2021, 38(3):288-293.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2021.20444
苯并[a] 芘（benzo[a] pyrene，BaP）是广泛存在的一类环境污染物，主要来源于化石燃料和有机物的不完全燃烧[1]。除“三致”作用外，BaP可通过血- 脑屏障及嗅神经进入脑组织，损害中枢神经系统，引起认知障碍[2-3]，但作用机制尚不十分清楚。
认知功能与突触结构可塑性密切相关[4]。突触前膜的突触素（synaptophysin，SYP）和突触后膜的突触后致密物质95（post-synaptic dense protein-95，PSD95）在维持突触结构，参与突触囊泡的转运和释放，调控突触后膜稳定性及突触可塑性中起关键作用[5]。促红细胞生成素产生肝细胞受体（erythropoietin-producing hepatocyte receptors，Ephs）是目前已知最大的受体酪氨酸激酶（receptors protein tyrosine kinase，RTK）家族中重要的成员之一[6]，分为EphA和EphB两类。EphA受体通过与邻近细胞膜上的Ephrin配体结合进行双向信号转导，调控神经元轴突的定向延伸，调节突触结构，改变突触效能和神经元发生，进而影响学习记忆功能[7]。本研究探讨在BaP致小鼠认知障碍中突触相关蛋白和EphA及其配体蛋白表达的改变，为BaP神经毒性的研究提供科学依据。
BaP（纯度 > 97%，Sigma，美国），EphA4抗体（货号：21875-1-AP，BBI Life Science，中国），SYP（货号：D198927，BBI Life Science，中国），BCA法蛋白质浓度测定试剂盒、SDS-PAGE变性丙烯酰胺凝胶快速制备试剂盒（BBI Life Science，中国），EphrinA5抗体（货号：SC-81945，Satan，中国），EphA5抗体（货号：A14238，ABclone，中国），PSD95抗体（货号：20666-1-AP，Proteintench，中国），β-actin抗体（货号：BM0627，Boster，中国）、超敏ECL化学发光即用型底物（Boster，中国）。化学发光成像仪（Boygene Chemilmage Software，中国）。
40只SPF级健康成年雄性ICR小鼠（8周龄，体重18~22 g）购买于北京兴旺养殖场，许可证号：SCXK（京）2014-0013，在动物房（自然节律采光，室温为18~23℃，湿度为40%~70%）适应性喂养1周后，随机分成4组，每组10只，分别为溶剂对照组（植物油）和BaP低、中、高剂量染毒组。小鼠腹腔注射BaP的最低致死剂量为500 mg·kg-1，按照最低致死剂量的1/1 000、1/250和1/50，设置染毒剂量为0.5、2和10 mg·kg-1，染毒体积为2.5 mL·g-1，隔天1次，共染毒30次，持续60 d。对照组注射等体积植物油。相应进入小鼠体内BaP的量分别为1.5、6和30 mg·kg-1，折算成人体剂量分别为15、60和300 μg·kg-1（除以不确定系数100）。该剂量范围恰好涵盖了职业人群通过呼吸道接触BaP的量（约61.2μg·kg-1· 年-1）。
染毒期间，每天观察小鼠的神经系统症状，记录其饮水量、饮食量，每周称量体重。染毒结束第2天采用旷场实验对小鼠的空间学习记忆能力和探索能力进行检测。动物的所有操作和处理均严格遵循山西医科大学和国家有关实验动物管理和使用的有关规定，本研究已获斯贝福（北京）生物技术有限公司实验动物伦理委员会审批（编号：2020/10/8）。
旷场实验采用40 cm×40 cm×40 cm的木制实验箱，设置中心大小为25 cm×25 cm，在安静的环境下进行实验，抓取动物时动作轻柔，将动物放入箱内，同时进行摄像和计时（5 min），利用图像分析采集系统（Smart v3.0）记录小鼠的运动轨迹。观察指标有中心区停留时间和站立次数。
行为学实验结束后的第2天，将小鼠用水合氯醛麻醉，颈椎脱臼处死，并立即分离大脑皮质，-80℃冻存。称取30 mg大脑皮质加入RIPA裂解液，冰浴上超声波破碎组织，室温放置30 min后，经4℃、12 000×g离心15min，取上清液蛋白定量、变性。经10% 的SDSPAGE变性丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移蛋白至PVDF膜，5% 脱脂奶粉室温封闭2h，EphA4（1∶ 1000）、EphA5（1∶ 1000）、EphrinA5（1∶ 50）、PSD95（1∶ 1000）、SYP（1∶ 1 000）和β-actin（1∶ 2 000）等一抗孵育过夜，PBST漂洗3次后，二抗室温孵育40 min，PBST漂洗3次，超敏ECL发光检测系统检测EphA4、EphA5、EphrinA5、SYP、PSD95和内参β-actin的蛋白表达水平，Boygene Chemilmage Software凝胶成像仪拍照，并利用Image J 1.8.0软件分析结果。
所有实验数据均以
