矽肺是吸入大量游离的二氧化硅（silicon dioxide, SiO₂）粉尘引起的以肺组织弥漫性进行性纤维化为特征的疾病，既是威胁人们身体健康的医学难题，也是危害公共卫生的社会问题^[1]。根据国家卫生健康委员会发布的2020年全国职业病报告，职业性尘肺病及其他呼吸系统疾病11877例（职业性尘肺11809例）^[2]。矽肺纤维化会导致肺部功能严重受损并表现为不同程度的呼吸系统疾病，如咳嗽、咳痰、胸闷，随着病程的恶化，甚至会引起肺结核、气胸等严重并发症^[3]。近年来关于矽肺的研究较多，Chen等^[4]发现阻断自噬降解可能会加重人矽肺病中的肺泡巨噬细胞凋亡，这与Zhao等^[5]发现一致，即靶向肺泡巨噬细胞可能是治疗肺纤维化疾病的前瞻性途径。肺泡巨噬细胞作为一种驻留在肺组织中的固有细胞，在维持肺部内环境的稳定和宿主防御方面扮演着重要角色^[6]。研究表明，在矽肺早期，肺泡巨噬细胞极性转化和活化后能够识别并吞噬SiO₂颗粒，启动炎症反应，通过释放促炎因子、趋化因子等参与矽肺纤维化进程^[3]。尽管如此，由于矽肺病理的复杂性，关于矽肺的研究大多限于探究成纤维细胞在疾病发生发展中的作用^[7-9]，但对接触SiO₂粉尘的肺部巨噬细胞进行生物标记物的识别以及利用生物信息学探究一些潜在的差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）、Hub基因和相关信号通路的文献少有报道，而这将有助于及早发现矽肺并了解矽肺发生发展的分子机制，并为矽肺患者的早期筛检提供候选靶点。因此，需要进一步扩大对矽肺的细胞和分子水平的认识，提高对该病的诊断和防治水平。

随着生物信息学技术的迅猛发展，单细胞RNA测序技术（single cell RNA sequencing, scRNA-seq）和空间转录组测序技术的兴起使得肺部疾病得以深入研究，包括特发性纤维化中内皮细胞异质性的鉴定^[10]以及对损伤的纤维化反应所需的过渡性巨噬细胞的病理亚群的特征^[11-12]，两者的联合使用可以发现细胞在时间维度和空间维度上的完整基因信息^[13-14]。为揭示肿瘤分子生物学的启动事件，进而识别可能作为诊断生物标志物的Hub基因，scRNA-seq和空间转录组测序技术正积极地被用于癌症的研究之中^[15]，但这两者在矽肺中的研究甚少。

本研究旨在基于不同种类的亚群细胞的标记基因，对矽肺小鼠模型巨噬细胞的DEGs进行基因本体分析（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）信号通路分析以及构建蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction, PPI）网络以寻找Hub基因，为后续探索SiO₂粉尘诱导矽肺发病的分子机制及寻找潜在诊断标志物提供依据。

SiO₂颗粒（约80%的颗粒直径在1~5 μm之间；Sigma-Aldrich，美国），二氧化碳培养箱（ESCO，新加坡），高温低速冷冻离心机（Eppendorf，德国），DMEM培养基（Corning，美国），细胞计数试剂（Cell Counting Kit-8, CCK-8）试剂盒（APExBIO，美国）及Spectra Max微板阅读器（BioTek，美国）。

将小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7细胞以每孔1×10⁵个接种在96孔板中，在5%CO₂、37 ℃的条件下继续培养，待细胞完全贴壁后，分别在0、1、3、6、12和24 h，结合前期实验室研究结果^[16]，使用50 μg·cm⁻² SiO₂悬液刺激RAW264.7细胞，接着将CCK-8试剂加入细胞培养液中，37 ℃避光孵育2~4 h。孵育后使用微板阅读器记录450 nm处的光密度，以未含细胞的完全培养基为空白对照，以0 h SiO₂刺激点为平行对照，细胞活力=[(实验孔光密度-空白孔光密度)/(对照孔光密度-空白孔光密度)]×100%。

