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2020, 37(1):51-56.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2020.19423

Effects of acute exposure to diisodecyl phthalate on kidney in mice and underlying mechanism


Lab of Environment-Immunological and Neurological Diseases, Research Center of Basic Medical Sciences, Hubei University of Science and Technology, Xianning, Hubei 437100, China

Received: 2019-06-19;  Accepted:2019-01-30;  Published: 2020-02-14

Fund project: This study was funded

Corresponding Author: MA Ping, Email: mping68@126.com  

Ethics approval  Obtained

[Background] Diisodecyl phthalate (DiDP) is a new type of plasticizer, and can enter the human body through a variety of ways. At present, there are few domestic studies on the nephrotoxicity of DiDP, and whether DiDP can cause renal injury in laboratory animals through oxidative stress is still unclear.

[Objective] This experiment investigates the effects of different doses of DiDP on the kidney in male Balb/c mice, and explores the underlying mechanism.

[Methods] Balb/c mice were randomly divided into control group (saline), DiDP groups (0.15, 1.5, 15, and 150 mg/kg), vitamin E (Vit E) group (100 mg/kg), and Vit E intervention group (150 mg/kg DiDP+100 mg/kg Vit E) (n=8 in each group). After 14 d of the designed exposure by gavage, the pathological changes of renal tissue specimens were observed; reactive oxygen species (ROS), malondialdehyde (MDA), reduced glutathione (GSH), and 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) in renal tissues, as well as urea nitrogen (UREA) and creatinine (CREA) in serum were measured.

[Results] The levels of ROS, MDA, and 8-OHdG in renal tissues and the levels of UREA and CREA in serum were significantly higher in the 150 mg/kg DiDP group than those in the control group, and the level of GSH was significantly lower (P < 0.05). Moreover, the pathological results showed that higher doses of DiDP resulted in more serious renal injury. Compared with the 150mg/kg DiDP group, the levels of ROS, MDA, and 8-OHdG in renal tissues and the levels of UREA and CREA in serum were decreased, and the GSH level was increased in the Vit E intervention group (P < 0.05). Meanwhile, the pathological results showed that Vit E somewhat relieved the renal injury caused by 150 mg/kg DiDP.

[Conclusion] DiDP can induce pathological damage of renal tissues in mice through oxidative stress.

Key Words: plasticizer;  diisodecyl phthalate;  renal injury;  reactive oxygen species;  urea nitrogen;  creatinine 

图 1

各实验组小鼠肾组织的病理学观察结果(×400,HE染色)

Figure 1

Pathological presentation of renal tissues of mice in different groups (×400, HE staining)

[注]蓝色箭头为肾小球,黄色箭头为肾小管;Δ为红细胞,▲为水肿。A:空白对照;B~E:0.15、1.5、15、150 mg/kg DiDP;F:100 mg/kg Vit E;G:150mg/kg DiDP+100mg/kg Vit E。 [Note] The blue arrow is renal glomerulus, and the yellow arrow is renal tubule; Δis red cell, ▲ is edema. A: Control; B-E: 0.15, 1.5, 15, 150mg/kg DiDP; F: 100mg/kg Vit E; G: 150mg/kg DiDP+100mg/kg Vit E.
图 2

各实验组小鼠血清CREA(A)和UREA(B)含量(n=7)

Figure 2

Serum CREA (A) and UREA (B) levels of mice in different groups

[注]与空白对照组比较,*:P< 0.05;**:P< 0.01。与联合处理组比较,#:P < 0.05;##:P < 0.01。1:空白对照;2~5:0.15、1.5、15、150mg/kg DiDP;6:100mg/kg Vit E;7:150mg/kg DiDP+100mg/kg Vit E。 [Note] Compared with the control group, *: P<0.05; **: P<0.01. Compared with the 150 mg/kg DiDP+100 mg/kg Vit E group, #: P < 0.05; ##: P < 0.01. 1: Control; 2-5: 0.15, 1.5, 15, 150 mg/kg DiDP; 6: 100 mg/kg Vit E; 7: 150mg/kg DiDP+100mg/kg Vit E.
图 3

各实验组小鼠肾ROS(A)、MDA(B)、GSH(C)和8-OHdG(D)含量(n=7)

Figure 3

ROS (A), MDA(B), GSH (C), and 8-OHdG (D) levels in renal tissues of mice in different groups

[注]与空白对照组比较,*:P < 0.05;**:P < 0.01。与联合处理组比较,#:P < 0.05;##:P < 0.01。1:空白对照;2~5:0.15、1.5、15、150 mg/kg DiDP;6:100mg/kg Vit E;7:150mg/kg DiDP+100mg/kg Vit E。 [Note] Compared with the control group, *: P < 0.05; **: P < 0.01. Compared with the 150 mg/kg DiDP + 100 mg/kg Vit E group, #: P < 0.05; ##: P < 0.01. 1: Control; 2-5: 0.15, 1.5, 15, 150mg/kg DiDP; 6: 100mg/kg Vit E; 7: 150mg/kg DiDP+100mg/kg Vit E.

