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2018, 35(6):546-552.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2018.18122

Behavioral toxicity of triclosan on parent and progeny generations of Caenorhabditis elegans


Department of Preventive Medicine, College of Public Health and Management, Wenzhou Medical University, Wenzhou, Zhejiang 325035, China

Accepted: 2018-01-11;  Published: 2018-07-06

Corresponding Author: JU Jing-juan, Email: jingjuanju@hotmail.com  

[Objective] To evaluate and compare the behavioral toxicity of triclosan (TCS) at different concentrations in parent and progeny of Caenorhabditis elegans (C.elegans).

[Methods] One solvent control group (T0), two environmental concentration groups[T1 (2.9×10-2 μg/L TCS)and T2 (2.9 μg/L TCS)], and two high concentration groups[T3 (2.9×102μg/L TCS)and T4 (2.9×104μg/L TCS)] were established.After exposing agesynchronized L3 larvae of C.elegans (P0) to designed TCS levels for 72 h, the progeny nematodes were harvested and divided into three subgroups for another 48 h culture.Group A progeny (AF1) was treated without TCS; group B progeny (BF1) was continuously exposed to TCS consistent with the parental exposure concentration; group C progeny (CF1) was exposed to TCS inconsistent with the parental exposure concentration, including the following pairs:non-TCS parental exposure & low TCS progeny exposure (T0T1), low parental exposure & high progeny exposure (T1T4), and high parental exposure & low progeny exposure (T4T1).The body bend frequency and head thrash frequency of P0, AF1, BF1, and CF1 were measured as behavioral toxicity indicators.

[Results] Compared to the controls, the head thrash frequency of P0 decreased only at 2.9×104μg/L TCS (P < 0.05), and no significant change was shown in the body bend frequency and the head thrash frequency of AF1 groups (P > 0.05); the body bend frequency of BF1 increased by 10.4% at 2.9×10-2 μg/L TCS (P < 0.05) and then decreased by 15.4% and 30.1% at 2.9×102 and 2.9×104 μg/L TCS, respectively (P < 0.05); the head thrash frequency of BF1 decreased with higher TCS concentrations, and showed significant differences at 2.9 μg/L and above (Ps < 0.05).The head thrash frequency of BF1 decreased at 2.9×10-2 and 2.9 μg/L TCS compared with P0 and AF1 (P < 0.05).Both the head thrash frequency and the body bend frequency were inhibited when the CF1 group was exposed to the T4T1 mode (P < 0.05); only the body bend frequency was inhibited in the CF1 group exposed to the T1T4 mode (P < 0.05).

[Conclusion] The behavioral toxicity of TCS on parent and progeny generations of C.elegans varies with exposure concentrations and exposure modes, indicating that environmental exposure to TCS may lead to potential adverse health effects.

Key Words: triclosan;  Caenorhabditis elegan behavioral toxicity;  progeny;  environmental concentration 

图 1

三氯生线虫毒性评价研究设计示意图

Figure 1 [注]T0、T1、T2、T3、T4分别指染毒0、2.9×10-2、2.9、2.9×102、2.9×104μg/L三氯生溶液。
图 2

三氯生对亲代线虫(P0)及各种染毒模式下子代线虫(AF1、BF1和CF1)身体弯曲频率的影响

Figure 2 [注]*:与对应对照组相比, P < 0.05;#:与同质量浓度的P0比较, P < 0.05;※:与同质量浓度的AF1比较, P < 0.05。
图 3

三氯生对亲代线虫(P0)及各种染毒模式下子代线虫(AF1、BF1和CF1)头部摆动频率的影响

Figure 3 [注]*:与对应对照组相比, P < 0.05;#:与同质量浓度的P0比较, P < 0.05;※:与同质量浓度的AF1比较, P < 0.05。

