《环境与职业医学》杂志官方网站 《环境与职业医学》杂志官方网站

2018, 35(6):541-545.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2018.17701

Change of PARK2 gene expression and association with motor and memory functions of rats after demanganization


1. The Third Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi, Guizhou 563000, China2a. School of Public Health, Ministry of Education, Zunyi Medical University, Zunyi, Guizhou 563000, China2b. Key Laboratory of Basic Pharmacology, Ministry of Education, Zunyi Medical University, Zunyi, Guizhou 563000, China3. Department of Health Management, Zunyi Medical and Pharmaceutical College, Zunyi, Guizhou 563006, China

Accepted: 2017-11-30;  Published: 2018-07-06

Corresponding Author: FAN Qi-yuan, Email: qiyuan_fan@yahoo.cn  

[Objective] To explore the change of PARK2 gene expression in whole blood before and after cessation of manganese exposure in rats, and the association with motor and memory functions.

[Methods] Sixty healthy adult SD rats were randomly divided into control group (saline), low dose group (MnCl2, 1 mg/kg), and high dose group (MnCl2, 5 mg/kg), with 20 rats in each group. The animals were injected intraperitoneally with MnCl2 at 5 mL/kg, once every other day. After continuous intraperitoneal injection for 4 weeks, 10 rats in each group were randomly selected for experiments on motor and memory functions such as rotarod performance test (RPT) and Y maze experiment. PARK2 gene expression in whole blood was detected by real-time fluorescence quantitative PCR (RT-PCR), and concentration of manganese in whole blood by graphite furnace atomic absorption spectrometry (AAS). The remaining rats in each group stopped intraperitoneal injection of manganese and received normal feeding for 5 months. They were anesthetized with ether every month to collect whole blood samples of infrarenal vein and detect changes of PARK2 expression.

[Results] One month after intraperitoneal injection of MnCl2, the blood levels of manganese of the high dose group[(5.31±0.23) mg/L] and low dose group[(3.13±0.16) mg/L] were increased compared with the control group[(2.10±0.15) mg/L] (P < 0.05); the PARK2 gene expression levels of the high dose group (6.83±1.97) and the low dose group (13.15±3.84) were lower than that of the control group (26.05±3.66) (P < 0.05); the distance traveled in RPT of the high dose group[(743.56±99.66) cm] was lower than that of the control group[(1 547.09±192.53) cm] (P < 0.05); the level of manganese in whole blood was negatively correlated with the RPT distance traveled (r=-0.74) and PARK2 gene expression (r=-0.57) (Ps < 0.05); PARK2 gene expression was positively correlated with the distance traveled in RPT (r=0.61, P=0.02). After 5 months of cessation of manganese exposure, the blood level of manganese in the high dose group[(2.54±0.20) mg/L] was decreased (P < 0.05), but still higher than that in the control group[(1.80±0.09) mg/L] (P < 0.05); the distance traveled of the high dose group was (1 105.73±132.23) cm, which was higher than that before cessation of manganese exposure (P < 0.05).

[Conclusion] PARK2 gene expression in whole blood and motor function of rats would recover after cessation of subacute manganese poisoning, and PARK2 gene may be used to determine the damage to motor function caused by manganese.

Key Words: manganese;  PARK2 motor;  memory 

表 1

PARK2β-actin引物序列

Table 1
表 2

染锰和脱锰大鼠血锰浓度比较(xs, mg/L, n=10)

Table 2
表 3

染猛和脱猛大鼠的转棒时间、平均速度、转棒距离及Y迷宫交替率比较(x±s, n=10)

Table 3
图 1

染锰和脱锰大鼠PARK2基因表达变化

Figure 1 [注]*:P<0.05。

Reference

[1]

LIU M C, CAI T J, ZHAO F, et al. Effect of microglia activation on dopaminergic neuronal injury induced by manganese, and its possible mechanism[J]. Neurotox Res, 2009, 16(1):42-49.

[2]

SHI S S, ZHAO J Y, YANG L, et al. KHSRP participates in manganese-induced neurotoxicity in rat striatum and PC12 cells[J]. J Mol Neurosci, 2015, 55(2):454-465.

[3]

SHIMURA H, HATTORI N, KUBO S I, et al. Familial Parkinson disease gene product, parkin, is a ubiquitin-protein ligase[J]. Nat Genet, 2000, 25(3):302-305.

[4]

FAN Q Y, ZHOU Y, YU C Y, et al. Cross-sectional study of expression of divalent metal transporter-1, transferrin, and hepcidin in blood of smelters who are occupationally exposed to manganese[J]. Peer J, 2016, 4:e2413.

