镍（nickel, Ni）是人体必需的微量元素，主要以有机化合物的形式被植物吸收，或在海洋软体动物体内和与厨房用具接触的食物中积累从而进入营养链^[1]。镍主要通过呼吸道进入人体，并分布于人体各处，其中血镍代谢半减期约为20~34 h ^[2]。镍化合物早在20世纪90年代就被国际癌症研究机构列为人类致癌物（1类），其中金属镍被明确列为潜在的人类致癌物（2B类）^[3]。口腔癌（oral cancer, OC）是头颈部发病率较高的恶性肿瘤之一 ，有文献报道2018年全世界口腔癌新病例约有35万例 ，其中我国约占1/7^[4]。有研究表明，高水平镍与口腔癌患病率之间存在正相关^[5]，且可通过抑制异柠檬酸脱氢酶的活性诱导癌细胞的干细胞特性^[6]。另外，一项长达2年的大鼠口服镍化合物研究发现，镍与肿瘤的发生无明显暴露-反应关系^[7]。然而，既往研究多为在未排除其他因素干扰的前提下进行，其结果尚有争议。

倾向性分析法是通过计算每个研究对象的倾向性评分（propensity score, PS），来集中体现多个混杂因素的综合影响，再使用分层、匹配、校正或加权等多种方法进行分析，以达到控制混杂因素的目的^[8]。有研究发现，倾向性评分匹配法（propensity score matching, PSM）可以有效均衡组间协变量，降低人群差异对效果评估的影响，从而提高研究结果的准确性，然而该方法通常具有样本量大幅度减少的缺点^[9]。与之相反，逆概率处理加权法（inverse probability of treatment weighting, IPTW）保留了所有患者数据，最大限度地提高了可用信息量，可以在不损失样本量的情况下进行数据统计。有研究发现，PSM和IPTW能够有效地减少多组观察性数据间存在的混杂偏倚，使其结果更接近随机对照研究^[10]。因此，本研究基于PSM与IPTW来阐明血清镍与口腔癌发病的关系，以最大限度减少混杂因素的影响，为进一步预防口腔癌提供理论依据。

采用病例对照研究设计，选取2011年11月—2019年5月期间福建医科大学第一附属医院确诊的456名口腔癌患者。病例纳入标准：（1）经组织病理学确诊的新发口腔癌患者；（2）具有10年以上福建本省居住史。病例排除标准：（1）具有口腔炎症或继发性肿瘤；（2）不能明晰回答问题。同一时期，从医院和社区体检的人群中纳入了1410例对照，并排除了具有口腔疾病、肿瘤既往史、无法顺利完成调查以及职业接触镍元素者。收集问卷和采集样本期间，所有受试者均签署知情同意书。本研究已获批于福建医科大学伦理委员会[编号：2011福医伦理审字第(53)号]。

采用国内外专家结合国内实际情况编制而成的结构式调查问卷。在调查前，采用统一的标准对调查者进行培训，利用问卷调查对受试者进行访谈。问卷主要内容包括：饮食习惯、饮酒史、吸烟史、喝茶史、肿瘤家族史等。吸烟的定义是累计吸烟达到100支；饮酒的定义是持续6个月以上并保持每周至少饮酒1次的频率；饮茶的定义是持续6个月以上且保持每周至少喝1杯茶的频率^[11]。面访结束后，及时对问卷进行复核，并剔除完成度未达到100%的问卷。

抽取受试者清晨空腹状态适量外周血液样本并暂存于抗凝管内，设置超高速低温离心机（Thermo，美国）1000 r·min⁻¹（离心半径13.5 cm）离心10 min，得到血清后进行分装，保存在−80 ℃的冰柜。通过NexION 350X电感耦合等离子体质谱仪（PerkinElmer，美国）采用电感耦合等离子体质谱法进行血清镍浓度的检测。首先，精确吸取200 μL的血清样本于聚四氟乙烯材质的消解罐中，再向其中加入1 mL硝酸（国药集团化学试剂，中国）与4 mL超纯水，将其固定于WX-4000微波消解仪（上海屹尧，中国）内进行微波消解。消解完成后在温度设置为140 ℃的G-100赶酸仪（上海屹尧，中国）上进行赶酸，直至酸液约为0.5 mL后转移至10 mL容量瓶中并定容至10 mL待测。通过含1.00 μg·L⁻¹铁、锂、镁、铍、铈、铀、铅、铟的质谱调谐液（PerkinElmer，美国），最优化电感耦合等离子体质谱仪的射频功率、气体流量、扫描方式等仪器工作条件，以达到镁、铍、铈、铀的灵敏度较高及其氧化物产率较低的要求，并且采用动态反应池和氢气碰撞反应池去除质谱干扰，进而进行测定。与此同时，配制镍标准溶液，质量浓度（简称浓度）分别为0.001、0.005、0.010、0.050、0.100、0.500 μg·L⁻¹。绘制标准曲线并检测血清中镍的浓度，对低于检测限（0.17 μg·L⁻¹）的样本，用检测限的一半值替代^[12]。

