砷是自然界中普遍存在的环境毒物，是国际癌症研究机构确认的人类（Ⅰ类）致癌物及美国毒物与疾病登记署（Agency for Toxic Substances and Disease Registry, ATSDR）认定的最高级优先管理化学毒物^[1]。目前全球有超过2亿的人口受到砷暴露的威胁，环境砷污染仍是当今全球十分严重的环境与健康问题之一^[2]。砷暴露可引起机体多系统多脏器损害，肝脏作为无机砷在体内代谢的主要场所，是砷主要的靶器官之一^[3-5]。研究表明，肝细胞线粒体损伤可能是砷致肝损伤的早期关键事件，而线粒体生物合成是线粒体损伤修复的重要步骤，是控制线粒体“质”和“量”的关键途径^[6]。过氧化物酶体增殖物受体辅助激活因子-1α（recombinant peroxisome proliferators-activated receptor gamma coactivator 1 alpha, PGC-1α）是线粒体生物合成的关键调控因子，其可与细胞能量代谢重要调控因子-核呼吸因子1（nuclear respiratory factor 1, NRF1）结合形成共激活因子，激活线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A, TFAM）调控线粒体的生物发生。当受到外界刺激时，PGC-1α由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的去乙酰化酶沉默信息调节因子2相关酶1（silent mating type information regulation 2 homolog 1, SIRT1）激活，SIRT1使PGC-1α的多个残基去乙酰化，在维持线粒体功能中发挥重要作用^[7]。虽有研究在砷诱导的大鼠脑损伤模型^[8]、小鼠心脏损伤模型^[9]及砷中毒患者皮肤病变组织^[10]中观察到SIRT1/PGC-1α通路相关分子表达水平的改变，而砷所致肝损伤是否与SIRT1/PGC-1α通路介导的线粒体功能障碍有关目前尚不清楚。鉴于SIRT1/PGC-1α通路在线粒体质量控制过程中发挥重要作用，本研究采用亚砷酸钠（NaAsO₂）处理人正常肝细胞（MIHA细胞），检测细胞线粒体损伤情况及SIRT1/PGC-1α通路相关蛋白的表达，探讨NaAsO₂致MIHA细胞线粒体功能障碍的可能机制，旨在为进一步阐明砷致肝损伤机制，揭示以线粒体为靶点的砷致肝损伤早期关键分子通路，针对性地采取干预和治疗措施提供实验依据。

MIHA细胞（湖南丰晖生物科技有限公司，中国），NaAsO₂（Sigma，美国）。主要试剂：胎牛血清、胰酶（Gibco，美国），高糖DMEM培养基、青霉素-链霉素双抗（Procell，中国），Cell Counting Kit-8（CCK8）细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（Biosharp，中国），JC-1检测试剂盒、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术有限公司，中国），三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，中国），SIRT1抗体（Cell Signaling Technology，美国），PGC-1α抗体、NRF1抗体、TFAM抗体（Abcam，英国），磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗体（杭州贤至生物有限公司，中国）。

主要仪器：CO₂恒温培养箱（SANYO，日本），倒置显微镜（Nikon，日本），透射电镜（FEI，美国），Multiskan GO酶标仪（Thermo Scientific，美国），流式细胞仪（Beckmancoulter，美国）。

MIHA细胞接种于含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗的高糖DMEM培养基中，置于37 ℃、5% CO₂培养箱培养。取对数期生长的细胞接种于6孔板，每孔加入配制好的细胞悬液2 mL，常规培养24 h。根据课题组既往试验获得的半数抑制浓度及最佳染毒结果^[11]确定NaAsO₂处理剂量梯度及时间，将各皿细胞随机分为4组，分别加入2 mL含终浓度为0（对照）、5、10、20 μmol·L⁻¹ NaAsO₂的高糖DMEM培养基培养24 h，每个剂量设3个复孔。

分别取对数期生长状态良好的MIHA细胞，调整细胞密度为1×10⁴个·mL⁻¹，接种于96孔板，每孔加入细胞悬液100 μL，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中过夜培养；分别采用0、5、10、20 μmol·L⁻¹的NaAsO₂处理MIHA细胞24 h后，每孔加入10 μL CCK8，37 ℃培养2 h，酶标仪测定450 nm处各孔光密度值，计算各组细胞活力。重复实验3次。

收集细胞于2.5%戊二醛（0.1 mol·L⁻¹磷酸缓冲液配制）4 ℃固定4 h，0.1 mol·L⁻¹磷酸缓冲液漂洗，1%锇酸固定液（0.1 mol·L⁻¹磷酸缓冲液配制）室温固定2 h，0.1 mol·L⁻¹磷酸缓冲液漂洗，脱水，渗透，树脂包埋，切片，醋酸铀及硝酸铅染色后室温干燥过夜，透射电镜观察线粒体超微结构。