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我国各级医疗机构对儿童用基本药物剂型和规格的需求调查

目前有超过1 000种化学品被定义为新现污染物(emerging pollutants, EPs), 这些污染物可以在环境中检出, 但其环境转归或毒性尚不明确, 未列入常规污染物检测中。其中, 三氯生是一种广谱抗菌剂, 在个人护理用品、厨房清洁用品、玩具和其他材料中被广泛使用。据估计, 我国每年的三氯生使用量为100 t, 排放至环境中的量约为66.1 t[1]。三氯生主要经由生活护理用品的使用排至下水道, 通过污水处理厂处理后, 排放至地表水中, 其中90.8%被留在水体中, 另外9.2%蓄积于污泥或生物体内[1]。三氯生在美国被认为是地表水的七大主要污染物之一, 在中国以及欧洲部分国家的地表水中也被广泛检出, 其环境质量浓度(下称浓度)范围为1.4×10-3~40 μg/L[2]。三氯生主要经消化道和皮肤吸收进入体内[3-5], 不仅在多种水生生物体内被检测到, 而且越来越多的研究表明其在人类血、尿、乳汁、脂肪、胎盘、指甲及其他生物介质中均有分布[6]

三氯生曾经被认为是无毒或低毒性的抗菌剂, 因而被广泛使用, 直到其在环境和生物体内广泛检出, 并发现对人类具有潜在健康危害才开始受到关注[7]。现有研究发现三氯生对细菌、植物、鱼类、鸟类、哺乳动物等均可能具有毒性[3], 在人体内造成内分泌干扰和抗性激素毒性。另外也有研究提示三氯生可能具有潜在的神经毒性[8], 主要表现为促进神经细胞的凋亡[9]和引起氧化应激[9-10]。三氯生对水生植物和某些微生物在环境相关浓度下就会产生生长抑制和生殖毒性[3], 在鱼类等生物体内甚至存在生物蓄积的现象[6]。因此推测环境浓度下三氯生的毒性效应可能延续至子代, 但目前该相关研究尚显不足。

本研究选用的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)是目前生命科学研究领域应用非常广泛的模式生物之一, 将其应用于多世代毒性效应研究时具有独一无二的优势, 具体表现为其具有短而精准的生命周期、多个敏感的检测指标[11], 可自体繁殖[12], 易于在实验室中培养, 遗传背景保守等特点, 已经被成功地应用于磺胺类抗生素[11, 13-15]、重金属[14-16]等化学物质的多世代毒性效应研究中。运动行为是体现线虫神经系统是否受到损害的一个快速评价指标[14], 已被证明对化学物的毒性反应很灵敏[11]。本研究根据三氯生在环境中的浓度设计线虫的染毒浓度, 设计不同的染毒模式模拟环境中子代的不同暴露情况, 利用常见的线虫行为指标观察三氯生对亲代及不同染毒模式下子代的行为毒性效应, 为三氯生的环境安全性提供实验数据, 并为构建三氯生多世代毒性的快速评价模型提供依据。

1   材料与方法

1.1   试剂和仪器

三氯生标准品、胆固醇和二甲基亚砜(dimethylsulfoxide, DMSO)(Sigma, 美国), 胰蛋白胨、琼脂、酵母抽提物、多聚蛋白胨(Oxoid, 英国), NaCl、CaCl2、MgSO4、KH2PO4、K2HPO4、NaClO、NaOH、KCl、Na2HPO4等(温州市金山试剂公司, 中国), SZ650体视显微镜(深圳市奥特光光学制品有限公司, 中国)。

1.2   实验动物的准备

野生型秀丽隐杆线虫N2和大肠杆菌OP50(线虫食物)均来源于美国秀丽隐杆线虫遗传中心(Caenorhabditis Genetics Center)。线虫培养需要线虫生长培养基(nematode growth medium, NGM)和大肠杆菌OP50。

NGM配制:NaCl3g, 多聚蛋白胨2.5g, 琼脂17g, 蒸馏水975 mL, 高压灭菌。置水浴锅冷却至55℃左右, 无菌环境下依次加入1mol/L CaCl2(称取110.99g CaCl2, 加水定容至1L, 0.22μm滤器滤菌)1mL、1mol/L MgSO4 (称取246.47 g MgSO4·7H2O, 加水定容至1 L, 高压灭菌)1 mL、5 g/L胆固醇(50 mg胆固醇溶于10 mL乙醇中, 超声溶解)1 mL、1 mol/L磷酸钾缓冲液(称取108.3 g KH2PO4和35.6 g K2HPO4, 加水定容至1 L, 高压灭菌)25 mL, 磁力搅拌器上混匀后倒入无菌塑料培养皿(直径为35 mm、60 mm或90 mm)。