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我国各级医疗机构对儿童用基本药物剂型和规格的需求调查

邻苯二甲酸酯(phthalates,PAEs)类增塑剂因可增加塑料制品的可塑性和柔韧性,被广泛应用于皮革制品、汽车内饰、地板、医疗设备,甚至酒类、调味品中[1-2]。已有研究表明,传统PAEs类增塑剂具有类雌激素作用[3],对人类的生殖发育具有毒性,故欧盟成员国已严格限制传统PAEs类增塑剂的使用。新型增塑剂邻苯二甲酸二异癸酯(diisodecyl phthalate,DiDP)作为传统PAEs类增塑剂的替代品,因其生殖发育毒性相对较低而受到推荐,目前已广泛应用于日用化工领域[4]。Cho等研究[5]发现,>400 mg/L DiDP能使Fischer 344大鼠的存活率和体重均下降,肝脏、肾脏发生肿胀。Cho等[6]研究指出,DiDP和传统PAEs类塑化剂类似,可诱导雄性小鼠肝细胞中过氧化物酶体大量增加,造成肝脏损伤。其他研究显示,DiDP经口摄入可通过氧化应激加重Balb/c小鼠的变态反应性皮炎,通过线粒体-Caspase途径诱导昆明小鼠的肝脏损伤,提示氧化应激可能参与DiDP的毒理学过程[7-8]

目前,国内对DiDP肾毒性作用的研究较少[9],DiDP是否可通过氧化应激导致肾损伤尚不清楚。维生素E(vitamin E,Vit E)是一种天然的抗氧化剂,其抗氧化作用可以保护生物体免受氧化应激损伤[10]。本实验以雄性Balb/c小鼠为实验对象,通过不同剂量DiDP灌胃处理受试小鼠后,观察肾组织切片的病理学变化,以肾组织活性氧(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)、8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxydeoxyguanosine,8-OHdG)、血清尿素氮(urea nitrogen,UREA)、血清肌酐(creatinine,CREA)为评价指标,同时加入Vit E进行干预,探究不同剂量的DiDP对雄性Balb/c小鼠肾脏的影响及其作用机制。

1   材料与方法

1.1   实验动物

56只受试雄性Balb/c小鼠[5周龄,体重(16.1± 0.4)g]购自湖北省实验动物研究中心,实验动物许可证号:SYXK(鄂)2013-0071,动物质量合格证号:No.42000600001035。所有实验程序均经湖北科技学院实验动物伦理委员会批准(编号:2017-02-001)。

1.2   试剂与仪器

DiDP(质量分数≥ 99.6%)、Vit E(质量分数≥ 99%)、Hoechst33258荧光染料、二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(质量分数>99.9%)、蛋白酶K(Sigma,美国),硫代巴比妥酸(分析纯,国药集团,中国),GSH试剂盒(南京建成,中国),8-OHdG ELISA试剂盒(济南朋远,中国),CREA、UREA试剂盒(深圳库贝尔,中国);Hidex Chameleon V多功能荧光酶标仪(Hidex,芬兰),Power wave XS酶标仪(Bio-Tek,美国),DP73光学显微镜(Olympus,日本),5424/5424R低温冷冻离心机(Eppendorf,德国),RM2245切片机(Leica,德国),iMagic-V7动物自动生化分析仪(深圳库贝尔,中国)。

1.3   动物分组与染毒

实验小鼠称重记录后随机分为7组(8只/组),含1个空白对照组(生理盐水)、4个不同剂量DiDP组、1个Vit E组和1个联合处理组。美国消费品安全委员会在2010年提出,成人的DiDP可接受日摄入量为0.15 mg/(kg·d)[11]。据此,本研究中DiDP以吐温80(Tween80)助溶(VDiDP: VTween80 =1: 1),再加入生理盐水依次稀释成15、1.5、0.15、0.015 g/L共4种质量浓度的使用液。参考Peng[10]的研究,Vit E剂量选择为100 mg/(kg·d);Vit E组给予100 mg/kg Vit E,联合处理组给予150 mg/kg DiDP 3 h后再给予100 mg/kg Vit E。各组小鼠每天均经口灌胃给药1次,给药量为10 mL/kg,最终染毒剂量是0.15、1.5、15、150 mg/kg,染毒周期14d[9]

1.4   肾脏组织切片的制备和观察

染毒14 d结束后,每组随机选取1只小鼠用于观察病理切片。颈椎脱臼处死小鼠,立即解剖后取出肾脏,并用4%(体积分数)多聚甲醛固定,常规脱水、石蜡切片,经HE染色后镜下观察肾组织切片的病理学变化。

