越来越多的研究证明, 环境污染是引起人类男性生殖能力下降的主要原因之一, 有机污染物是可能的重要因素^[1]。水体有机物污染对生殖健康的危害已成为目前公众关注的社会热点问题。我国主要河流有机物污染严重, 流经城市的河段普遍受到污染^[2]。在我国长江、松花江、珠江、太湖和东湖等主要河流与湖泊均检测到多种有机污染物, 其中包括邻苯二甲酸酯类和多环芳烃等优先控制的有机污染物^[3-4]。水中有机提取物的毒性研究^[5-6]表明, 活性氧(reactive oxygen species, ROS)可能是各种有机污染物毒作用的使动因素, 且ROS通过增强生殖细胞凋亡引起精子数下降, ROS对DNA造成的损伤能够导致精子形态异常和精子数下降。水源水中有机提取物对机体DNA有确定的损伤作用^[7], 国外的同类研究也得到相一致的结果^[8]。

黄河流经包头南郊, 是包头居民饮用水主要水源。包头是内蒙古西北部的一个以稀土、钢铁和铝生产为特色的重工业城市。随着国家西部大开发政策的实施, 包头市在能源、冶金、机械制造、电力等方面的发展得到了成倍的增长, 由此带来的工业污水排放量明显增加, 可能导致河水有机物污染加重。此外, 黄河包头段位邻河套平原下游, 河套平原是我国粮食生产基地, 大面积农业种植施用的有机肥料和喷洒的农药经雨水进入黄河水流, 成为黄河水有机物污染的另一重要来源。但截至目前, 黄河包头段河流有机物污染对生殖系统的影响尚未见报道。

因此, 本研究提取黄河包头段水源水中有机污染物, 对雄性大鼠原代生殖细胞进行染毒, 研究黄河包头段水源水有机提取物对雄性大鼠原代生殖细胞的毒性, 并初步探讨其作用机制。

DMEM/F12培养液(SH30023, 郑州宝信有限公司, 中国), 二甲基亚砜(分析纯, 天津市凯通化学试剂有限公司, 中国), MTT(BY12054, SECOMA, 美国), Ⅰ型胶原酶(Sigma, 美国), 胰蛋白酶(上海Difco公司, 中国), A020-2乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、A001-3超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、总抗氧化物能力(T-AOC)试剂盒、A003-1丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所, 中国)。

超净工作台(VL-4S, 珠海市再鑫仪器有限公司, 中国), 倒置显微镜(DMIL, 徕卡, 德国), 低速大容量离心机(TDL-5, 上海安亭科学仪器厂, 中国), 细胞培养板(6T, 上海斯信生物科技有限公司, 中国), 细胞过滤筛(40 μm, 北京索莱宝科技有限公司, 中国), 电热恒温水浴锅(HH.S21-Ni4, 北京三二八科学仪器有限公司, 中国), 全自动酶标分析仪(SIAFRTD, 伯腾, 美国), 电热蒸汽压力消毒锅(TX400Z, 上海三申医疗器械有限公司, 中国), 树脂柱(XAD-2, 北京朋利驰科技有限公司, 中国)。

于2017年7月3日至21日(丰水期)在黄河包头段上游断面、下游断面水面以下0.5 m处采集水样, 分6次取水, 每次间隔3 d, 合计取水6 000 L, 水样采集入白铁桶。同时以相同的采样时间间隔和采样次数采集包头市自来水末梢水水样。将水样运回实验室进行泥沙沉淀处理, 水样静置过夜沉淀水中杂质。

黄河水及自来水水样经过XAD-2树脂柱富集、洗脱、洗脱液挥干、浓缩有机提取物及有机提取物溶解定容, 1 mL有机物提取液来源于不同体积(1 000、100、10 mL)的原水, 将提取液置于负20℃冰箱保存, 待细胞染毒。