随着染毒剂量的增加和时间的延长，与溶剂对照组相比，0.5 mg·kg-1 BaP组小鼠进食和饮水量接近，而2 mg·kg-1和10 mg·kg-1 BaP组小鼠进食和饮水量逐渐减少，以10 mg·kg-1 BaP组减少较为明显。与溶剂对照组相比，0.5 mg·kg-1 BaP和2 mg·kg-1 BaP组小鼠有中枢神经功能轻度兴奋的表现，主要为易激惹，好斗、打架次数明显增多，而10 mg·kg-1 BaP组小鼠明显受抑制，出现精神萎靡、情绪低落、活动减少、反应迟钝，毛发光泽度降低、干枯易脱落等现象。
染毒结束后，各染毒组小鼠体重增重呈剂量依赖性降低。与溶剂对照组相比，10 mg·kg-1 BaP组小鼠平均体重增重减少5.78 g（P < 0.05）；与0.5 mg·kg-1 BaP组相比，2、10 mg·kg-1 BaP组小鼠体重增重依次降低4.43 g、7.54g（P < 0.05）。见表 1。
小鼠染毒前后体重变化（
Changes in body weight of mice before and after exposure (
与溶剂对照组比较，10 mg·kg-1 BaP组的小鼠在中心区停留的平均时间延长了34.42 s，而后肢站立次数减少了21.57次（P < 0.05）。见图 1。
BaP染毒对小鼠空间探索能力的影响（n=10）
Figure1.The effects of BaP exposure on the spatial exploration ability of mice (n=10)
随着BaP染毒剂量的增加，小鼠大脑皮质SYP和PSD95蛋白表达量降低。与溶剂对照组比较，2、10 mg·kg-1组SYP蛋白表达量分别降低19.9% 和32.2%（P < 0.05）；10 mg·kg-1组SYP蛋白表达量较0.5 mg·kg-1组下降23.8%，较2 mg·kg-1下降12.3%（P < 0.05）。与溶剂对照组比较，0.5、2、10 mg·kg-1 BaP组PSD95蛋白表达量分别降低8.4%、23.7%、34.8%（P < 0.05）；与0.5 mg·kg-1比较，2、10 mg·kg-1 BaP组PSD95蛋白表达量降低15.3%、26.4%（P < 0.05）。见图 2。
BaP染毒小鼠大脑皮质PSD95、SYP蛋白表达（n=10）
Figure2.Expressions of PSD95 and SYP proteins in cerebral cortex of mice exposed to BaP (n=10)
与相应的溶剂对照组比较，2、10 mg·kg-1 BaP染毒组小鼠皮质EphA4蛋白表达水平分别升高47.1%、41.3%，2、10mg·kg-1 BaP染毒组小鼠皮质EphA5蛋白表达水平分别升高31.0%、40.0%（均P < 0.05），10 mg·kg-1 BaP染毒组EphrinA5蛋白表达水平下降14.9%（P < 0.05）。见图 3。
BaP染毒小鼠大脑皮质EphA4、EphA5和EphrinA5蛋白表达（n=10）
Figure3.Expressions of EphA4, EphA5, and EphrinA5 in the cerebral cortex of mice exposed to BaP (n=10)
BaP具有神经毒性，可引起职业人群和啮齿类动物的认知功能下降和自主神经功能紊乱[8-9]。本研究旷场实验以及前期水迷宫研究结果[10]显示，BaP染毒可引起小鼠学习记忆能力下降，与已有研究结果一致[11-12]。蛋白印迹结果表明，大脑皮质突触相关蛋白SYP、PSD95的表达逐渐降低，EphA4和EphA5表达升高，EphrinA5表达降低，提示突触相关蛋白和EphA/EphrinA可能在BaP致小鼠认知功能障碍中起重要作用，这为BaP神经毒性的研究提供了新的科学依据。
认知功能与神经突触的可塑性相关[13]。突触连接是学习记忆的关键部位[14]，由突触前膜、突触后膜和突触间隙组成。位于突触前膜的SYP是突触前膜的一种糖蛋白，与囊泡释放、突触可塑性密切相关[15-16]。PSD95是位于突触后致密区的支架蛋白，能接受突触信号并传递到突触后膜上，在突触重塑、介导及整合突触信号传递等方面发挥重要作用[17]。SYP与PSD95在突触连接中起到了上下贯通的“桥梁”作用，常常作为反映突触传递效能和突触重建的特异性标志物[18]。本研究结果表明，BaP染毒小鼠大脑皮质SYP、PSD95蛋白表达量降低。研究发现在阿尔茨海默病小鼠学习记忆能力下降模型中，神经突触密度减少，伴有SYP蛋白表达减少[19]，增加SYP和PSD95表达可提高突触可塑性，改善认知功能。PSD95参与新突触的形成，PSD95的表达降低，能调控LTP，导致大鼠轻度认知功能损伤[20]。未见SYP、PSD95与BaP的相关报道，但有文献表明，BaP可引起大鼠海马突触结构异常和突触相关蛋白-25堆积[21]。老年痴呆患者外周血中突触相关蛋白-25含量与大脑突触结构受损和认知功能下降有关[22]。以上结果提示BaP染毒小鼠大脑的突触囊泡转运能力减弱，突触后致密物变薄，进而影响神经信息的储存、加工和传递，这可能是BaP引起小鼠认知功能障碍的作用机制之一。
