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2018, 35(5):447-451.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2018.17684

Effects of zinc oxide nanoparticle on expression of inflammatory factors and phosphorylation of p38MAPK in BV2 microglia


Key Laboratory of Environmental Medicine, Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, Nanjing, Jiangsu 210009, China

Accepted: 2017-11-16;  Published: 2018-07-06

Corresponding Author: ZHANG Xiao-qiang, Email: zhangxq7843@126.com  

[Objective] To investigate the effects of zinc oxide nanoparticle (nano-ZnO) on expression of inflammatory factors and phosphorylation of p38 mitogen-activated protein kinases (p38MAPK) in BV2 microglia.

[Methods] BV2 cells were treated with different concentrations of nano-ZnO (0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 30.0, 50.0, and 75.0 mg/L) for 24 h. MTT assay was used to assess the viability of BV2 cells and determine the exposure concentration. Then, BV2 microglia were treated with nano-ZnO (0, 5.0, 10.0, 15.0, and 20.0 mg/L) for 24 h, and the levels of lactate dehydrogenase (LDH) was detected by LDH detection kit, the secretion of tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin (IL)-1β, and IL-6 by ELISA, the protein levels of phosphorylated p-38MAPK (p-p38MAPK) by Western Blot, and the gray value of protein band by Image J software. The relationship between the expression of inflammatory factors and the protein level of p-p38MAPK was analyzed by Spearman correlation analysis.

[Results] Increasing nano-ZnO treatment significantly decreased the viability of BV2 cells (r=-0.994, P < 0.001) and increased the activity of LDH (r=0.749, P < 0.001). Compared to the control group, the levels of TNF-α, IL-1β, and IL-6 increased in the 10.0, 15.0, and 20.0 mg/L nano-ZnO exposure groups (Ps < 0.05). Western bolt results showed that the expression levels of p-p38MAPK increased in the nano-ZnO exposure groups and were consistent with the change trend of inflammatory factor levels (rTNF-α=0.836, P < 0.001; rIL-6=0.539, P < 0.001; rIL-1β=0.659, P=0.008). The grey value ratio of p-p38MAPK and p38MAPK was higher in the 20.0mg/L nano-ZnO exposure group than in the control group (P < 0.05).

[Conclusion] Exposure to nano-ZnO could induce elevated secretion levels of inflammatory cytokines and expression levels of p38MAPK phosphorylation in BV2 microglia.

Key Words: zinc oxide nanoparticle;  microglia;  inflammation factor;  p38 mitogen-activated protein kinases 

图 1

nano-ZnO对BV2细胞TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影响

Figure 1 [注]*:与对照组比较, P < 0.05。
图 2

nano-ZnO对BV2细胞p38MAPK蛋白磷酸化水平的影响

Figure 2 [注]A: p-p38MAPK和p38MAPK蛋白表达Western blot结果; B: p-p38MAPK与p38MAPK灰度值比值分析。*:与对照组比较, P < 0.05。

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我国各级医疗机构对儿童用基本药物剂型和规格的需求调查

纳米氧化锌(zinc oxide nanoparticle, nano-ZnO)作为一种新型多功能无机材料, 广泛应用于化妆品、生物传感器、食品包装及添加剂、水泥、橡胶、陶瓷、颜料、塑料、催化剂和电子材料等领域[1], 与人们的生活密切相关, 导致人体暴露机会随之增加。nano-ZnO可通过不同途径进入人体内, 分布到不同组织器官, 对其造成损伤, 进而威胁人体健康。机体脑组织容易因积累金属纳米颗粒而出现毒性损伤, 神经元作为神经系统结构和功能的基本单位不具备分裂能力, 神经组织受损后难以通过再生进行修复, 所以造成的器官损伤通常是不可逆的。已有研究表明nano-ZnO比其他纳米颗粒有更强的毒性作用[2-3], 中枢神经系统是nano-ZnO重要的靶器官[4]。现有研究结果证实nanoZnO可引发中枢神经系统损伤, 破坏血脑屏障的完整性, 改变突触可塑性, 减弱大鼠的空间认知能力和学习记忆能力, 导致小胶质细胞活化、神经元死亡, 引起脑组织明显的氧化应激和免疫炎性反应[5-6]。因此长期接触nano-ZnO可能是导致神经退行性疾病的潜在危险因素。但目前对nano-ZnO的毒性研究主要集中在活性氧的产生和Zn2+释放[1], 就神经炎症毒性作用的研究仍相对较少, 其毒性及其作用机制还有许多不确定性。

