
持续氟暴露对子鼠体重的影响(n=8,
Effect of continuous fluoride exposure on the weight of
offspring rats (n=8,
2020, 37(12):1175-1181.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2020.20269
氟是自然界广泛存在的非金属元素,也是人体所需的微量元素之一,可通过饮用水[1]、燃煤烘烤的食物[2]等多种途径进入人体;长期过量摄入会引起全身慢性中毒性疾病,即地方性氟中毒,简称地氟病[3]。其临床表现以骨相损害(主要表现为氟斑牙、氟骨症)为主,还包括非骨相损害(神经系统[4]、泌尿系统[5]、心血管系统[6]及生殖系统[7]等损伤)。流行病学调查发现,儿童长期饮用高氟水可出现智力下降、发育迟缓,且氟的摄入量与学习记忆功能损伤程度呈正相关[4, 8]。动物实验证实,过量的氟可通过胎盘、血脑屏障,引起脑组织结构和功能损伤[9],导致学习记忆功能受损[10]。
微小RNA(microRNA,miRNA)是一类介导基因沉默的内源性非编码小分子RNA,调控转录后的基因表达,在神经系统发育、分化及功能行使中起重要作用[11-13]。miRNA异常表达会影响海马神经元的可塑性以及空间学习记忆功能[14-15]。miR-204可通过调控酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor B,TrkB)的表达改善癫痫时脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)-TrkB受抑制状态[16-17],miR- 34b-5P参与海马神经元功能与数量的维持[14, 18-19]。海马是负责学习记忆功能的重要脑部结构,海马细胞损伤可对学习记忆产生明显影响。因此探讨海马组织中miR-204和miR-34b-5P的差异表达对研究学习记忆功能损害机制有重要意义。目前未见miR-204、miR-34b-5P在持续氟染毒对子鼠学习记忆影响中的作用研究,故本研究通过模拟氟病区孕哺期至子代成年前慢性氟暴露情况,建立亲代孕哺期至子代成年前氟暴露模型,观察子鼠空间学习记忆能力及脑海马组织结构的病理学变化,检测尿、脑及血清中氟含量和子鼠脑海马体中miR-204、miR-34b-5P mRNA表达水平,为进一步研究慢性氟染毒致子鼠学习记忆损伤提供机制线索。
氟化钠(NaF,分析纯;SIGMA-ALDRICH公司,美国),Trizol、RT-PCR kit(贵阳沃尔森生物技术有限公司,中国),miR-204、miR-34b-5P和U6的引物(广州锐博生物科技有限公司,中国),SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(贵阳沃尔森生物技术有限公司,中国)。Morris水迷宫游泳池(中国医学科学院药物研究所制备,中国),多功能酶标仪(Multiskan GO;Thermo Scientific,美国),实时荧光定量PCR仪(BioRad,美国),倒置显微镜(尼康公司,日本),CSB-F-Z型春花牌复合氟电极(上海仪电科学仪器股份有限公司,中国)。
健康清洁级SD孕鼠16只,体重220~250 g,由贵州医科大学动物实验中心提供。动物房合格证号:SCXK(黔)2012-0011;动物合格证号:SCXK(军)2012-0011。实验经贵州医科大学伦理委员会批准(编号:1603184)。实验期间,大鼠自由摄食及饮水,于动物实验中心饲养。饲养条件:室温(26.5±2)℃,相对湿度(60±2)%,昼夜交替时间为12 h[20-21]。按体重随机分为对照、低氟、中氟和高氟组,每组4只孕鼠,自由饮水方式染毒。NaF的大鼠急性经口毒性半数致死量(LD50)为147.5 mg·kg-1[22],人与动物之间安全系数为100,按照毒理学设计原则,结合相关文献及课题组前期实验[23],各组饮水中NaF的质量浓度(后称浓度)分别设置为0、60、120、240 mg·L-1。母鼠染毒时间为受孕第0天~子鼠出生后第21天(PND21)。每组随机选取8只子鼠(4雌4雄,同一窝别雌雄比为1: 1),PND22~PND90延续同组剂量染毒,PND91麻醉后心尖取血处死。
自子鼠出生后至PND90,每两周称一次体重。
子鼠处死前通过Morris水迷宫实验测定子鼠空间学习记忆能力。定位航行实验:先固定平台于某一象限内,子鼠面向池壁,将其从4个象限分别放入水中,记录逃避潜伏期,即子鼠找到平台所耗时间,以60 s为界限,60 s内未找到,则记为60 s;60 s内找到平台,则让子鼠站立20 s,此训练持续4 d。空间搜索实验:第5天平台被撤出,任选一象限,子鼠面壁入水,在没有平台的情况下,使其按记忆寻找训练时的平台位置,记录其首次穿越平台的耗时及穿越次数。
子鼠于处死前收集24 h尿液,异氟烷麻醉后,心脏采血处死,迅速分离出脑组织于-80℃保存,脑组织经微波消解,定容。收集全血,于室温放置20min,低温离心取上清,分装,-80℃保存备用。选择电极法检测尿、脑和血清中氟含量。尿氟检出限为0.18 mg·L-1,其回收率及相对标准偏差分别为97.85%~104.85%、0.8%~2.6%。脑氟的检出限为0.36 μg·g-1,回收率为95.2%~103.2%,相对标准偏差为1.4%~2.1%。血清氟的检出限为0.012 mg·L-1,回收率为96.5%~101.5%,相对标准偏差为1.2%~2.5%。