Eph家族蛋白包括Eph受体与Ephrin配体，主要在中枢神经系统中表达，以受体配体结合的方式，双向调节突触信号传递与神经元形态发生，参与学习记忆等神经功能[23-24]。目前报道最多的受体是EphA4和EphA5，EphA4主要与神经系统的损伤和病变有关，EphA4激活或缺失能影响轴突出芽、树突棘的收缩，使树突棘形态结构改变[25-26]，EphA4基因敲除小鼠出现短期空间记忆受损[27]。EphA5主要参与树突棘的形成，EphA5基因敲除小鼠大脑皮层会出现树突棘形态异常且神经元异常聚集[28]。Gerlai等[29]发现使用EphA5受体拮抗剂/激动剂能够损害/改善小鼠空间记忆。EphA4/A5均能与EphrinA5配体结合，激活N- 甲基-D- 天冬氨酸受体与PSD95在突触表面形成复合体，促进小鼠树突棘成熟[30]。尚未见BaP与EphA蛋白异常的相关研究报道。本研究发现，随着BaP染毒剂量的升高，小鼠EphA4、EphA5受体蛋白表达量增加，EphrinA5配体蛋白表达量下降，导致EphA4/A5受体与EphrinA5配体失衡，使突触的形态和功能受损，这可能与BaP引起的小鼠认知功能障碍有关。
综上所述，BaP致小鼠学习记忆能力下降，大脑皮质突触相关蛋白SYP、PSD95表达量逐渐下降，EphA4/A5和EphrinA5蛋白表达失衡，推测BaP可能通过影响EphA/EphrinA5蛋白表达，使突触功能受损，导致小鼠认知功能障碍，具体的调控机制尚需进一步研究。
表1 小鼠染毒前后体重变化（
Changes in body weight of mice before and after exposure (
图 1 BaP染毒对小鼠空间探索能力的影响（n=10）
Figure 1The effects of BaP exposure on the spatial exploration ability of mice (n=10)
图 2 BaP染毒小鼠大脑皮质PSD95、SYP蛋白表达（n=10）
Figure 2Expressions of PSD95 and SYP proteins in cerebral cortex of mice exposed to BaP (n=10)
图 3 BaP染毒小鼠大脑皮质EphA4、EphA5和EphrinA5蛋白表达（n=10）
Figure 3Expressions of EphA4, EphA5, and EphrinA5 in the cerebral cortex of mice exposed to BaP (n=10)
| [1] |
JOHNSON B L. ATSDR's information databases to support human health risk assessment of hazardous substances[J]. Toxicol Lett, 1995, 79(1/2/3): 11-16. |
| [2] |
NIU Q, ZHANG H, LI X, et al. Benzo[a] pyrene-induced neurobehavioral function and neurotransmitter alterations in coke oven workers[J]. Occup Environ Med, 2010, 67(7): 444-448. DOI: 10.1136/oem.2009.047969 |
| [3] |
ZHANG H M, NIE J S, WANG F, et al. Effects of benzo[a] pyrene on autonomic nervous system of coke oven workers[J]. J Occup Health, 2008, 50(4): 308-316. DOI: 10.1539/joh.L7155 |
| [4] |
BAILEY CH, KANDEL ER, HARRIS KM. Structural components of synaptic plasticity and memory consolidation[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2015, 7(7): a021758. DOI: 10.1101/cshperspect.a021758 |
| [5] |
WANG XY, ZHOU HR, WANG S, et al. NR2B-Tyr phosphorylation regulates synaptic plasticity in central sensitization in a chronic migraine rat model[J]. J Headache Pain, 2018, 19(1): 102. DOI: 10.1186/s10194-018-0935-2 |
| [6] |