从南京医科大学实验室购买C57BL/6小鼠（22~30 g），5~6周龄，雄性（避免雌性小鼠生理周期对实验结果的影响），在恒温（23°C）、恒湿（50%）条件下进行12 h：12 h的光/暗循环，自由进食和饮水。采用随机数表法，将小鼠随机分为实验组与对照组，每组各2只，共4只。对照组分为生理盐水（normal saline, NS）7 d组和56 d组，每组各1只。实验组分为SiO₂ 7 d组和56 d组，每组各1只。每组小鼠均采取腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，颈部剃毛后，75%酒精消毒皮肤，手术暴露气管。SiO₂组将制备好的SiO₂混悬液（0.2 g·kg⁻¹，50 mg·mL⁻¹）^[1，16]一次性气管内滴注。NS组给予相同体积的无菌NS。NS组与SiO₂组小鼠均分别在第7天和第56天经磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline, PBS）灌流右心室后收集肺组织。所有用于测序的小鼠经计算机断层扫描、苏木精-伊红染色法、天狼星红染色证实，均已符合疾病模型^[17]。所有动物手术均严格按照《美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》执行。本实验方案由东南大学实验动物伦理委员会批准（20190121002）。

将第7天和第56天收集的肺组织切割成1 mm³大小后使用肺分离试剂盒（Miltenyi Biotech，130-095-927，德国）得到单个细胞，使单个细胞悬浮在含0.04%胎牛血清的PBS中，最终捕获的细胞数目约为1×10⁴。将成功捕获的细胞放置在单个基因组规模的代谢网络中进行反转录，得到条形码编码。测序部分由北京博奥生物技术有限公司完成。先后使用Cell Ranger 4.0.0软件和Cellranger aggr插件对数据归一化进行主成分分析和无监督聚类。

将第7天和第56天收集肺组织后立即用最佳切片温度包埋胶包埋，放于−80 ℃保存，使用冰冻切片机制作10 μm厚度肺组织切片，送至北京博奥生物技术有限公司完成测序。使用10× Space Ranger软件得到特征条形码矩阵，基于10个主成分图进行聚类算法在二维空间中实现点的可视化。

主成分分析降维后选取前主成分并使用R软件（4.0.3）的Seurat包进行均匀流形逼近和投影（uniform manifold approximation and projection, Umap）聚类分析，接着使用Seurat包的Find Markers函数分析模型组小鼠肺组织与对照组小鼠肺组织之间的DEGs，计算差异倍数（fold change, FC）、q值，并根据P＜0.05和log|2FC|≥1的标准筛选DEGs。使用Metascape在线网站（ https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）对巨噬细胞DEGs进行GO功能富集和KEGG信号通路分析，分析DEGs可能参与的生物学过程、分子功能、细胞成分及信号通路等，以各部分基因富集数目排名前5且P＜0.05为入选标准。

利用STRING数据库（ http://string-db.org/）以及Cytoscape软件联合分析构建巨噬细胞差异基因蛋白互作网络。根据CytoHubba插件中5种分类方法：最大邻域分量（maximum neighborhood component, MNC）、最大邻域分量密度（density of maximum neighborhood component, DMNC） 、 径向度（Radiality）、闭合性（Closeness） 、偏心率（EcCentricity），选择每种排名方法的前20个基因。

利用MCODE插件以及Venn软件（ http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）依据连接度筛选出Hub基因以及PPI网络中最显著的模块。接着在R（4.0.3）软件中利用Find Markers函数计算Hub基因的归一化表达值、q值以及log|2FC|。

基于Pang等^[18]公开的数据（矽肺组织来自肺移植的晚期矽肺病患者，对照组的肺组织来自健康捐赠者），在矽肺患者中对筛选出的Hub基因进行验证以及分析本研究SiO₂小鼠模型中Hub基因与其存在的关联性。使用R软件包（3.5.2）生成受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve, ROC），计算曲线下面积（the area under the curve, AUC），判断Hub基因的诊断价值。

数据以平均值±标准误表示。使用SPSS 23.0进行非配对t检验（两组）或方差分析（two-way ANOVA；三组及以上）比较未配对的数值数据。检验水准α=0.05。