弃培养液，每孔加入200 μL裂解液，裂解细胞，在室温条件下离心弃上清，保留细胞沉淀，采用磷钼酸比色法按ATP测定试剂盒操作步骤检测细胞ATP浓度。重复实验3次。

使用不含EDTA的0.25%胰酶消化、收集细胞，每孔加入0.5 mL JC-1染色工作液，颠倒数次混匀，细胞培养箱中孵育20 min，孵育结束后离心弃上清，加入500 μL JC-1染色缓冲液重悬后，采用流式细胞仪分析，以红色荧光强度（H1-UR象限数值）/绿色荧光强度（H1-LR象限数值）值表示MMP水平。

弃培养液，加入预冷PBS清洗3次，加入RIPA细胞裂解液，冰上裂解30 min后，4 ℃下，离心力13.8×g 离心5 min，取上清，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，免疫印迹法检测SIRT1、PGC-1α、NRF1、TFAM蛋白表达水平，蛋白上样量为40 μg。采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后转至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST（封闭液）浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2 h；将SIRT1、PGC-1α、NRF1蛋白抗体及内参GAPDH抗体分别按1∶1000稀释，TFAM蛋白抗体按1∶10000稀释，4 ℃孵育过夜；采用1∶5000辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h后，滴加ECL电化学发光液于PVDF膜上，反应数分钟待荧光带明显后，用滤纸吸去多余的ECL液，覆上保鲜膜，X光胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影，冲洗胶片，晾干胶片，扫描胶片，用Image Pro Plus 6.0软件分析蛋白灰度值。

采用SPSS 21.0 软件对数据进行统计学分析，所有数据均属于计量资料呈正态分布以 $ \overline {{x}} \pm s $ 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较，ATP含量及SIRT1、PGC-1α、TFAM蛋白表达水平方差齐采用LSD-t法，细胞活力、MMP水平及NRF1蛋白表达水平方差不齐采用Dunnett's T3法。剂量-反应关系分析采用趋势性检验。均采用双侧检验，检验水准α=0.05。

与对照组相比，各剂量NaAsO₂处理组的细胞活力均降低，且随NaAsO₂浓度的升高逐渐降低（F=6495.47，P<0.001）。见图1。

透射电镜观察可见10 μmol·L⁻¹ NaAsO₂处理组线粒体大小不一，线粒体肿胀或伸长呈棒状，20 μmol·L⁻¹ NaAsO₂处理组线粒体肿胀呈气球状或空泡状。见图2。

与对照组相比，各剂量NaAsO₂处理组MIHA细胞ATP浓度及MMP水平均降低；且随NaAsO₂浓度的升高逐渐降低（F_ATP趋势=172.28，F_MMP趋势=59.91，均P<0.001）。见图3。

与对照组相比，5 μmol·L⁻¹ NaAsO₂处理组SIRT1、PGC-1α、NRF1及TFAM蛋白表达水平均无明显变化，10 μmol·L⁻¹ NaAsO₂处理组SIRT1、PGC-1α及TFAM蛋白表达水平降低（P＜0.05），20 μmol·L⁻¹ NaAsO₂处理组SIRT1、PGC-1α及NRF1蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与5 μmol·L⁻¹ NaAsO₂处理组相比，10 μmol·L⁻¹ NaAsO₂处理组MIHA细胞SIRT1蛋白表达水平降低（P<0.05），20 μmol·L⁻¹ NaAsO₂处理组SIRT1、PGC-1α及TFAM蛋白表达水平降低（P<0.05）；与10 μmol·L⁻¹ NaAsO₂处理组相比，20 μmol·L⁻¹ NaAsO₂处理组MIHA细胞SIRT1、PGC-1α蛋白表达水平降低（P<0.05）；其余各组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。此外，SIRT1、PGC-1α、NRF1及TFAM蛋白表达水平均随NaAsO₂浓度的升高逐渐降低（F_SIRT1趋势=47.07，P<0.001；F_{PGC-1α趋势}=15.17，P<0.01；F_NRF1趋势=13.54，P<0.01；F_TFAM趋势=4.20，P<0.05）。见图4。

本研究发现，5~20 μmol·L⁻¹ NaAsO₂可不同程度降低MIHA细胞SIRT1、PGC-1α、NRF1及TFAM的表达，并导致MIHA细胞线粒体超微结构改变及线粒体功能障碍。

长期砷暴露可引起肝细胞炎症、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌等不同程度的肝损伤，其发病机制至今尚未完成阐明。线粒体是细胞能量代谢的中心，在氨基酸和脂质代谢、细胞氧化应激、炎症反应、细胞信号转导和细胞凋亡中发挥重要功能，同时也是对外界有害刺激最敏感、最早被侵入的细胞器^[12]。而线粒体在肝细胞中含量丰富，是维持肝细胞功能的重要细胞器，因此也成为各种环境污染物诱导肝毒性的关键靶点^[13]。本研究在透射电镜下观察MIHA细胞线粒体超微结构变化，结果显示NaAsO₂处理后线粒体伸长或肿胀继而呈气球状或空泡状。MMP是线粒体进行氧化磷酸化及ATP合成的功能基础，其对外界刺激非常敏感，外界刺激可作用于线粒体膜而引起MMP下降，导致线粒体呼吸链断裂，影响线粒体的正常功能，因此ATP、MMP是反映线粒体代谢情况及线粒体功能状态的重要指标^[14-15]。本研究发现，NaAsO₂处理后MIHA细胞ATP浓度和MMP水平均降低，且呈剂量依赖性。上述结果均表明，NaAsO₂可导致MIHA细胞线粒体损伤，破坏线粒体质量和功能。