大肠杆菌OP50配制:5 g NaCl, 10 g胰蛋白胨, 5 g酵母抽提物, 加蒸馏水配成1 L(pH=7.0), 高压灭菌后得L-Broth液体培养基, 取少许OP50于此液体培养基中37℃振荡培养过夜。分别取100、500 μL, 1 mL加入35、60、90 mm的NGM上, 晾干后形成菌膜层, 用于线虫培养。

用于染毒的线虫为同步化的L3期幼虫, 次氯酸裂解液(1%NaClO、0.5 mol/L NaOH)用于获得同步化的卵[17], NGM上继续培养36h获得L3期幼虫。NGM[18]、线虫培养均置于20℃恒温培养箱中[19]

1.3   染毒液配置

三氯生标准品溶解于含1%DMSO的K溶液(0.051 mol/L NaCl、0.032 mol/L KCl)中配成3 mol/L储备液, 滤菌后于4℃保存。

实验前, 用K溶液稀释储备液。参考三氯生的环境浓度[2]设置2个环境浓度组T1和T2(2.9×10-2、2.9 μg/L)以及2个高于环境质量浓度组T3和T4(2.9×102、2.9×104 μg/L), 以含1%DMSO的K溶液作为对照组T0

1.4   染毒方法

实验设计见图 1。本研究设计是根据以往研究稍作修改而成[14-15]。取96孔板中间的6行10列进行三氯生染毒。每组两列, 每个孔内加100 μL染毒液和100 μL含有200条左右同步化L3期线虫的K溶液。染毒72 h后, 各组分别取1个孔的线虫用K溶液清洗后置于NGM上, 待状态稳定后观察其运动行为, 包括身体弯曲频率和头部摆动频率, 即亲代P0的行为指标。取各组剩余11孔的线虫, 同样方法清洗静置后, 转移至正常NGM培养皿。20℃继续培养36 h后分别同步化, 其子代分为3组继续培养48 h至成年。A组子代停止染毒(正常NGM上培养, AF1);B组子代染毒浓度与亲代一致(转移至含有与亲代染毒浓度一致的培养皿, BF1);C组子代染毒浓度与亲代不一致(CF1), 包括:①亲代不染毒, 子代2.9×10-2 μg/L三氯生染毒, 即“亲无子低”(T0T1)模式;②亲代2.9×10-2 μg/L三氯生染毒, 子代2.9×104 μg/L三氯生染毒, 即“亲低子高”(T1T4)模式;③亲代2.9×104 μg/L三氯生染毒, 子代2.9×10-2 μg/L三氯生染毒, 即“亲高子低”(T4T1)模式。分别观察P0、AF1、BF1和CF1各组线虫行为毒性指标的改变。整个实验独立重复3次。

图 1

三氯生线虫毒性评价研究设计示意图

1.5   线虫头部摆动频率的测定

在测试盘培养基表面滴加60 μL M9缓冲液(3 g KH2PO4、6 g Na2HPO4、5 g NaCl、1 mL 1 mol/L MgSO4, 加水定容至1 L, 高压灭菌)。将线虫挑入溶液中, 镜下观察线虫摆动频率均匀后, 记录线虫在1 min内头部摆动的次数(当身体弯曲达到体长的一半时视为1次头部摆动)。每组至少测量10条线虫。

1.6   线虫身体弯曲频率的测定

将线虫转移到测试盘中, 镜下观察并记录线虫1 min内身体弯曲的次数。假定沿着线虫咽泵的方向为y轴, 在线虫爬行过程中, 身体沿着相应x轴方向上的1次改变定义为1个身体弯曲。每组至少测量10条线虫。

1.7   统计学分析

取P0、AF1、BF1、CF1线虫对照组的平均值, 计算染毒组占对照组的百分比。用SPSS 21.0软件进行方差齐性检验和单因素方差分析(one-way ANOVA), 用LSD法进一步比较染毒组与对照组之间的差异以及P0、AF1和BF1间的差异。图中所有数据均以x±s表示。检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   子代线虫身体弯曲频率

P0、AF1、BF1和CF1各对照组线虫身体弯曲频率分别为(72.6±1.5)、(73.9±1.1)、(75.7±1.6)、(71.8± 1.7)次/min。L3期亲代线虫P0经三氯生染毒72 h后, 各组线虫身体弯曲频率与对照组相比, 差异无统计学意义(P > 0.05)。停止染毒的AF1各组与对照组的身体弯曲频率差异无统计学意义(P > 0.05)。BF1随着染毒浓度的增加, 身体弯曲频率先升高后降低, 即:与对应对照组相比, 2.9×10-2 μg/L组身体弯曲频率增加了10.4%, 2.9×102和2.9×104 μg/L组分别降低了15.4%和30.1%;差异均有统计学意义(P < 0.05)。见图 2A