本研究一共定义了20个聚类的细胞群，如图1A所示，相较于NS组，SiO₂组7 d和56 d中巨噬细胞数量均增多（图1B、C）。细胞活力实验中，相较于0 h，SiO₂刺激后3 h、12 h、24 h巨噬细胞活力增加（P<0.05）（图1D）。

将筛选到的97个DEGs导入到PPI网络复合体中，该复合体包含了79个节点，824个边界，其中包括75个上调基因和22个下调基因（图2A）。使用Cytoscape软件的MCODE插件对PPI 网络进行分组，形成多个模块。根据评分排名筛选出前2位的模块，分别为16个节点、168个边界和12节点、80个边界（图2B、C）。

通过Metascape软件对全部97个DEGs进行分析，GO分析的结果见表1和表2。上调的DEGs主要富集在中性粒细胞的趋化和迁移、粒细胞的趋化和迁移、髓样白细胞的迁移等生物学过程（表1），而下调的DEGs主要参与髓鞘的调节、脂肪细胞分化的调节、脂质生物合成过程的调节、神经系统发展的调节、脂质代谢过程的正向调节等生物学过程（表2）。在分子功能方面，上调的DEGs主要包含趋化因子活性、趋化因子受体结合、细胞因子活化、CCR1趋化因子受体结合等（表1）。对于细胞成分，上调的DEGs明显富集在溶酶体、质膜的外侧、晚期内吞体等过程中，而下调的DEGs主要包含水解酶活性（作用于酯键）、催化活性（作用于RNA）（表2）。

KEGG分析结果中，上调的DEGs富集于肿瘤坏死因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用通路、白介素-17信号通路、趋化因子信号通路、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用通路中（表1），而下调的DEGs包括过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路和酒精性肝病信号通路（表2）。

Cytoscape中筛选出的20个基因通过Venn重叠出前3个Hub基因：Ccl2、Ccl7、Ptgs2（图3）。其归一化表达值、q值以及log|2FC|结果见表3，其中Ccl2的log|2FC|为2.62，位于三个Hub基因之首。

scRNA-seq结果（图4A）显示，相较于NS组，SiO₂组中巨噬细胞内Ccl2、Ccl7、Ptgs2表达水平增高且均聚集在新增的巨噬细胞内，同时7 d 的表达水平高于56 d。空间转录组测序的结果（图4B）显示，相较于NS组，SiO₂组中巨噬细胞数量以及Ccl2、Ccl7、Ptgs2表达水平升高，7 d组主要分布在炎性浸润区，56 d组分布在炎性渗出伴有实质病变区。

进一步分析矽肺患者肺组织和健康者肺组织中3个Hub基因的水平，发现CCL7、PTGS2是差异基因且为上调基因，而CCL2并非差异基因。通过关联分析，发现CCL7在矽肺患者和矽肺小鼠模型中的差异倍数log|FC|均高于PTGS2。具体差异倍数值如图5A所示。接着基于表达矩阵，利用ROC曲线分析CCL7和PTGS2基因的诊断效能。如图5B-C所示，这2个基因的AUC均>0.7，说明这2个基因对矽肺诊断的敏感度和特异度都很高。

本研究通过scRNA-seq定义了20个细胞簇，发现在SiO₂模型组小鼠中，巨噬细胞数量增加，体外细胞活力实验也显示在SiO₂刺激后，巨噬细胞活力呈时间依赖性上升。在SiO₂处理56 d的小鼠肺组织中，巨噬细胞数量仍持续增高，这可能和巨噬细胞的极化使他们能够获得与矽肺的两个不同阶段相对应的独特的促炎或促纤维化功能有关^[19]。SiO₂激活巨噬细胞后激发了炎症反应，M1巨噬细胞在这一阶段的矽肺中起着至关重要的作用^[20]。随着炎症的发展，肺细胞不断死亡，当损伤达到一定程度时，组织修复开始。组织修复依赖于免疫抑制和促进生长的组织微环境，这个阶段依靠M2巨噬细胞通过分泌抗炎细胞因子白介素-10和TGF-β1来抗炎，促进免疫抑制和组织重塑^[21]。因此，有理由相信SiO₂组7 d小鼠肺组织中巨噬细胞数目增加可能是SiO₂对肺泡巨噬细胞的激活和由此引发的M1极化所致，而56 d巨噬细胞的持续增多可能是巨噬细胞M2向极化的原因。