WAN Y, YANG J S, XU L C, et al. Roles of Eph/ephrin bidirectional signaling during injury and recovery of the central nervous system[J]. Neural Regen Res, 2018, 13(8): 1313-1321. DOI: 10.4103/1673-5374.235217 |
| [7] |
KANIA A, KLEIN R. Mechanisms of ephrin-Eph signalling in development, physiology and disease[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2016, 17(4): 240-256. DOI: 10.1038/nrm.2015.16 |
| [8] |
李欢, 孙敏, 曹晶晶, 等. 苯并[a] 芘致小鼠认知功能障碍及脑细胞中microRNA的表达[J]. 环境与健康杂志, 2019, 36(4): 320-323. |
| [8] |
LI H, SUN M, CAO J J, et al. B[a] P-induced cognitive impairment and microRNA expression in brain cells of mice[J]. J Environ Health, 2019, 36(4): 320-323. |
| [9] |
CHEN C, TANG Y, JIANG X, et al. Early postnatal benzo (a) pyrene exposure in Sprague-Dawley rats causes persistent neurobehavioral impairments that emerge postnatally and continue into adolescence and adulthood[J]. Toxicol Sci, 2012, 125(1): 248-261. DOI: 10.1093/toxsci/kfr265 |
| [10] |
TANG Q, XIA Y Y, CHENG S Q, et al. Modulation of behavior and glutamate receptor mRNA expression in rats after subchronic administration of benzo (a) pyrene[J]. Biomed Environ Sci, 2011, 24(4): 408-414. |
| [11] |
李金艳, 常珊珊, 袁晋峰, 等. 亚慢性染毒B[a]P与大鼠海马细胞凋亡及学习记忆损伤的关系[J]. 环境与职业医学, 2012, 29(2): 118-121. |
| [11] |
LI J Y, CHANG S S, YUAN J F, et al. Correlation of subchronic exposure to benzo[a] pyrene with apoptosis of hippocampal neurocytes and impairment of learning and memory in rats[J]. J Environ Occup Med, 2012, 29(2): 118-121. |
| [12] |
曹晶晶. BDNF基因甲基化修饰在苯并[a] 芘致小鼠认知功能障碍中的作用及阿司匹林的干预研究[D]. 太原: 山西医科大学, 2018. |
| [12] |
CAO J J. Role of methylation of BDNF gene methylation in benzo[a] pyrene-induced cognitive impairment and its intervention of aspirin in mice[D]. Taiyuan: Shanxi Medical University, 2018. |
| [13] |
RAVEN F, VAN DER ZEE E A, MEERLO P, et al. The role of sleep in regulating structural plasticity and synaptic strength: implications for memory and cognitive function[J]. Sleep Med Rev, 2018, 39: 3-11. DOI: 10.1016/j.smrv.2017.05.002 |
| [14] |
GALVAN V, BREDESEN D E. Neurogenesis in the adult brain: implications for alzheimers disease[J]. CNS Neurol Disord Drug Targets, 2007, 6(5): 303-310. DOI: 10.2174/187152707783220938 |
| [15] |