1.5   肾功能的测定

小鼠麻醉后心脏取血,4℃离心15min(3000r/min,离心半径10 cm),取血清样本200 μL,加双蒸水600 μL稀释,用于UREA、CREA的检测。

1.6   肾组织匀浆的制备

肾脏称重后置于预冷的磷酸盐缓冲液(pH=7.5)中漂洗,用滤纸拭干,加预冷的磷酸盐缓冲液制成质量分数为10%的匀浆液,4℃离心10min(10000r/min,离心半径10 cm)后取上清,用于ROS、MDA、GSH和8-OHdG的检测[12]

1.7   氧化应激指标的检测

1.7.1   ROS含量测定

取100 μL肾脏组织匀浆上清液于酶标板中,加入100 μL荧光染料二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯,孵育箱内37℃避光反应5min,用荧光酶标仪检测各孔485 nm处激发光、528 nm处发射光的荧光强度,ROS含量以相对荧光强度表示。

1.7.2   MDA含量测定

取0.5 mL组织匀浆上清于10mL离心管中,加入质量分数为0.6%硫代巴比妥酸溶液,100℃水浴15 min,冷水冷却后取1 mL,4℃离心10 min(10 000 r/min,离心半径10 cm),取上清液200 μL于酶标板内检测450、532、600 nm处的光密度值(D450D532D600)。MDA含量(CMDA,μmol/L)=6.45×(D532-D600)- 0.56×D450

1.7.3   GSH含量测定

严格按照试剂盒的操作说明进行GSH含量的测定,检测各孔412 nm处的光密度值(D测定值),GSH含量(nmol/L)=D测定值/0.0023,R2=0.997。

1.7.4   8-OHdG含量测定

严格按照试剂盒的操作说明进行8-OHdG含量的测定,检测各孔450 nm处的光密度值(D450)。以标准品浓度0、3、6、12、24、48 μg/L等为横坐标,以D450为纵坐标,绘制标准曲线,根据标准曲线来确定样品中8-OHdG的含量。ELISA试剂盒灵敏度为0.5μg/L。

1.8   统计学分析

计量数据均用均数±标准差(x±s)表示,应用GraphPad Prism 6.0进行统计分析,组间比较应用单因素方差分析,多个均数之间两两比较采用q检验,检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   肾组织病理学变化

图 1可知,空白对照组及Vit E组小鼠肾组织切片结构正常,而DiDP组均可见不同程度的病理学变化。0.15mg/kg DiDP组肾小球体积增大,肾小管上皮细胞水肿,管腔变形;1.5 mg/kg DiDP组肾小球体积增大,血管球呈分叶状,肾小管上皮细胞严重水肿,管腔变形;15 mg/kg DiDP组肾小球毛细血管扩张,细胞增生,肾小管上皮细胞进一步水肿,管腔受压;150 mg/kg DiDP组肾小球毛细血管进一步扩张,细胞增生明显,球体肥大,与球囊壁界限不清,肾小管间挤压严重,上皮细胞损伤明显,偶见红细胞;联合处理组肾小球毛细血管扩张明显,球体肥大但与球囊壁界限尚清,肾小管管腔形态尚清,上皮细胞水肿。结果表明,DiDP暴露剂量越大,肾损伤越严重,而Vit E可缓解肾组织损伤。

图 1

各实验组小鼠肾组织的病理学观察结果(×400,HE染色)

2.2   小鼠血清CREA和UREA含量

图 2可知,小鼠血清CREA、UREA含量随着DiDP染毒剂量的升高,有逐渐上升的趋势。与空白对照组比较,15、150mg/kg DiDP组血清CREA含量升高(q=1.584,P=0.012;q=3.649,P=0.007);与150mg/kg DiDP组比较,联合处理组血清CREA含量下降(q=1.314,P=0.027)(图 2A)。与空白对照组比较,150 mg/kg DiDP组血清UREA含量升高(q=1.421,P=0.009);与150 mg/kg DiDP组比较,联合处理组UREA含量下降(q=1.248,P=0.008)(图 2B)。

图 2

各实验组小鼠血清CREA(A)和UREA(B)含量(n=7)