[5]

FAN X M, LUO Y, FAN Q Y, et al. Reduced expression of PARK2 in manganese-exposed smelting workers[J]. Neurotoxicology, 2017, 62:258-264.

[6]

邓妍, 隋典朋, 许洁, 等.锰接触所引起全血中PARK2基因表达变化[J].遵义医学院学报, 2011, 34(6):567-569.

[7]

CHASE B A, MARKOPOULOU K. PARK2, parkin[M]//METMAN L V, KOMPOLITI K. Encyclopedia of Movement Disorders. Amsterdam: Elsevier Academic Press, 2010: 383-386.

[8]

CHANG C Y, WU G L, GAO P Y, et al. Upregulated Parkin expression protects mitochondrial homeostasis in DJ-1 konckdown cells and cells overexpressing the DJ-1 L166P mutation[J]. Mol Cell Biochem, 2014, 387(1/2):187-195.

[9]

邓宇, 徐兆发.锰的神经兴奋毒性及其机制[J].中国职业医学, 2008, 35(2):148-150.

[10]

JIANG Y M, MO X A, DU F Q, et al. Effective treatment of manganese-induced occupational Parkinsonism with p-Aminosalicylic acid:a case of 17-year follow-up study[J]. J Occup Environ Med, 2006, 48(6):644-649.

[11]

罗英, 许洁, 范希敏, 等. PARK2基因在锰致大鼠运动功能降低中的作用[J].毒理学杂志, 2016, 30(1):27-30.

[12]

ZHENG W, KIM H, ZHAO Q Q. Comparative toxicokinetics of manganese chloride and methylcyclopentadienyl manganese tricarbonyl(MMT)in sprague-dawley rats[J]. Toxicol Sci, 2000, 54(2):295-301.

[13]

TAKEDA A, SAWASHITA J, OKADA S. Biological half-lives of zinc and manganese in rat brain[J]. Brain Res, 1995, 695(1):53-58.

[14]

ROMANÍ-AUMEDES J, CANAL M, MARTÍN-FLORES N, et al. Parkin loss of function contributes to RTP801 elevation and neurodegeneration in Parkinson's disease[J]. Cell Death Dis, 2014, 5(8):e1364.

[15]

TAN Y, YU F R, PEREIRA A, et al. Suppression of Nrdp1 toxicity by Parkin in Drosophila models[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 416(1/2):18-23.

[16]

王曼, 刘晓莉.多巴胺在运动改善帕金森病学习记忆障碍中的调节作用[J].中国老年学杂志, 2016, 36(10):2542-2545.

[17]

陶冬, 邓妍, 张蓓, 等.锰对大鼠纹状体神经细胞PARK2表达的影响[J].遵义医学院学报, 2016, 39(6):588-592.

Metrics
  • PDF downloads (0)
  • Article visits (42)
  • XML Downloads (1)
  • Cited by (0)

Catalog

我国各级医疗机构对儿童用基本药物剂型和规格的需求调查

锰是维持机体正常运转的微量元素之一,也是骨骼形成的必备元素之一,参与人体内多种酶的合成。随着锰冶炼厂和锰矿开采等锰相关工业的迅速发展,以及新型有机锰如三羧基甲基环戊二烯合锰替代传统汽油抗爆剂——四乙基铅的使用,生活环境中锰浓度升高,非职业人群接触锰的机会迅速增多。长期锰接触会导致锰在人体内蓄积,导致锰中毒。锰中毒最突出的影响是神经系统损害[1],症状与帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)类似,引起大脑神经元损害。患者以运动功能失调为主的临床表现,如肢体强直、震颤、步态障碍等[2]。泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)是生物体内蛋白质选择性降解的重要途径之一,它可以清除细胞中突变、损伤和异常折叠的蛋白质,从而维持细胞内环境的稳态[3]PARK2基因的表达产物为Parkin蛋白,作为UPP途径中的重要成员,对清除沉积于机体内的错误折叠蛋白起关键作用。FAN等[4]对贵州某锰铁合金冶炼厂工人的调查研究发现,暴露组工人血浆和红细胞中的锰浓度是对照组的3.3倍和2.6倍。FAN等[5]的另一项研究结果显示,锰铁合金冶炼厂工人PARK2基因的表达随着锰在体内的蓄积量增多而减少,提示锰可能是导致神经系统损伤的原因之一。虽然许多研究致力于探索锰暴露的早期标志物,但灵敏度和特异度欠佳。本研究拟探究脱锰后大鼠全血中PARK2基因及运动和记忆功能的变化。