图 2

三氯生对亲代线虫(P0)及各种染毒模式下子代线虫(AF1、BF1和CF1)身体弯曲频率的影响

P0、AF1、BF1身体弯曲频率的比较结果见图 2A。停止染毒的子代AF1中仅2.9×104 μg/L组与亲代P0的差异有统计学意义(P < 0.05)。BF1与P0相比, 染毒质量浓度为2.9×10-2、2.9和2.9×102 μg/L时, 身体弯曲频率的差异无统计学意义(P > 0.05);当染毒浓度升高至2.9×104μg/L时, BF1较P0下降, 差异有统计学意义(P < 0.05)。在染毒浓度为2.9×102、2.9×104 μg/L时, AF1和BF1间的差异有统计学意义(P < 0.05)。见图 2A

CF1各染毒模式线虫的身体弯曲次数的结果见图 2B。与对照组相比, T0T1组升高18.4%, T1T4组、T4T1组分别降低10.3%和23.1%, 差异均有统计学意义(P < 0.05)。

2.2   子代线虫头部摆动频率

P0、AF1、BF1和CF1各对照组线虫头部摆动频率分别为(116.7±3.6)、(127.4±2.2)、(126.5±5.6)、(136.8±1.8)次/min。P0线虫在2.9×104μg/L时的头部摆动频率与对照组相比差异有统计学意义(P < 0.05)。AF1各组与对照组相比差异无统计学意义。BF1各组头部摆动频率随染毒浓度的增加而降低, 当浓度升高至2.9、2.9×102、2.9×104 μg/L时, 与对照组相比均降低, 差异有统计学意义(P < 0.05)。见图 3A

图 3

三氯生对亲代线虫(P0)及各种染毒模式下子代线虫(AF1、BF1和CF1)头部摆动频率的影响

P0和AF1、BF1头部摆动频率的比较结果见图 3A。AF1在2.9×102、2.9×104 μg/L染毒时, 头部摆动频率较P0升高, 差异有统计学意义(P < 0.05)。在2.9× 10-2、2.9、2.9×102 μg/L染毒时, BF1头部摆动频率低于P0, 差异均有统计学意义(P < 0.05)。和BF1相比, AF1头部摆动频率在各组均下降, 差异有统计学意义(P < 0.05)。

CF1各染毒模式线虫的头部摆动频率结果见图 3B。与对照相比, T0T1和T1T4组头部摆动频率分别升高2.6%和1.5%, 差异无统计学意义(P > 0.05);与对照组相比, T4T1组降低5.9%, 差异有统计学意义(P < 0.05)。

3   讨论

三氯生在环境和人体内被越来越多地检出。虽然该化学物质本身在人体内的生物半衰期较短(小于24 h)[5], 但由于使用量、排放量的持续增加, 三氯生在环境中浓度持续上升, 人类面临长期暴露的风险。已有研究表明三氯生可能具有内分泌干扰作用、生殖毒性和遗传毒性等健康影响[20-28], 但这些研究中三氯生的染毒浓度普遍在毫克级别, 远高于环境中实际浓度(低于40 µg/L), 且三氯生在环境中持久存在, 具有对子代产生健康危害的风险, 相关研究尚显不足。另外, 目前也没有动物实验或流行病学研究证明生命早期(如胎儿期、婴儿期)的三氯生染毒是否会对神经发育产生影响[5]。本研究以线虫为研究对象, 观察并比较自幼虫阶段开始染毒的亲代线虫(P0)、亲代染毒而子代停止染毒的AF1、亲代染毒且子代与亲代相同浓度染毒的BF1, 以及亲代染毒后子代染毒浓度与亲代不一致的CF1, 三氯生在环境浓度及高于环境浓度下对其运动行为的毒性作用。研究结果表明三氯生对线虫运动行为存在毒性影响, 且对亲代和子代的影响不同, 不同染毒模式下对子代的行为毒性也不同。