本研究通过构建PPI网格图以及Cytoscape软件处理后识别了75个上调基因和22个下调基因，上调基因主要富集在趋化因子活化以及受体结合等过程中，这与本研究最终筛选出3个Hub基因（Ccl2、Ccl7、Ptgs2）密切相关，而趋化因子的活化可驱动肺部炎症及纤维化反应^[22]。这3个基因在SiO₂组的表达水平均升高，分布在新增的巨噬细胞中且聚集在炎症浸润伴有矽结节病灶区。根据Pang等^[18]公开的数据，发现在矽肺患者肺组织CCL7和PTGS2为DEGs且为上调，且两者的AUC均高于0.7，证明可作为矽肺诊断的生物标志物，敏感度和特异度都很高。但在临床应用中获取肺组织较难，所以需要进一步探讨所选的基因是否在肺泡灌洗液和外周血中也具有良好的诊断效能。

趋化因子配体-2（C-C chemokine ligand 2, CCL2）通过与C-C趋化因子受体2（C-C chemokine receptor 2, CCR2）结合来介导其作用。在亚慢性和14 d急性矽肺患者肺泡灌洗液中检测到CCL2的蛋白含量升高^[23]，同样地在特发性纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）受试者的支气管肺泡灌洗液和血清样本中也发现CCL2升高^[24]。然而本研究中矽肺患者组织的CCL2水平未见升高，这可能与支气管BALF以及血清的稀释效应有关。尽管如此，以上数据仍提示CCL2的表达在矽肺纤维化形成过程中的重要性，通过检测肺泡灌洗液或者血清的CCL2可能是矽肺或者IPF患者潜在的筛检手段。

前列腺素-过氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2, Ptgs2），又称环氧合酶2（cyclooxygenase 2, COX-2），是参与细胞急性炎症反应的主要分子之一。Wang等^[25]揭示COX-2可能通过高表达参与肺泡炎性反应和肺纤维化早期反应。本研究中SiO₂小鼠肺组织中检测到的COX-2水平低于CCL7、CCL2，但矽肺患者组织中却检测到高水平的COX-2，且AUC大于0.8，诊断效能较高，这可能归因于小鼠和人之间存在物种差异。同时有文献报道COX-2特异性抑制剂可以减少小鼠肝脏和肾脏的纤维化^[26-28]。因此，考虑使用特异的COX-2阻滞剂和一线抗纤维化药物会更安全地抑制纤维化患者疾病进展。

趋化因子配体-7（C-C chemokine ligand 7, CCL7）介导天然和获得性免疫^[29]，对巨噬细胞募集至关重要^[30]。对新冠肺炎患者血浆细胞因子进行检测，发现CCL7与疾病严重程度相关^[31-32]。同时，Kalafatis等^[33]在IPF患者脱细胞组织以及血清中检测到高水平的CCL7，本实验在矽肺小鼠以及患者肺组织中均检测到CCL7，且矽肺患者组织中CCL7高于健康者，AUC>0.7。鉴于CCL7在新冠肺炎、IPF以及矽肺中的预测作用，本研究推测未来可通过设计矽肺患者队列扩大样本量进一步研究，以验证CCL7升高与矽肺病程相关性。

但本研究存在一定的缺陷。首先，仅利用动物进行scRNA-seq和空间转录组测序，设置的四个组别均为一只小鼠，病理结果显示矽肺模型组均已达到疾病模型，但组学技术需扩大样本量。其次啮齿类动物和人类之间的遗传、解剖和行为差异使得将小鼠的结果转化为人类的结果具有不确定性。因此，有必要增加对矽肺患者的样本测序和分析。最后本研究设计是一个初步的基因生物信息分析研究，鉴于机体以及矽肺病理的复杂性，其潜在分子机制以及在矽肺治疗中的预后影响需结合分子实验和临床研究进行进一步的验证。

综上所述，本研究通过构建小鼠矽肺模型进行scRNA-seq和空间转录组测序，一共获得了97个巨噬细胞的DEGs以及主要富集的生物学过程和信号通路，同时获得了3个巨噬细胞Hub基因Ccl2、Ccl7、Ptgs2和2个潜在的诊断标志物CCL7、PTGS2。