1   材料与方法

1.1   动物

SPF级雄性大鼠(6周龄,160~180 g),由第三军医大学实验动物中心提供,许可证号:SCXK(渝)2012-0005。

1.2   试剂和仪器

MnCl2×4H2O(生工生物,中国),Trizol试剂(Invtrogen,美国),TAKARA反转录试剂盒(TAKARA,日本),IQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad,美国)。ZB-200疲劳转棒仪(泰盟,中国),Y迷宫实验仪器(Clever Sys Inc,美国),高速低温离心机(Eppendorf,德国),Bio-Rad imark酶标仪和实时荧光定量PCR(RT-PCR)扩增仪(Bio-Rad,美国)。

1.3   分组与处理

60只健康成年雄性大鼠随机分为3组,每组20只。分别是对照组(生理盐水)、低剂量组(1 mg/kg,以体重计,后同)、高剂量组(5 mg/kg)。染锰剂量参照本课题组前期实验[6],昼夜交替各12 h,适应性喂养1周后以5 mL/kg(以体重计)体积通过腹腔注射MnCl2染毒,隔天1次,连续4周。每组随机抽取10只大鼠(染锰1个月)进行转棒和Y迷宫等行为学实验,然后用水合氯醛麻醉后取全血,石墨炉原子吸收仪检测全血中锰的质量浓度(简称“浓度”),RT-PCR法检测全血中PARK2基因表达情况。各组余下大鼠停止染锰,继续常规饲养5个月后(脱锰5个月)操作同前,用于观察动物脱锰后全血中的锰、PARK2表达情况及行为学变化。期间每月定时对大鼠进行乙醚麻醉后取内眦静脉血,动态检测血液中PARK2表达变化。

1.4   血锰浓度的检测

取500 μL血液于离心管中,加入800 μL浓HNO3溶液室温硝化至澄清,将硝化的样品加热至干燥,最后加入1%的稀HNO3溶液定容至50 mL,将所有样品在原子吸收标准曲线内适当稀释,石墨炉原子吸收法中Mn2+的检出下限为0.1 ng/mL。

1.5   转棒实验和Y迷宫实验

转棒实验用于测试大鼠的运动协调能力。转棒距离=转棒直径×转棒速度,平均速度=转棒距离/转棒时间,转棒时间即老鼠从站上棒开始跑步到跌落下来的时间,大鼠刚上棒速度为6转/min,之后以6转/min递增。转棒距离和转棒速度可作为反映大鼠运动功能的指标。Y迷宫由三条等长、夹角120°的臂组成,用于测试大鼠的学习和记忆能力。记录大鼠进入各支臂的次数,连续3次均进入不同的臂为一次正确的交替数,交替率=[正确的交替次数(/进入臂的总次数-2)] × 100%。

1.6   RT-PCR法检测PARK2表达

采血后立即加600 μL Trizol液混匀置于冰上保存,防治溶血,再加入120 μL三氯甲烷,混匀后离心(15 294× g,10 min,4℃),取上层清液加入200 μL异丙醇后混匀,离心(15 294× g,10 min,4℃),提取总RNA,加入75%乙醇洗脱有机相,最后将提出的RNA溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)水中,测量RNA浓度(D260/D280值在1.8~2.0之间可认为RNA纯度较佳)。用TAKARA反转录试剂盒将提取的总RNA反转成cDNA,后进行RT-PCR反应。RT-PCR反应体系:IQ SYBR Green Supermix 7.5 μL,正向引物(10 μmol/L)和反向引物(10 μmol/L)混合液0.5 μL,模板3 μL,DEPC水4 μL。反应条件为95℃ 3min,95℃ 10 s,60℃ 45 s,40个循环。引物序列见表 1

表1

PARK2β-actin引物序列

1.7   统计学分析

数据录入SPSS 18.0进行统计分析。计量结果以x± s表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用Bonferroni校正。交替率采用χ2 检验。同一变量重复测量采用双因素重复测量方差分析。相关分析采用皮尔森相关分析。检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   脱锰后全血锰浓度变化

与染锰1个月时相比,脱锰5个月后高剂量组大鼠血锰浓度降低(t=7.89,P < 0.05)。染锰1个月时各剂量组大鼠血锰浓度差异均有统计学意义(F=70.28,P < 0.05)。脱锰5个月后,仅高剂量组与对照组大鼠血锰浓度差异有统计学意义(P < 0.05)(见表 2)。

表2

染锰和脱锰大鼠血锰浓度比较(xs, mg/L, n=10)