神经小胶质细胞是中枢神经系统中天然的免疫细胞, 负责消灭微生物, 清除死细胞, 冗余突触、蛋白质聚集物以及其他可能危及中枢神经系统的微粒和可溶性抗原。此外, 神经小胶质细胞作为中枢神经系统炎症刺激的第一反应细胞, 是促炎性细胞因子产生的主要来源, 是介导神经炎症的关键介质, 可以诱导或调节广泛的细胞反应[7]。当小胶质细胞被激活, 会释放大量的肿瘤坏死因α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素(interleukin, IL)、神经生长因子、趋化因子等, 造成小胶质细胞炎症损伤。在中枢神经系统中, 小胶质细胞被活化后能发挥免疫应答作用, 参与并促进神经系统中多种疾病及应激损伤的发生和发展[8]。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogenactivated protein kinase, p38MAPK)是丝裂原活化蛋白激酶家族重要成员, 是炎症反应调控系统中的一条重要信号通路[9]。本研究通过nano-ZnO染毒BV2小胶质瘤细胞, 观察炎症因子的释放情况及p38MAPK蛋白磷酸化水平, 探讨nano-ZnO诱导BV2细胞炎症反应的分子机制。

1   材料与方法

1.1   试剂

nano-ZnO颗粒(粒径为20 nm, 南京海泰纳米材料有限公司, 中国), BV2细胞(中国医学科学院基础医学研究所细胞中心, 中国), DMEM高糖培养基(Hyclone, 美国), 胎牛血清(Clarkbio, 美国), 二甲基亚砜、四甲基噻唑蓝(thiazolyl blue, MTT) (Sigma, 美国), 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液(Gibco, 美国), 乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所, 中国), TNF-α、IL-1β及IL-6 ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司, 中国), 聚偏氟乙烯膜(Milliproe, 美国), p38MAPK抗体、磷酸化p38MAPK (p-p38MAPK)抗体、山羊抗兔IgG-HRP、蛋白免疫印迹鲁米诺化学发光试剂(Santa Cruz, 美国)。

1.2   仪器

Zetasizer Nano-ZS90型马尔文粒径分析仪(Malvern, 英国), KQ-2200E型超声波清洗仪(昆山超声仪器有限公司, 中国), Series 800二氧化碳培养箱(Thermo Scientific, 美国), 5417R高速冷冻离心机(Eppendorf, 德国), RT-6000酶标分析仪(Rayto, 美国), MiniProtein 3小型垂直电泳槽(Bio-Rad, 美国), JY600C电泳仪(北京六一仪器厂, 中国), Tanon 5200化学发光成像系统(上海天能科技有限公司产品, 中国)。

1.3   方法

1.3.1   nano-ZnO颗粒表征

用培养基将nano-ZnO配制成1 000 mg/L的母液, 使用前超声混匀30 min使之成为纳米颗粒悬液。应用动态光散射法及Zeta电位对nano-ZnO颗粒粒径分布及分散体系的稳定性进行评价。

1.3.2   细胞培养

将BV2细胞培养于DMEM高糖完全培养基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素), 置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。隔天换液, 每2~3d传代1次。待培养至对数生长期进行实验。1.3.3 MTT法检测细胞活性取对数生长期细胞, 将BV2细胞以5×103个/孔接种于96孔板中, 设立空白组(只含培养基)、对照组、nano-ZnO染毒组(5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、50.0、75.0 mg/L), 每组设5个复孔, 待细胞贴壁后将原培养基吸弃, 加入含nano-ZnO悬液, 于37℃、5%CO2培养箱共同孵育24 h [10]后, 每孔加MTT溶液(5.0 mg/mL)10 μL, 37℃孵育4 h后, 吸弃培养基, 每孔加入二甲基亚砜150 μL, 振荡10 min, 酶标仪测定光密度值(D值)。计算各组细胞存活率, 其公式为:细胞存活率= (处理组D值-空白组D值) (/对照组D值-空白组D值)×100%。根据MTT结果并结合KO等人的研究结果[11], 选取nano-ZnO染毒剂量为5.0、10.0、15.0、20.0 mg/L。