基于EpiData 3.1软件对采集的问卷进行双核输入和逻辑纠错校正。PSM和IPTW过程使用R 4.0.5软件进行，使两组研究对象的一般人口统计学特征和生活方式均衡可比。通过logistic回归分析估计，综合利用研究对象的多个混杂因素计算出不同处理组的PS值。其中，在PSM中，使用1∶1邻近匹配法，PS卡钳值定为0.02。在IPTW中，对病例组和对照组的研究对象分别赋予1/PS（即PS的倒数）与1/（1−PS）（即1减PS的差的倒数）的权重，进而使多个混杂因素在病例组和对照组达到均衡而样本量不变。采用卡方检验和标准均数差（standardized mean difference, SMD）对基线患者的一般特征进行匹配前后的均衡性检验，其中组间协变量均衡的评估指标为SMD值< 0.2。通过限制性立方样条图（节点=4，以P₂₅、P₅₀、P₇₅、P₉₅为节点，其中P₂₅为对照点）绘制血清镍浓度与口腔癌发病之间剂量-反应关系，并根据限制性立方样条曲线与纵坐标OR=1的交点确定血清镍浓度的最佳界值，并采用条件logistic回归分析模型和加权logistic回归探索血清镍浓度与口腔癌发病关联的OR值与其95%CI。检验水准α=0.05（双侧检验）。

本研究共纳入口腔癌患者456例和对照组1410例，经1∶1的PSM法挑选出323对病例-对照；在IPTW法中，对总研究人群中对照组1410人和病例组456人的每一位参与者进行加权。由表1可知，在PSM法和IPTW法匹配前，除红肉摄食频次、鸡蛋摄食频次、口腔卫生评分外的其他协变量差异均有统计学意义（P≤0.001）；匹配后，病例组与对照组中各协变量的差异均无统计学意义，各个因素的SMD均小于0.2，均衡性得到明显的提高。

基于PSM与IPTW处理后，分别探讨血清镍水平与口腔癌发病风险的剂量-反应关系，两者分析结果一致表明，随着血清镍浓度的递增，患口腔癌的风险均呈先下降后上升的趋势。结果见图1。

根据曲线与参考线（OR=1.0）的两个交点确定经PSM方法处理后的血清镍浓度最佳界值，分别为0.09 μg·L⁻¹与16.08 μg·L⁻¹；用同样的方法，确定了IPTW处理后血清镍浓度的两个最佳界值，分别为0.09 μg·L⁻¹与20.55 μg·L⁻¹。调整混杂因素后，PSM结果显示，与对照组相比，血清镍浓度在0.09~16.80 μg·L⁻¹范围内，病例组的口腔癌发病风险与血清镍浓度呈负相关（OR=0.36，95%CI：0.24~0.54），镍浓度＞16.80 μg·L⁻¹时，病例组的口腔癌发病风险与血清镍浓度呈正相关（OR=5.43，95%CI：2.76~10.68）；IPTW结果显示，血清镍浓度在0.09~20.55 μg·L⁻¹时，口腔癌的罹患风险与血清镍浓度呈负相关（OR=0.39，95%CI：0.29~0.52），镍元素浓度＞20.55 μg·L⁻¹时可升高口腔癌的罹患风险，OR及95%CI为5.54（3.62~8.49）。见表2。

本研究采用PSM与IPTW方法分析后发现，血清镍水平与口腔癌的发生风险呈先下降后上升的J形关系。在较低浓度下，血清镍水平与口腔癌的发病风险呈负相关；当血清镍水平持续升高，高水平镍可能会增加口腔癌的发病风险。研究表明，PSM能更有效地减少基线协变量的不平衡而提高结果的准确性^[9]，IPTW能够在整个数据统计分析过程中最大限度地保留更多的可用样本信息。因此本研究同时采取两组方法，可有效排除其他因素的干扰，保证病例组与对照组间的可比性，从而更客观地反映血清镍对口腔癌的影响。数据分析得：两种统计学处理的结果一致显示镍与口腔癌的剂量-反应关系。

镍是元素周期表上的第24位元素——地壳中含量最丰富的元素之一。在日常生活环境中，镍元素可以通过被植物吸收以及在海洋软体动物或与厨房用具接触的食物中积累等方式进而被吸收进入营养链。有研究报道，在低浓度时，镍可被视为人体内必需的一种微量元素，具有参与蛋白质的结构并作为辅助因子参与酶活性的激活等功能^[13]。另一方面，当体内镍浓度持续升高时，镍可作为一种有毒元素损伤线粒体功能，影响线粒体能量稳态并导致表观遗传改变^[14]。正常人血液中镍浓度约0.11 mg·L⁻¹，人体对镍的日需要量约0.3 mg^[15]。然而，由于人群生活环境、研究对象、生物样本以及元素检测方法的不同，不同研究中关于镍的影响大小也不相同。在中国台湾中部的一项病例对照研究中，Yuan等^[5]将对照组的血液镍水平的75%作为分组依据，发现与≤1.21 μg·L⁻¹相比，血液镍浓度>1.21 μg·L⁻¹为口腔癌的危险因素；据Khlifi等^[16]报道，突尼斯人群中血液高镍浓度（>56.85 μg·L⁻¹）与头颈部肿瘤的发病有正关联，这与Arain等^[17]通过原子吸收光谱法测定口咽癌患者血液镍的浓度，并以血液镍浓度均数水平进行分组分析的结果一致。目前关于血清镍与口腔癌发病风险之间的流行病学研究较少。