2.2   脱锰后大鼠行为学实验结果

转棒实验发现,染锰1个月和脱锰5个月时高剂量组大鼠转棒距离间的差异有统计学意义(t=-4.27,P < 0.05)。染锰1个月时,对照组、低剂量组及高剂量组大鼠转棒距离间的差异有统计学意义(F=10.86,P < 0.05),高剂量组大于对照组(P < 0.05)。脱锰5个月后,对照组、低剂量组及高剂量组大鼠转棒距离间差异无统计学意义(F=1.752,P=0.19)(见表 3)。Y迷宫实验中,染锰和脱锰时,对照组大鼠与各染锰组大鼠交替率差异均无统计学意义(P > 0.05)(见表 3)。

表3

染猛和脱猛大鼠的转棒时间、平均速度、转棒距离及Y迷宫交替率比较(x±s, n=10)

2.3   大鼠全血PARK2表达水平

各组大鼠全血PARK2表达在染锰1个月和脱锰1~5个月各时间点上的差异有统计学意义(F=12.53,P < 0.001),时间和分组无交互效应(F=1.62,P=0.21)。对染锰1个月和脱锰1~5个月各组大鼠全血PARK2表达进行两两比较发现:染锰1个月后,各组间大鼠全血PARK2表达差异有统计学意义(P < 0.05);脱锰后各时间点上各组大鼠全血PARK2表达差异均无统计学意义(P> 0.05)(见图 1)。

图 1

染锰和脱锰大鼠PARK2基因表达变化

2.4   大鼠血锰浓度与各指标的相关分析

染锰1个月时,大鼠全血锰浓度与转棒距离、全血PARK2表达均呈负相关(r=-0.74,P < 0.01;r=-0.57,P=0.03),全血PARK2表达与转棒距离呈正相关(r=0.61,P=0.02)。脱锰5个月后,各剂量组转棒距离及全血PARK2表达与锰浓度无相关关系(P>0.05)。

3   讨论

PARK2基因表达Parkin蛋白,Parkin蛋白是UPP中的一种关键酶,参与了蛋白质的降解,避免异常蛋白在细胞内蓄积形成蛋白聚集体和路易小体,从而保护神经细胞[7]。此外,Parkin蛋白还能泛素化细胞内异常折叠蛋白,促进其水解[8],从而起到对神经细胞的保护作用。近年来,老年特发性PD的发病率明显增高。研究表明,环境锰暴露与老年特发性PD之间存在正相关关系[9]。流行病学研究发现锰暴露是PD发病的主要环境危险因素之一,锰接触可以使PD的发病年龄提前,职业接触工人锰中毒后期也会出现帕金森样症状[10],一旦出现运动障碍,便不可逆转。本研究通过大鼠锰中毒模型,探究大鼠在脱锰后运动与记忆功能能否逆转以及PARK2基因表达的变化情况。

本研究发现:高剂量染锰组大鼠全血PARK2基因表达比对照组、低剂量染锰组低;大鼠血锰水平随着染锰剂量增加而上升,与转棒距离、全血PARK2表达呈负相关;全血PARK2表达与转棒距离呈正相关。罗英等[11]也发现染锰组大鼠血锰浓度上升,PARK2表达下降,运动功能受损;脱锰后各组间全血PARK2表达无差异,脱锰5个月后染锰组大鼠全血锰浓度较染锰1个月时下降。ZHENG等[12]通过对成年SD雄性健康大鼠静脉注射MnCl2发现,锰在血浆内的半衰期为1.8 h,血浆锰浓度在12 h后恢复至正常水平。然而TAKEDA等[13]通过放射自显影技术显示,锰在各脑区持续存在,锰可通过血-脑屏障和血-脑脊液屏障进入脑组织,进入脑内的锰通过螯合作用缓慢排出大脑。ROMANÍ-AUMEDES等[14]研究发现,在特发性PD中,Parkin蛋白功能缺失会导致多巴胺能神经元细胞死亡。TAN等[15]研究发现,在果蝇中共表达人类Parkin蛋白可以抑制果蝇dNrdp1过表达产生的毒性,dNrdp1可导致大脑中多巴胺能神经元丧失,而多巴胺能神经元变性死亡是PD的主要特征[16]。陶冬等[17]研究发现,Parkin在抵抗锰导致的神经毒性作用中发挥了关键作用。本研究发现染锰1个月时大鼠全血PARK2表达下调,运动功能下降,可能原因是锰暴露导致PARK2表达下调,引起UPP异常,从而导致神经毒性。

本研究发现脱离锰染毒后,大鼠血锰浓度下降,PARK2表达上升,运动功能损伤得到恢复。因此,本研究推测PARK2可作为判断锰致运动功能损伤的参考指标,其具体机制仍需进一步研究。今后可通过锰致线粒体自噬的研究,进一步明确PARK2与锰暴露的关系。

《环境与职业医学》杂志官方网站

Export file

Format

Content