1.3.4   细胞完整性检测

将BV2细胞接种于24孔板内, 接种细胞密度为1×105个/mL, 每孔500 μL, 将BV2细胞分为对照组和nano-ZnO染毒组(5.0、10.0、15.0、20.0 mg/L), 每组设5个复孔, 取细胞培养液, 离心, 取上清液, 用LDH试剂盒检测。按试剂盒说明操作, 设置标准空白管, 于450 nm测定各组的D值。LDH活性= (测定管D值-测定空白管D值)(/标准管D值-标准空白管D值)×标准品浓度×1 000。

1.3.5   ELISA法检测TNF-α、IL-6、IL-1β水平

nanoZnO干预24 h后, 取细胞培养液上清液离心20 min (3 000 r/min, 离心半径为5.5 cm), 收集上清液。应用ELISA双抗体夹心法测定各细胞因子水平, 具体操作按照ELISA试剂盒说明书进行, 酶标仪测定光密度值D450。根据标准曲线分别确定样品中TNF-α、IL-6、IL-1β的水平。

1.3.6   Western blot法检测p38MAPK蛋白及磷酸化水平

经nano-ZnO处理24 h后弃去培养基, 预冷PBS液冲洗2遍, 用细胞刮片收集细胞, 采用裂解液裂解细胞, 离心10 min (12 000 r/min, 离心半径5.5 cm), 收集上清, 提取蛋白, 采用BCA蛋白测定试验盒(南京建成工程研究所, 中国)测定样品蛋白浓度, 配胶、上样、电泳, 冰水混合物上转膜, 用5%脱脂牛奶封闭2 h, 加一抗p38MAPK、p-p38MAPK (体积比均为1:1 000), 4℃过夜, TBST洗膜后, 加山羊抗兔IgG-HRP孵育1.5 h, 曝光显色。采用Image J软件对蛋白条带灰度值进行分析。

1.4   统计学分析

实验数据均以x±s表示。采用SPSS 17.0软件进行统计学分析, 多组比较采用方差齐性检验和单因素方差分析(one-way ANOVA)。进一步组间两两比较时, 若方差齐, 采用LSD-t检验; 若方差不齐, 采用GamesHowell检验。Spearman相关分析结果以相关系数r表示。检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   nano-ZnO的表征

使用马尔文粒径分析仪测得培养基分散的nanoZnO颗粒的平均水合粒径为(220.83±9.11)nm, Zeta电位是(-17.87±0.58)mV, 分散系数为0.11±0.07, 分散系稳定性良好。

2.2   nano-ZnO对BV2细胞存活率的影响

细胞存活率随着染毒剂量的增加而降低(r=-0.994, P < 0.001), 其中30.0~75.0 mg/L剂量组细胞存活率分别为69.87%、23.76%、18.02%, 均低于对照组, 差异有统计学意义(P < 0.05)。

2.3   LDH活性的变化

随着nano-ZnO染毒剂量的增加, 染毒组LDH活性较对照组分别增加了0.56%、28.87%、30.94%、53.58%, 其中15.0 mg/L和20.0 mg/L染毒组与对照组间的差异有统计学意义(P < 0.05)。LDH活性与染毒剂量呈正相关(r=0.749, P < 0.001)。

2.4   TNF-α、IL-1β和IL-6水平的变化

nano-ZnO染毒组与对照组相比, 除5.0 mg/L组的TNF-α外, BV2细胞TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高, 差异具有统计学意义(P < 0.05), 且在一定剂量范围内呈剂量-效应关系(rTNF-α=0.922, P < 0.001; rIL-6=0.917, P < 0.001; rIL-1β=0.866, P < 0.001) (见图 1)。

图 1

nano-ZnO对BV2细胞TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影响

2.5   p38MAPK蛋白磷酸化水平的变化

与对照组相比, 各nano-ZnO染毒组BV2细胞p38MAPK蛋白磷酸化表达水平增高, 尤以高剂量组p-p38MAPK蛋白表达水平增高最为明显(见图 2A), 且p-p38MAPK蛋白表达水平变化趋势与炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β分泌水平的变化趋势相一致(rTNF-α=0.836, P < 0.001; rIL-6=0.539, P < 0.001; rIL-1β=0.659, P=0.008)。蛋白条带灰度值分析结果显示, 随着nano-ZnO剂量的增加, p-p38MAPK/p38MAPK值增加(见图 2B), 差异具有统计学意义(r=0.851, P < 0.001)。