ZHU X, WANG P, LIU H, et al. Changes and significance of SYP and GAP-43 expression in the hippocampus of CIH rats[J]. Int J Med Sci, 2019, 16(3): 394-402. DOI: 10.7150/ijms.28359 |
| [16] |
HORIKAWA H P, KNEUSSEL M, EL FAR O, et al. Interaction of synaptophysin with the AP-1 adaptor protein γ-adaptin[J]. Mol Cell Neurosci, 2002, 21(3): 454-462. DOI: 10.1006/mcne.2002.1191 |
| [17] |
BUSTOS F J, AMPUERO E, JURY N, et al. Epigenetic editing of the Dlg4/PSD95 gene improves cognition in aged and Alzheimer's disease mice[J]. Brain, 2017, 140(12): 3252-3268. DOI: 10.1093/brain/awx272 |
| [18] |
刘炜, 刘丽星, 史晓伟, 等. 三七总皂苷对局灶性脑缺血大鼠不同恢复时点神经重塑和突触重建的影响[J]. 中华中医药杂志, 2015, 30(5): 1556-1559. |
| [18] |
LIU W, LIU L X, SHI X W, et al. Influence of Panax Notoginseng Saponins on neuronal plasticity and synaptic reorganization of rats with focal cerebral infarction in different recovery timing[J]. China J Tradit Chin Med Pharm, 2015, 30(5): 1556-1559. |
| [19] |
姚柏春, 邓兆宏, 孙天敏, 等. Aβ1~40诱导大鼠海马突触体素和突触数量的变化[J]. 中国现代医学杂志, 2007(2): 153-156. DOI: 10.3969/j.issn.1005-8982.2007.02.007 |
| [19] |
YAO B C, DENG Z H, SUN T M, et al. Effect of Aβ1-40 on expression of synaptophysin and synaptic number of hippocampal neurons in rat after injection of β-amyloid protein 1-40 into hippocampus[J]. Chin J Mod Med, 2007(2): 153-156. DOI: 10.3969/j.issn.1005-8982.2007.02.007 |
| [20] |
WANG D, LI B, WU Y, et al. The effects of maternal atrazine exposure and swimming training on spatial learning memory and hippocampal morphology in offspring male rats via PSD95/NR2B signaling pathway[J]. Cell Mol Neurobiol, 2019, 39(7): 1003-1015. DOI: 10.1007/s10571-019-00695-3 |
| [21] |
YANG K, JIANG X, SU Q, et al. Disruption of glutamate neurotransmitter transmission is modulated by SNAP-25 in benzo[a]pyrene-induced neurotoxic effects[J]. Toxicology, 2017, 384: 11-22. DOI: 10.1016/j.tox.2017.03.021 |
| [22] |
AGLIARDI C, GUERINI F R, ZANZOTTERA M, et al. SNAP-25 in serum is carried by exosomes of neuronal origin and is a potential biomarker of Alzheimer's disease[J]. Mol Neurobiol, 2019, 56(8): 5792-5798. DOI: 10.1007/s12035-019-1501-x |
| [23] |