大鼠处死后,冰上分离海马组织。将10%福尔马林溶液固定好的海马包埋,制成石蜡切片(厚度:4 μm);60℃烘烤12 h,后进行HE染色,光学显微镜镜下观察后拍照保存。
称取海马组织约30 mg,采用Trizol法提取总RNA,并进行定量和纯度的鉴定。提出的总RNA按照PrimeScriptTM RT reagent Kit逆转录成cDNA,用于后续RT-PCR扩增,所用试剂盒为:SYBR Green PCR Master Mix。反应体系为10μL:SYBR Green 5μL,正向、反向引物各0.5μL,cDNA 1 μL和DEPC水3 μL。每个样品重复3次[20]。miR-204、miR-34b-5P扩增程序为:95℃ 3 min;95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 60 s,40个循环;延伸72℃ 3 min。基因相对表达水平以2-ΔΔCt法计算。以U6 作为内参,miR-204、 miR-34b-5P和内参引物均由广州锐博生物科技有限公司设计与合成。
实验数据均采用均数±标准差来表示。采用SPSS 25.0进行数据统计及分析,重复测量方差分析用于体重和逃避潜伏期数据处理,单因素方差分析用于其余各指标的均数比较,双变量相关性分析用于变量间相关性分析。检验水准α=0.05。
子鼠体重如图 1所示,大鼠体重随着染毒时间的延长而逐渐增加。除出生第6周低氟组外,各染毒组大鼠体重均低于对照组(P < 0.05)。
持续氟暴露对子鼠体重的影响(n=8,
Effect of continuous fluoride exposure on the weight of
offspring rats (n=8,
与对照组比较:训练第2天,高氟组逃避潜伏期延长(P < 0.05);第4天,中、高氟组的逃避潜伏期均延长(P < 0.001)。第2、3、4天子鼠逃避潜伏期与NaF的染毒浓度呈正相关,相关系数r分别为0.443、0.519、0.840,P值均小于0.05。见表 2。
持续氟暴露对一代子鼠逃避潜伏期及空间探索影响(n=8,
Effects of continuous fluoride exposure on the escape latency and space exploration of offspring rats (n=8,
与对照组比较:高氟暴露组首次到达平台时间增加(P < 0.001);中氟组、高氟组穿越平台次数均减少(P < 0.05)。子鼠首次到达平台时间与NaF染毒浓度分别呈正相关(r=0.828,P < 0.001),NaF染毒浓度与子鼠穿越平台次数呈负相关(r=-0.599,P < 0.001)。如表 2所示。
与对照组比较,各染毒组子鼠的尿、脑、血清氟浓度均升高,差异有统计学意义(P < 0.001);且各组子鼠尿、脑、血清氟水平均与NaF浓度呈正相关(P < 0.001),相关系数r分别为:0.948、0.996与0.914。见表 3。
持续氟暴露对子鼠尿、脑及血清氟的影响(n=8,
Effects of continuous fluoride exposure on fluoride concentrations in urine, brain, and serum of offspring rats (n=8,
如图 2所示,对照组子鼠脑海马组织层次较为清晰,神经元大小均一,且紧密、均匀排列、细胞核形态规则,染色淡,核仁可见。低氟暴露组见少数海马神经元体积缩小,胞质红染,细胞核发生固缩,染色变深,结构模糊,核仁消失,病变神经元主要分布于海马1区(hippocampus 1,CA1)、CA2。中、高氟组海马神经元出现与低氟组相似的变化,但随染氟程度增加,细胞形态改变更明显,受累细胞数量增多,可见于海马各分区。
持续氟暴露子鼠海马组织HE染色结果(×400)
Figure2.Hematoxylin-eosin stained hippocampus of offspring rats after continuous fluoride exposure (×400)
与对照组比较,中、高氟染毒组miR-204及各染毒组miR-34b-5P表达均升高(P < 0.001)。二者相对表达量均与NaF的暴露浓度呈正相关(r=0.984,r=0.980,均P < 0.001)。见表 4。
子鼠海马组织中miR-204,miR-34b-5P的表达量(n=8,
Expression levels of miR-204 and miR-34b-5P in the hippocampus of offspring rats (n=8,
体重增长是反映健康状况的一个重要指标。本研究中,随NaF染毒浓度升高和染毒时间延长,与对照组比较,染毒组增长速度逐渐变缓,提示氟暴露抑制了子鼠体重的增长。尿、血、脑氟水平是反映子鼠氟蓄积及评价氟接触的客观指标。本研究结果显示,染毒组子鼠尿、血清及脑氟含量均高于对照,且与NaF暴露量呈正相关,提示氟进入体内后,虽可经尿液排出,仍可蓄积在血液和大脑中,这与氟可穿透血脑屏障有关[24]。
海马是大脑参与学习记忆的重要结构,故空间记忆的形成依赖于海马结构的完整[25]。本研究发现染毒组子鼠出现海马神经元数量减少、体积缩小,细胞核固缩,结构模糊,核仁消失等病理改变,提示氟蓄积于脑后,可损害海马神经元结构。
