑肌细胞可见空泡化病变；在14 d组中，血管皱缩、内皮细胞脱落、平滑肌细胞空泡化等病变进一步加重，并且血管内皮细胞出现肿胀破裂的现象，表明随着振动时间的增长，大鼠鼠尾血管损伤越严重；并且，还发现了大鼠血浆中的血管调节因子内皮素-1、5-羟色胺与局部振动引起的血管损伤有关^{[12, 20]}。

结合代谢组学研究结果及前期病理研究结果表明在14 d组中，局部振动致大鼠鼠尾血管损伤可能与花生四烯酸代谢有关，这提示了当局部振动达到一定时长后，大鼠体内代谢变化可能参与鼠尾血管损伤作用，为进一步深入研究其发生发展作用机制奠定了基础。有研究表明，内皮素-1可在血管平滑肌细胞中通过活化细胞膜磷脂酶A诱导花生四烯酸释放^[21]，另外，5-羟色胺可通过诱导血管平滑肌细胞中的环氧合酶-2表达增强来诱导花生四烯酸转化为前列腺素^[22]。而Rossen等^[23]的研究发现花生四烯酸可影响内皮细胞的代谢，并使内皮细胞黏附力下降而脱落，这或许解释了我们前期研究中发现随着振动时间的增长内皮细胞脱落加重的现象^[12]。前列腺素E₂可通过其受体诱导血管内皮细胞及平滑肌细胞收缩，从而引起血管收缩^[24-25]。在病理结果中同样观察到了血管收缩^[12]，这可能是由于花生四烯酸以及前列腺素E₂引起血管内皮细胞及平滑肌细胞收缩而导致。

综上，本次代谢组学结果表明，局部振动可引起大鼠体内代谢紊乱，并且在14 d组中具有显著影响的代谢途径为花生四烯酸代谢，其中具有显著影响的差异性代谢物为花生四烯酸、前列腺素E₂及前列腺素D₂。本研究通过UPLC-QTOF/MS对大鼠鼠尾振动模型血清进行代谢组学分析，在阐明振动致血管损伤与花生四烯酸、前列腺素E₂等代谢物的关联性方面具有一定的局限性，但同时亦为进一步研究局部振动致血管损伤的作用机制及寻找潜在生物标志物奠定了基础，为将来探讨HAVS作用机制提供参考。