大鼠支持-生精细胞的提取和体外共培养参考李宏霞等^[9]、ADHIKARI等^[10]的方法, 具体步骤如下：4周龄SD雄性大鼠5只(每次1只, 重复实验5次), 体重100 g左右, 颈椎脱臼处死, 用75%酒精浸泡5 min, 剪开腹部皮肤, 暴露腹腔。取出双侧睾丸, 浸于培养皿中的D-Hank’s液里, 用镊子及剪刀小心剥去睾丸表面的白膜及脂肪垫, 剥离小血管。将睾丸组织剪碎成约1 mm³大小, 移液枪反复吹打1~2 min, 使曲精小管充分散开, 静置2~3 min, 待曲精小管下沉后, 弃上清, 重复上述吹打、静置操作2~3次。加入10 mL的Ⅰ型胶原酶, 置于37℃恒温培养箱中消化15 min。待曲精小管消化成小片段状时, 加入适量D-Hank’s液吹打, 清洗2次, 去除间质组织。加入3 mL 0.25%含EDTA的胰蛋白酶, 置于37℃孵育箱中消化5 min, 收集浮松状态的生精小管于15 mL离心管中, 加入含10%FBS的DMEM/F12的培养液至15 mL, 以终止消化, 反复将其吹打成单细胞混悬液。经40 μm滤网过滤后, 1 000 r/min离心5 min(离心半径17.5 cm), 弃上清。用含10%FBS的DMEM/F12培养液重悬细胞, 置于培养瓶中, 于37℃培养箱中培养。

细胞培养24 h后进行染毒, 用自来水、黄河上游水源水、下游水源水(高、中、低剂量染毒组的染毒剂量分别为1000、100、10 mL/mL, 即高、中、低剂量1 mL有机物提取液分别来源于1000、100、10 mL原水样)进行染毒, 对照组给予相同体积的PBS液。染毒24 h后, 用MTT法检测细胞增殖率, 透射电镜检测细胞凋亡情况, 微板法检测LDH、T-AOC和SOD活性、MDA浓度。检测方法按试剂盒说明进行操作。

实验数据均以x±s表示。采用SPSS 19.0软件进行统计学分析, 多组比较采用方差齐性检验和单因素方差分析。两两比较采用Dunnett-t检验(方差齐), 或Games-Howell检验(方差不齐)。检验水准α=0.05。

与对照组比较, 自来水和黄河上游、下游水源水有机物高、中剂量染毒组生殖细胞增殖率均降低(P < 0.05)。在高剂量染毒条件下, 自来水组的细胞增殖率低于黄河上游水源水组(P < 0.05)。见表 1。

对照组细胞外形规则, 有长度不同的胞质突起, 染色质均匀细密, 胞核清晰, 线粒体呈椭圆形或杆状内嵴结构正常, 并含有丰富的核糖体、内质网、初级和次级溶酶体等细胞器。自来水和黄河上游、下游水源水低剂量组与对照组比较, 细胞超微结构未见明显改变；中剂量组细胞胞核固缩, 核膜腔扩张, 染色质浓缩、聚集成块, 有部分线粒体空化变性, 次级溶酶体较多, 细胞表面的微绒毛突起明显减少, 凋亡细胞多见；高剂量组染色质边集、核碎裂和一些染色质块在膜散射, 线粒体空化变性, 核糖体、内质网、溶酶体等细胞器减少, 细胞器结构多不完整, 凋亡细胞较多见, 自来水高剂量组可见坏死细胞。见图 1。

黄河上、下游水源水高、中剂量染毒组生殖细胞T-AOC水平、SOD活性均低于对照组, MDA浓度高于对照组(P < 0.05)；在高剂量染毒条件下, 自来水组SOD活性明显低于上游水源水组, MDA浓度高于上游水源水组(P < 0.05)。

与对照组比较, 黄河下游水源水及自来水高、中剂量染毒组生殖细胞LDH活性均升高(P < 0.05)；黄河上游水源水高剂量染毒组LDH活性高于对照组(P < 0.05)；自来水高剂量组LDH活性高于黄河上游水源水高剂量组LDH活性(P < 0.05)。见表 1。

睾丸中发育的生精细胞与体细胞间的复杂关系, 使探究毒物的生殖毒性及其作用机理变得困难。分离的生精细胞在体外不能分化到后期, 且只能培养24~48 h, 此后其存活率进行性下降。由于睾丸组织的精原细胞与支持细胞紧密作用, 支持细胞可分泌许多细胞因子来调控生殖细胞的生存、增殖和分化。有研究显示, 建立大鼠支持细胞和生殖细胞共培养体系, 可在不添加任何细胞因子的条件下, 使生精细胞和支持细胞在体外长期共生。这一研究结果表明, 在这种体外共培养体系中, 由支持细胞产生的微环境足以维持生精细胞的增殖和分化。这一培养体系的建立可为毒理学领域化学物质生殖毒性及毒作用机制的研究提供体外培养的依据。本研究参考李宏霞等^[9]、ADHIKARI等^[10]的方法从大鼠睾丸组织中经过胰酶和胶原酶消化后分离出支持细胞和生精细胞进行培养, 建立大鼠支持-生精细胞体外共培养体系, 探讨黄河包头段水源水及自来水有机提取物对雄性大鼠原代生殖细胞增殖和凋亡的影响。