Morris水迷宫实验是常用于评价动物空间学习记忆能力的方法。测试内容主要包括定位航行试验和空间探索试验,前者用于测量大鼠对水迷宫学习和记忆的获取能力,后者用于测量大鼠学会寻找平台后,对平台空间位置记忆的保持能力。本研究发现,与对照组比较:训练第4天,中、高氟组逃避潜伏期均延长;高氟暴露组子鼠首次到达平台时间延长,穿越平台次数明显减少,提示持续过量氟暴露可损害子鼠的空间学习记忆能力。
miRNA在脑组织中含量和种类均十分丰富。在脑发育、神经元分化、突触形成中发挥重要作用[26-27]。阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)患者病变脑区可检测到miRNA异常表达[28]。因此miRNA可作为早期标记物用于检测和评估认知功能障碍。miRNA可直接调控细胞通路大多数基因的转录后表达[29],通常通过与mRNA的3'-非翻译区域结合后对其进行降解,阻断翻译和表达[30-31]。已有部分实验证明氟化物暴露可以影响脑组织中miRNA正常表达。Daiwile等[32]研究发现,亚致死浓度(8、20 mg·L-1)的NaF可诱导非编码RNA表达谱的改变。此外,当大鼠暴露氟化物全氟辛烷磺酸盐后,其脑组织中多个与突触传递相关的miRNA出现明显差异表达[33]。本课题组前期高通量测序研究也发现:亲代孕哺期至子代成年前氟暴露致子鼠海马中miR-34b-5P等多个miRNA异常表达,miRNA可能参与氟暴露致子鼠学习记忆损伤[16]。miR-204与miR-34b-5P失调参与包括AD在内的多种神经退行性疾病的发生[34]。miR-204高表达能降低海马神经元中突触可塑性相关因子N-甲基-D-天冬氨酸受体数量;降低TrkB表达[35]。在脊髓神经系统损伤致学习记忆损伤研究中发现miR-34b-5P的上调可抑制环磷酸腺苷反应元件结合蛋白的表达[36];在AD小鼠模型中,抑制miR-34后,参与突触囊泡融合并释放神经递质的蛋白质—突触小泡膜蛋白2水平恢复,记忆缺陷减弱,进一步说明miR-34在维持学习记忆功能方面的作用[37],此外,miR-34b-5P可通过介导Bcl-2蛋白表达促进海马星形胶质细胞凋亡[19]。而神经细胞数量和功能的正常是维持突触可塑性的基本保障。本研究结果:孕哺期至成年前持续氟暴露可导致子鼠海马中miR-204、miR-34b-5P高表达,结合Morris水迷宫实验结果推测:miR-204、miR-34b-5P的高表达可能直接或间接影响子鼠空间学习记忆能力,具体机制值得进一步探讨。
综上所述,慢性持续氟暴露可以损害子鼠的空间学习记忆能力;子鼠海马中miR-204、miR-34b-5P的表达升高可能是空间学习记忆能力降低的机制之一。
持续氟暴露对子鼠体重的影响(n=8,
Effect of continuous fluoride exposure on the weight of
offspring rats (n=8,
持续氟暴露对一代子鼠逃避潜伏期及空间探索影响(n=8,
Effects of continuous fluoride exposure on the escape latency and space exploration of offspring rats (n=8,
持续氟暴露对子鼠尿、脑及血清氟的影响(n=8,
Effects of continuous fluoride exposure on fluoride concentrations in urine, brain, and serum of offspring rats (n=8,
持续氟暴露子鼠海马组织HE染色结果(×400)
Figure 2Hematoxylin-eosin stained hippocampus of offspring rats after continuous fluoride exposure (×400)
子鼠海马组织中miR-204,miR-34b-5P的表达量(n=8,
Expression levels of miR-204 and miR-34b-5P in the hippocampus of offspring rats (n=8,
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81860563);贵州省科技支撑计划(黔科合支撑[2018]2753);贵州省区域内一流学科建设项目—公共卫生与预防医学(黔教科研发2017[85]号)
[作者简介]
[收稿日期] 2020-05-31
引用格式
李阳,
谢春,
张玥, 等.
孕哺期至成年前持续氟染毒对子鼠空间学习记忆和海马病理改变及miR-204、miR-34b-5P表达的影响[J].环境与职业医学,
2020, 37(12): 1175-1181.
doi:10.13213/j.cnki.jeom.2020.20269.
LI Yang , XIE Chun , ZHANG Yue , ZHANG Hua . Effects of continuous fluoride exposure from pregnancy to adulthood on spatial learning and memory, hippocampal pathological changes, and expressions of miR-204 and miR-34b-5P in offspring rats.Journal of Environmental & Occupational Medicine, 2020, 37(12): 1175-1181. doi:10.13213/j.cnki.jeom.2020.20269.