图 2

nano-ZnO对BV2细胞p38MAPK蛋白磷酸化水平的影响

3   讨论

随着纳米技术的不断发展, nano-ZnO由于其优异的理化特性, 被广泛地应用于各个领域, 人类暴露于nano-ZnO的概率也大大增加。由于纳米颗粒具有小尺寸和独特的物理化学特性, 使其相对容易地跨越多种生物屏障, 经由嗅球-大脑转运途径和血脑屏障-中枢神经系统途径进入大脑, 在大脑中逐渐积累可能会损坏神经细胞和脑功能, 导致永久性脑损伤。大脑发育早期小胶质细胞就已经存在, 几乎均匀分散在整个中枢神经系统中[12], 被认为是中枢神经系统内的“巨噬细胞”, 当大脑受到外界刺激后, 小胶质细胞被激活并递呈抗原和分泌细胞因子, 构成中枢神经系统抵御病原体入侵的第一防线[13]。因此, 评价小胶质细胞的炎症反应对于nano-ZnO的生物安全性风险评估具有重要意义。

本研究发现在暴露于nano-ZnO 24 h后, 随着nano-ZnO染毒剂量的增加, 细胞存活率逐渐降低, LDH活性逐渐上升。同时, 与对照组比较, nano-ZnO染毒组TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平亦相应增高。结果表明, nano-ZnO可以破坏BV2细胞膜的完整性, 引起细胞炎症损伤, 这与之前报道的许多脑部损害在出现严重病变之前会出现小胶质细胞激活, 从而导致炎症因子分泌水平增高[14]的结论一致。小胶质细胞的过度激活和失调导致大量细胞因子持续释放, 细胞生存环境恶化, 造成细胞自身的持续激活与死亡, 进而导致神经炎症及神经元损伤[15], 造成渐进性的神经毒性结局。研究发现细胞暴露于纳米粒子能够诱发炎症, ROY等[10]报道了nano-ZnO可以诱导巨噬细胞产生活性氮和环氧合酶-2、诱导型氧化氮合酶、促炎细胞因子(IL-6、TNF-α、IL-17、IL-10)的过度表达。HACKENBERG等[16]的研究同样证明了人血细胞和鼻腔黏膜细胞暴露于nano-ZnO可引起细胞毒性及促炎反应, 这与本研究得出的结论相一致。尽管有研究对nano-ZnO能否诱导促炎因子的产生提出相左的意见, 但有学者提出这可能是由于在nano-ZnO激活细胞后, 与细胞共培养的时间过长, 导致细胞因子吸附在nano-ZnO上, 使得ELISA检测结果呈阴性[17]; SHARMA等[18]研究nano-ZnO对N9细胞氧化损伤时也并未发现nano-ZnO能够引起N9细胞的炎症因子释放, 推测这可能是由于其实验所用的染毒剂量过大, 致使细胞死亡有关。

MAPK是体内广泛存在的一类丝氨酸苏氨酸蛋白激酶, 不同MAPK信号通路对不同的细胞外刺激和细胞生长进程进行调节。研究显示MAPK易被纳米粒子激活并在细胞应激和炎症反应中起调节作用[19]。作为MAPK家族中重要的成员, p38MAPK信号通路被认为是细胞信号转导通路的中转站[20], 是参与细胞生长、分化、凋亡、炎症的重要通路。在炎症反应中, 通过非磷酸化转化为磷酸化状态进而促进下游底物的磷酸化来快速实现信号传递, 介导炎症反应, 促进炎性介质分泌[21]。因此, p38MAPK的活性对正常的免疫和炎症反应至关重要。KO等[11]研究发现纳米氧化铜对支气管上皮细胞有促炎作用, 并可诱导p38MAPK磷酸化水平增加。SENAPATI等[22]研究nano-ZnO对人血细胞炎症及信号通路影响时也得出了相似的结论, 认为nano-ZnO可以通过MAPK信号转导通路介导细胞炎症反应, c-Jun氨基末端激酶、细胞外调节激酶ERK1/2和p38MAPK蛋白磷酸化的表达水平增加。本研究发现nano-ZnO诱导的炎性细胞因子表达水平与p38MAPK蛋白磷酸化水平呈正相关关系。因此, 推断nano-ZnO致小胶质细胞炎症反应可能与p38MAPK蛋白磷酸化有关。但本研究对于MAPK信号通路与nano-ZnO的神经毒性效应未做全面探索, 后续实验将进一步研究MAPK信号通路在nano-ZnO诱导小胶质细胞炎症反应中的作用, 为探索nano-ZnO导致中枢神经系统损害的机制提供理论基础。

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