本研究发现血清镍浓度在0.09~16.80 μg·L⁻¹范围内，口腔癌的发病风险与血清镍浓度呈负相关。已有研究表明，镍主要参与磷脂、甘油三酯、尿素、葡萄糖、糖原和ATP水平的组织调节，从而满足人群每日较高的新陈代谢需要^[18]。Li等^[19]通过队列研究发现，血浆镍浓度为2.02~3.27 μg·L⁻¹组与2型糖尿病患者的癌症风险呈负相关，原因可能是血浆中可溶性镍浓度未达到致癌风险水平。在Heim等^[7]利用口服管饲法按照每日10、30、50 mg·kg⁻¹ 六水合硫酸镍的剂量对Fischer大鼠进行试验，发现镍化合物并未导致口腔肿瘤发生风险增加，而镍化合物的吸入促进了呼吸道肿瘤的发生，这可能表明含镍物质对人体致癌性的影响与接触方式以及肿瘤的类型有关。此外，体外实验表明，在低镍浓度下，镍对正常细胞的活力不产生影响^[20]。已有研究发现在脂多糖的刺激下，Ni²⁺离子能作用于核因子κB p50亚基从而抑制口腔癌细胞的核转移，干扰核因子κB活性抑制白介素-8的自发分泌，并且可以抑制核因子κB反式激活而表现出抗炎活性^[21-22]。因此，血清中适当的镍水平能够降低口腔癌的发病风险，这可能与人体需要一定浓度镍元素来维持其正常的新陈代谢和生理功能有关^[18]。

既往研究表明，血液中镍浓度高与口腔癌风险增加有关联^[23]，与本研究的结果相符。在流行病学研究方面，Khlifi等^[16]发现头颈癌患者癌组织中的镍水平明显高于对照组。在一项关于中国台湾的环境金属与口腔潜在恶性疾病的回顾性队列研究中发现，高镍水平可增加口腔潜在恶性疾病发展成为口腔癌的风险^[24]，这可能与高浓度镍可破坏基因组中的组蛋白结构，从而改变基因表达并引起细胞结构变化有关^[25]。在摄入并暴露于重金属镍的动物模型中，发现小鼠和大鼠的口腔肿瘤均被诱发^[26]。此外，在细胞实验中，Chiou 等^[27]发现高浓度镍会导致人表皮生长因子受体突变，进而促进肿瘤侵袭。一方面，当体内镍水平持续升高，镍可通过诱导缺氧诱导因子创造缺氧的细胞环境，介导细胞存活和适应缺氧条件，此时肿瘤细胞可能能够通过选择受损和抗细胞凋亡的细胞而增殖^[25]；另一方面，镍和镍化合物的过量暴露可以直接通过增加活性氧的生成和损害抗氧化酶活性，因此诱导活性氧积累和氧化应激，从而破坏DNA和抑制DNA修复功能，促进肿瘤的发生^[28]。

此项研究仍存在一定的局限性。首先，病例对照的研究方法本身存在的选择偏倚和回忆偏倚是不可避免的。虽然本研究采用的PSM和IPTW两种分析方法可有效控制混杂因素，且纳入新发的口腔癌病例进行研究可有效减少回忆偏倚，但仍需要进一步加大样本量控制偏倚。其次，由于实际情况中仅能收集单一时间点的血清样本，其金属水平所反映的暴露时间可能并不足以覆盖口腔癌发展的潜伏期，故本研究中选取的受试对象在福建本地居住10年以上，能合理假定研究对象的血清镍水平在很长一段时间内是相对稳定的，其当前的血液样本的金属水平具有代表性。此外，血清镍的价态亦未能确定。因此，还需要后续进一步进行相关前瞻性研究加以验证。

结合以上内容来看，利用PSM和IPTW可以有效地平衡组间的其他因素的干扰，本研究初步发现血清镍浓度与口腔癌发病风险之间呈J形关系，高浓度血清Ni浓度（>20.55 μg·L⁻¹）可能为OC发病的危险因素。因此，采取适当的措施将血清镍保持在合适的浓度可能有助于预防口腔癌的发生。需要继续进行大样本量的收集和相关前瞻性研究以验证这些可能的关联，并澄清确切的机制，从而为口腔癌的防治提供科学依据。