运动行为是评价线虫健康状态的常用方法[29], 可以反映线虫神经系统的整体状况[30-31], 其中尤以头部摆动频率和身体弯曲频率两个指标最为常用, 前者可以反映线虫爬行过程中运动方向的改变速度, 后者可以反映其运动形式的振幅和波速改变[32]。这两个指标操作简单, 即使在环境浓度下也可以灵敏地反映化学物的毒性[11], 这已经在石墨烯纳米材料[33]、磺胺类[14]、重金属类[15]、稀有元素[34]等的行为毒性评价实验中被成功验证, 而且对神经系统的受损非常敏感, 是神经系统受损的快速评价指标[14]。本实验亲代和子代的指标观察均选择在线虫成年期, 因为虽然线虫大部分神经元是在幼虫阶段生成的, 但神经环路的连接是在幼虫晚期完成的[35], 待线虫成年后, 所观察到的指标改变更能体现外来化合物的作用, 指标性能更准确和稳定。与本研究不同, ZHANG等[36]观察仅亲代染毒的子代线虫(与AF1一致)的行为改变时选择的是L4期线虫, 即幼虫晚期, 这可能是本研究中AF1未出现行为抑制, 而ZHANG等[36]发现AF1在0.1 µmol/L(即29 μg/L)三氯生染毒时就出现身体弯曲频率和头部摆动频率明显抑制的原因。另外, 在本研究中, 头部摆动频率比身体弯曲频率更敏感, 这与LI等[33]对石墨烯纳米材料毒性评价结论相反, 但与XU等[34]对稀有元素、TSENG等[37]对邻苯二甲酸盐毒性的评价结论一致。该指标降低表明线虫运动行为缺陷, 而线虫行为的变化主要受多种神经元及其相互间的神经传导控制。支配线虫运动的神经元网络主要包括负责前后运动的A型或B型运动神经元、中间神经元以及参与运动协调的D型运动神经元[14, 30]。不同化合物会导致线虫的运动行为出现不同的改变, 可能与线虫神经元网络的不同部位受到不同程度损伤有关。

20℃正常培养条件下, 线虫的生活周期通常是3~4 d[38], 因此, 线虫适合用于考察环境污染物毒性是否会在多世代间进行传递。目前, 有关将线虫应用于环境污染物多世代毒性的研究已系统展开, 包括环境中重金属、抗生素、持久性有机化合物和纳米材料等[13-14, 38]。本研究中亲代线虫P0的身体弯曲频率和头部摆动次数在环境浓度(2.9×10-2和2.9 μg/L)染毒时轻微升高, 在较高浓度(2.9×102和2.9×104 μg/L)染毒时下降, 由此推测P0在环境浓度染毒下出现了毒物兴奋效应[39]

本研究子代的染毒模式共设置了3组:仅亲代染毒而子代不染毒的AF1是模拟三氯生在亲代线虫染毒后受到控制, 子代不再染毒, 观察亲代的毒性是会传递给子代还是在子代得到恢复;另外2组则是模拟实际环境中三氯生持续染毒, 包括持续与亲代一致染毒的BF1和与亲代不一致染毒的CF1。子代AF1的行为在各浓度三氯生染毒下均未出现改变, 表明亲代的毒性效应在子代AF1可以恢复或部分恢复, 这可能因为三氯生的半衰期较短有关, 停止染毒后, 三氯生在线虫体内被代谢, 行为毒性未传递给子代。与AF1结果不同, BF1在环境浓度的三氯生染毒时就出现了行为抑制, 而同样染毒浓度下, 亲代P0未出现明显危害, 表明三氯生在环境浓度的持续染毒下依然具有潜在健康危害。CF1各染毒模式中, 亲代高浓度染毒而子代环境浓度染毒时, 子代出现的行为抑制最明显, 虽然AF1中表明亲代的行为毒性未传递给子代, 但亲代高浓度接触三氯生后, 可能导致子代对三氯生毒性的敏感性增加, 更易出现行为毒性。亲代不染毒而子代环境浓度染毒时, 线虫的运动行为同样出现了毒物兴奋效应, 与亲代P0的表现一致。

综上所述, 环境浓度下三氯生随染毒时间和染毒模式不同能够引起子代线虫的运动行为改变。该研究结果提示环境中持久存在的三氯生需要引起重视, 应采取治理措施以避免三氯生对子代造成严重的健康危害。

《环境与职业医学》杂志官方网站

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