2.3   小鼠肾组织ROS、MDA、GSH和8-OHdG含量

图 3显示,随DiDP暴露剂量的升高,ROS、MDA、8-OHdG含量呈现上升趋势,GSH含量呈现下降的趋势。ROS含量变化见图 3A,与空白对照组比较,DiDP 1.5、15、150 mg/kg组ROS含量升高(q=5.405,P=0.038;q=2.270,P=0.002;q=2.105,P=0.005);而与150 mg/kg DiDP组比较,联合处理组ROS含量下降(q=6.311,P=0.022)。MDA含量变化见图 3B,与空白对照组比较,DiDP 1.5、15、150 mg/kg组MDA含量均升高(q=3.063,P=0.037;q=5.891,P=0.024;q=1.081,P=0.001);与150 mg/kg DiDP组比较,联合处理组MDA含量下降(q=7.603,P=0.041)。GSH含量变化见图 3C,与空白对照组比较,150 mg/kg DiDP组GSH含量下降(q=2.722,P=0.001);与150 mg/kg DiDP组比较,联合处理组GSH含量升高(q=1.242,P=0.027)。8-OHdG含量变化见图 3D,与空白对照组比较,150 mg/kg DiDP组8-OHdG含量升高(q=3.183,P=0.000 1);与150 mg/kg DiDP组比较,联合处理组8-OHdG含量下降(q=3.722,P=0.002)。

图 3

各实验组小鼠肾ROS(A)、MDA(B)、GSH(C)和8-OHdG(D)含量(n=7)

3   讨论

与其他PAEs类似,DiDP不与塑料共价结合,较易进入环境,可通过皮肤、口腔和吸入途径进入人体内[13]。欧盟规定,食品中DiDP和邻苯二甲酸二异辛酯的总和上限为9.0mg/kg[14]。2011年,中国台湾食品中首次检测到包括DiDP在内的增塑剂含量超标[15]。已有动物研究表明,通过饮食摄入的DiDP可诱导受试小鼠的肝毒性[9];Ma等[16]研究也表明,DiDP同系物邻苯二甲酸二异辛酯可通过氧化应激造成肝肾损伤。本研究用肾功能指标UREA、CREA来反映DiDP对小鼠肾组织的影响,明确了DiDP暴露可影响肾组织ROS、MDA、GSH和8-OHdG含量的变化,中、高剂量(≥ 15 mg/kg)的DiDP暴露均可造成小鼠肾组织的形态学损伤,而Vti E可在一定程度上降低DiDP造成的肾损伤,提示氧化应激可能介导了DiDP诱导小鼠肾损伤的毒理学过程。

CREA和UREA主要通过肾脏进行代谢,CREA直接反映肾小球滤过情况,而UREA间接反映肾小球滤过情况;肾实质受损伤时,CREA和UREA含量升高,肾小球重吸收功能下降,故二者是反映肾功能的重要指标[17]。本研究结果提示较高剂量的DiDP(≥ 15mg/kg)暴露可对小鼠肾功能造成一定程度的损害,这一结果与Julia等[18]的研究结果相一致。

本实验结果提供了DiDP引起肾脏组织病理学变化的证据。在150 mg/kg DiDP暴露剂量下,肾组织病理切片可观察到肾小管间隙明显缩小,肾小球上皮细胞极度水肿。DiDP不同剂量组均可见不同程度的病理学损伤,且随着DiDP暴露剂量的升高,小鼠肾组织的病理损伤程度越明显,给予Vit E后,病理学改变得到一定程度的缓解,提示DiDP暴露所导致的小鼠肾损伤机制可能为氧化损伤,Vit E的抗氧化作用可改善DiDP所致的肾损伤。

ROS、MDA、GSH、8-OHdG是氧化应激反应的重要观测指标。研究表明,ROS的产生和抗氧化防御之间的不平衡会引起氧化应激,导致ROS对细胞的损害[19]。氧化应激进一步导致GSH耗竭、脂质过氧化、膜损伤、DNA链断裂以及蛋白酶、核酸酶和蛋白激酶的激活。本研究中随着DiDP暴露剂量的增加,肾组织的ROS、MDA和8-OHdG含量逐渐上升,GSH水平逐渐降低,这表明DiDP增加了各种组织和细胞的氧化应激水平和/或导致氧化损伤。

近年来相关研究结果证明,Vit E作为体内重要的抗氧化物质,在保护动物机体损伤、维持组织基本结构稳定等方面作用显著[20];另一方面,Vit E对氧化应激以及有害物质诱导的动物机体损伤具有保护作用。本研究中,Vit E处理组的ROS、MDA、8-OHdG等氧化应激指标呈下降趋势而GSH呈上升趋势,进一步证明DiDP所致的机体肾损伤机制可能与氧化应激有关。

由于本研究只是初步探讨了不同剂量的DiDP对雄性Balb/c小鼠肾脏的影响,以及可能的参与机制如氧化应激通路,至于DiDP导致机体损伤是否同时存在其他分子机制还有待进一步研究。综上,较高剂量的DiDP(≥ 15 mg/kg)可诱导小鼠肾组织产生过量ROS,破坏机体氧化与抗氧化平衡,使小鼠肾组织细胞抗氧化能力下降,继而造成肾组织的氧化损伤。而Vit E作为抗氧化剂,可通过拮抗ROS的产生,在一定程度上缓解DiDP所致的肾损伤,提示氧化应激可能是DiDP导致肾损伤的关键机制之一。

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