LIU C, HUANG H, WANG C, et al. Involvement of ephrin receptor A4 in pancreatic cancer cell motility and invasion[J]. Oncol Lett, 2014, 7(6): 2165-2169. DOI: 10.3892/ol.2014.2011 |
| [24] |
NIKOLOV D B, XU K, HIMANEN J P. Eph/ephrin recognition and the role of Eph/ephrin clusters in signaling initiation[J]. Biochim Biophys Acta, 2013, 1834(10): 2160-2165. DOI: 10.1016/j.bbapap.2013.04.020 |
| [25] |
ROSENBERGER A F, ROZEMULLER A J, VAN DER FLIER W M, et al. Altered distribution of the EphA4 kinase in hippocampal brain tissue of patients with Alzheimer's disease correlates with pathology[J]. Acta Neuropathol Commun, 2014, 2: 79. |
| [26] |
VARGAS L M, CERPA W, MUÑOZ F J, et al. Amyloid-β oligomers synaptotoxicity: the emerging role of EphA4/c-Abl signaling in Alzheimer's disease[J]. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis, 2018, 1864(4): 1148-1159. DOI: 10.1016/j.bbadis.2018.01.023 |
| [27] |
FILOSA A, PAIXAO S, HONSEK S D, et al. Neuron-glia communication via EphA4/ephrin-A3 modulates LTP through glial glutamate transport[J]. Nat Neurosci, 2009, 12(10): 1285-1292. DOI: 10.1038/nn.2394 |
| [28] |
DAS G, YU Q, HUI R, et al. EphA5 and EphA6: regulation of neuronal and spine morphology[J]. Cell Biosci, 2016, 6: 48. DOI: 10.1186/s13578-016-0115-5 |
| [29] |
GERLAI R, SHINSKY N, SHIH A, et al. Regulation of learning by EphA receptors: a protein targeting study[J]. J Neurosci, 1999, 19(21): 9538-9549. DOI: 10.1523/JNEUROSCI.19-21-09538.1999 |
| [30] |
AKANEYA Y, SOHYA K, KITAMURA A, et al. Ephrin-A5 and EphA5 interaction induces synaptogenesis during early hippocampal development[J]. PLoS One, 2010, 5(8): e12486. DOI: 10.1371/journal.pone.0012486 |
[基金项目] 国家自然科学基金项目（81973093）；山西省留学人员科技活动择优资助项目（2019028）；山西省高等学校科技创新项目（201802061）；山西省回国留学人员科研资助项目（2017-059）
[作者简介]
[收稿日期] 2020-09-20
引用格式
周小玲,
孙敏,
李欢, 等.
苯并[a]芘致小鼠认知功能障碍中突触相关蛋白和EphA/EphrinA5的变化[J].环境与职业医学,
2021, 38(3): 288-293.
doi:10.13213/j.cnki.jeom.2021.20444.
ZHOU Xiaoling , SUN Min , LI Huan , LI Yangyang , SONG Zhanfei , WANG Xin , ZHANG Hongmei . Variations of synaptic associated proteins and EphA/EphrinA5 in mice with cognition deficits following benzo[a]pyrene treatment.Journal of Environmental & Occupational Medicine, 2021, 38(3): 288-293. doi:10.13213/j.cnki.jeom.2021.20444.