本研究结果显示, 在体外培养的大鼠原代生殖细胞有机物染毒模型中, 黄河上游水源水、下游水源水、自来水中有机物中、高剂量染毒组细胞增殖率均下降, 在高剂量染毒条件下, 自来水组的细胞增殖率低于黄河上游水源水组。以上结果说明, 一定剂量的黄河上游水源水、下游水源水、自来水中有机物能够抑制大鼠原代生殖细胞增殖。

睾丸生殖细胞在分化过程中存在自发性和诱发性细胞凋亡, 细胞凋亡是限制生精上皮中生殖细胞数的主要方式, 据估计, 约有3/4的生殖细胞通过主动的凋亡而丢失^[11]。若没有严格的调控机制, 生殖细胞将快速增长并超出支持细胞的承受能力, 或者生殖细胞过度凋亡而使精子数量下降, 都将导致生殖功能障碍。大量证据已表明, 诱导睾丸生殖细胞凋亡是有害因素引起生殖毒性的重要机制。一些外源有害因素通过诱导生殖细胞凋亡而破坏睾丸中细胞增殖与凋亡之间的平衡, 导致生殖功能障碍。本研究结果表明, 黄河上游、下游水源水和自来水有机物中、高剂量组均可诱导大鼠原代生殖细胞凋亡, 提示细胞凋亡可能是水中有机物抑制细胞生长的主要途径。

氧化损伤可能是各种有机污染物毒作用的使动因素, 且能够导致精子形态异常和精子数下降^{[4, 6]}。SOD能清除超阴离子自由基, 保护细胞, 并及时修复受损细胞, 其活性可以间接反映机体抗氧化损伤的能力^[12]。T-AOC是衡量抗氧化系统功能状况的综合性指标, 其大小可反映抗氧化酶系统和非酶促系统对外来刺激的代偿能力^[13]。本研究结果显示, 自来水和黄河上游、下游水源水高、中剂量组T-AOC水平、SOD活性均低于对照组, 即黄河上游水源水、下游水源水、自来水中有机物均可降低体外培养的生殖细胞的抗氧化能力。

MDA为脂质过氧化反应的稳定代谢产物, 可直接反映脂质过氧化反应程度, 同时可间接反映细胞氧化损伤程度^[14]。本研究结果显示, 自来水和黄河上游、下游水源水高、中剂量组MDA浓度高于对照组, 表明黄河上游水源水、下游水源水、自来水中有机物均可引起大鼠原代生殖细胞氧化损伤。脂质过氧化反应是引起细胞膜受损的主要机制之一, 这与本研究LDH活性升高、细胞膜受损的结果是一致的。在高剂量染毒条件下, 自来水组SOD活性低于上游水源水组, MDA浓度高于上游水源水组。这可能是因为自来水中加入了用于消毒的氯化物, 氯化物可能会影响自来水中的有机物, 增加有机物对生殖细胞的氧化损伤^[15]。

LDH是活细胞的胞浆酶之一, 在正常情况下LDH不能透过细胞膜渗漏到细胞培养液中, 但当细胞膜受损时则可释放到细胞外, 培养液中LDH的活性与细胞膜的损伤程度成正比。因此, 可通过检测细胞培养液中LDH活性, 来判断细胞膜受损的程度^[12]。本研究结果显示, 高剂量染毒条件下, 黄河上游水源水、下游水源水、自来水中有机物均可以导致体外培养的大鼠原代生殖细胞LDH活性增加, 说明高剂量黄河上游水源水、下游水源水、自来水中有机物均可引起体外培养的大鼠原代生殖细胞膜受损。本研究还发现, 高剂量自来水有机物对生殖细胞膜的损伤程度强于上游水源水有机物对生殖细胞膜的损伤程度。分析其可能的原因是自来水中加入了消毒用的氯化物, 氯化物可能会加强有机物对生殖细胞膜的损伤^[15]。

综上所述, 一定剂量的黄河上游水源水、下游水源水有机物能够诱导雄性大鼠原代生殖细胞凋亡, 抑制细胞增殖, 氧化损伤可能是其作用机制之一。