PGC-1α处于线粒体生物合成网状调节系统的上游，是衔接外界刺激信号与线粒体内部功能调节的枢纽，在线粒体生物合成的调节中发挥重要作用。研究表明，当外界因素刺激导致PGC-1α的表达降低时，线粒体生物合成减少，电子传递链以及氧化呼吸功能受到抑制，ATP的产量明显降低^[16-17]。SIRT1是浓缩于核质、异染色质及核仁的功能独特的核心蛋白，能够通过去乙酰化组蛋白和许多非组蛋白因子调控染色质结构，进而完成基因修复、抗凋亡、抗应激、代谢等一系列细胞功能^[18]。PGC-1α即是受SIRT1调控的基因之一，PGC-1α可在SIRT1的去乙酰化作用下被激活^[19]。有研究发现，肝脏中PGC-1α蛋白表达的改变与SIRT1蛋白表达的改变密切相关，SIRT1作为PGC-1α的上游蛋白，在氧化应激条件下两者相互作用调节线粒体生物合成及功能^[20]。有研究在Ⅱ型糖尿病肝损伤^[21]、肝切除术后肝脏缺血再灌注损伤^[22]及非酒精性脂肪性肝病^[23]等疾病动物模型中观察到PGC-1α表达水平的降低及线粒体功能障碍，而激活PGC-1α表达可改善小鼠/大鼠线粒体功能和质量，减轻肝损伤，表明PGC-1α在肝脏线粒体功能和质量中具有重要作用，有望成为疾病治疗的关键靶点。本研究结果显示，NaAsO₂处理后MIHA细胞SIRT1和PGC-1α蛋白的表达降低，且呈剂量反应关系，提示NaAsO₂诱导的肝细胞线粒体功能障碍可能与其抑制SIRT1和PGC-1α的表达有关。

NRF1是PGC-1α下游调控线粒体生物合成最主要的转录因子，可促进线粒体氧化磷酸化，转录调控呼吸酶相关的核基因，影响线粒体基因组的复制、转录、相关蛋白的表达等；TFAM是一种能影响线粒体DNA转录和复制的重要调节因子^[24]。研究表明，PGC-1α可诱导NRF1表达，进而激活TFAM，直接调控线粒体的生成，维持线粒体功能^[25-26]。另有研究发现，姜黄素通过增加PGC-1α和NRF1的表达来促进线粒体生物合成，改善线粒体功能，减轻酒精诱导的肝损伤^[27]。本研究结果显示，NaAsO₂处理后MIHA细胞NRF1及TFAM蛋白表达水平降低，提示SIRT1/PGC-1α可能是NaAsO₂导致肝细胞线粒体损伤的作用靶点，NaAsO₂通过下调SIRT1/PGC-1α的表达，进而抑制其下游维持线粒体生物合成及功能的关键蛋白的表达。有研究证实，TFAM是线粒体DNA转录、复制和功能维护的核心因子，TFAM可结合和缠绕线粒体DNA，保护其免于活性氧的降解，并可增加线粒体DNA的稳定性和完整性，而线粒体DNA通过编码氧化磷酸化的必要成分在线粒体生物合成和ATP产生过程中发挥重要作用^[28]，因此推测NaAsO₂诱导的MIHA细胞线粒体超微结构的改变、ATP浓度及MMP水平的降低可能与其下调细胞SIRT1、PGC-1α、NRF1及TFAM的表达有关。本研究仅观察了NaAsO₂对MIHA细胞线粒体功能障碍及SIRT1/PGC-1α通路相关蛋白表达的影响，尚需通过基因过表达或沉默揭示SIRT1/PGC-1α/NRF1/TFAM之间的调控机制，并结合线粒体DNA拷贝数的变化情况，进一步探讨该通路在NaAsO₂诱导的线粒体功能障碍中的作用。

综上，本研究显示SIRT1/PGC-1α及其下游NRF1和TFAM的表达的下调可能是砷致肝细胞线粒体功能障碍进而导致肝损伤的机制之一。由于砷中毒肝损伤发生发展过程及影响因素复杂，致病机制尚不完全明确，缺乏有效的早期监测和干预手段，基于本研究发现SIRT1/PGC-1α可能成为砷中毒肝损伤的预防及防治靶点，但其具体作用机制尚需进一步深入研究。