氟是自然界广泛存在的非金属元素，也是人体所需的微量元素之一，可通过饮用水^[1]、燃煤烘烤的食物^[2]等多种途径进入人体；长期过量摄入会引起全身慢性中毒性疾病，即地方性氟中毒，简称地氟病^[3]。其临床表现以骨相损害（主要表现为氟斑牙、氟骨症）为主，还包括非骨相损害（神经系统^[4]、泌尿系统^[5]、心血管系统^[6]及生殖系统^[7]等损伤）。流行病学调查发现，儿童长期饮用高氟水可出现智力下降、发育迟缓，且氟的摄入量与学习记忆功能损伤程度呈正相关^{[4, 8]}。动物实验证实，过量的氟可通过胎盘、血脑屏障，引起脑组织结构和功能损伤^[9]，导致学习记忆功能受损^[10]。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类介导基因沉默的内源性非编码小分子RNA，调控转录后的基因表达，在神经系统发育、分化及功能行使中起重要作用^[11-13]。miRNA异常表达会影响海马神经元的可塑性以及空间学习记忆功能^[14-15]。miR-204可通过调控酪氨酸激酶受体B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）的表达改善癫痫时脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）-TrkB受抑制状态^[16-17]，miR- 34b-5P参与海马神经元功能与数量的维持^{[14, 18-19]}。海马是负责学习记忆功能的重要脑部结构，海马细胞损伤可对学习记忆产生明显影响。因此探讨海马组织中miR-204和miR-34b-5P的差异表达对研究学习记忆功能损害机制有重要意义。目前未见miR-204、miR-34b-5P在持续氟染毒对子鼠学习记忆影响中的作用研究，故本研究通过模拟氟病区孕哺期至子代成年前慢性氟暴露情况，建立亲代孕哺期至子代成年前氟暴露模型，观察子鼠空间学习记忆能力及脑海马组织结构的病理学变化，检测尿、脑及血清中氟含量和子鼠脑海马体中miR-204、miR-34b-5P mRNA表达水平，为进一步研究慢性氟染毒致子鼠学习记忆损伤提供机制线索。

氟化钠（NaF，分析纯；SIGMA-ALDRICH公司，美国），Trizol、RT-PCR kit（贵阳沃尔森生物技术有限公司，中国），miR-204、miR-34b-5P和U6的引物（广州锐博生物科技有限公司，中国），SYBR Green PCR Master Mix试剂盒（贵阳沃尔森生物技术有限公司，中国）。Morris水迷宫游泳池（中国医学科学院药物研究所制备，中国），多功能酶标仪（Multiskan GO；Thermo Scientific，美国），实时荧光定量PCR仪（BioRad，美国），倒置显微镜（尼康公司，日本），CSB-F-Z型春花牌复合氟电极（上海仪电科学仪器股份有限公司，中国）。

健康清洁级SD孕鼠16只，体重220~250 g，由贵州医科大学动物实验中心提供。动物房合格证号：SCXK（黔）2012-0011；动物合格证号：SCXK（军）2012-0011。实验经贵州医科大学伦理委员会批准（编号：1603184）。实验期间，大鼠自由摄食及饮水，于动物实验中心饲养。饲养条件：室温（26.5±2）℃，相对湿度（60±2）%，昼夜交替时间为12 h^[20-21]。按体重随机分为对照、低氟、中氟和高氟组，每组4只孕鼠，自由饮水方式染毒。NaF的大鼠急性经口毒性半数致死量（LD₅₀）为147.5 mg·kg^-1[22]，人与动物之间安全系数为100，按照毒理学设计原则，结合相关文献及课题组前期实验^[23]，各组饮水中NaF的质量浓度（后称浓度）分别设置为0、60、120、240 mg·L^-1。母鼠染毒时间为受孕第0天~子鼠出生后第21天（PND21）。每组随机选取8只子鼠（4雌4雄，同一窝别雌雄比为1: 1），PND22~PND90延续同组剂量染毒，PND91麻醉后心尖取血处死。

自子鼠出生后至PND90，每两周称一次体重。

子鼠处死前通过Morris水迷宫实验测定子鼠空间学习记忆能力。定位航行实验：先固定平台于某一象限内，子鼠面向池壁，将其从4个象限分别放入水中，记录逃避潜伏期，即子鼠找到平台所耗时间，以60 s为界限，60 s内未找到，则记为60 s；60 s内找到平台，则让子鼠站立20 s，此训练持续4 d。空间搜索实验：第5天平台被撤出，任选一象限，子鼠面壁入水，在没有平台的情况下，使其按记忆寻找训练时的平台位置，记录其首次穿越平台的耗时及穿越次数。

子鼠于处死前收集24 h尿液，异氟烷麻醉后，心脏采血处死，迅速分离出脑组织于-80℃保存，脑组织经微波消解，定容。收集全血，于室温放置20min，低温离心取上清，分装，-80℃保存备用。选择电极法检测尿、脑和血清中氟含量。尿氟检出限为0.18 mg·L^-1，其回收率及相对标准偏差分别为97.85%~104.85%、0.8%~2.6%。脑氟的检出限为0.36 μg·g^-1，回收率为95.2%~103.2%，相对标准偏差为1.4%~2.1%。血清氟的检出限为0.012 mg·L^-1，回收率为96.5%~101.5%，相对标准偏差为1.2%~2.5%。

大鼠处死后，冰上分离海马组织。将10%福尔马林溶液固定好的海马包埋，制成石蜡切片（厚度：4 μm）；60℃烘烤12 h，后进行HE染色，光学显微镜镜下观察后拍照保存。

称取海马组织约30 mg，采用Trizol法提取总RNA，并进行定量和纯度的鉴定。提出的总RNA按照PrimeScript^TM RT reagent Kit逆转录成cDNA，用于后续RT-PCR扩增，所用试剂盒为：SYBR Green PCR Master Mix。反应体系为10μL：SYBR Green 5μL，正向、反向引物各0.5μL，cDNA 1 μL和DEPC水3 μL。每个样品重复3次^[20]。miR-204、miR-34b-5P扩增程序为：95℃ 3 min；95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 60 s，40个循环；延伸72℃ 3 min。基因相对表达水平以2^-ΔΔCt法计算。以U6 作为内参，miR-204、 miR-34b-5P和内参引物均由广州锐博生物科技有限公司设计与合成。

实验数据均采用均数±标准差来表示。采用SPSS 25.0进行数据统计及分析，重复测量方差分析用于体重和逃避潜伏期数据处理，单因素方差分析用于其余各指标的均数比较，双变量相关性分析用于变量间相关性分析。检验水准α=0.05。

子鼠体重如图 1所示，大鼠体重随着染毒时间的延长而逐渐增加。除出生第6周低氟组外，各染毒组大鼠体重均低于对照组（P < 0.05）。

与对照组比较：训练第2天，高氟组逃避潜伏期延长（P < 0.05）；第4天，中、高氟组的逃避潜伏期均延长（P < 0.001）。第2、3、4天子鼠逃避潜伏期与NaF的染毒浓度呈正相关，相关系数r分别为0.443、0.519、0.840，P值均小于0.05。见表 2。

与对照组比较：高氟暴露组首次到达平台时间增加（P < 0.001）；中氟组、高氟组穿越平台次数均减少（P < 0.05）。子鼠首次到达平台时间与NaF染毒浓度分别呈正相关（r=0.828，P < 0.001），NaF染毒浓度与子鼠穿越平台次数呈负相关（r=-0.599，P < 0.001）。如表 2所示。

与对照组比较，各染毒组子鼠的尿、脑、血清氟浓度均升高，差异有统计学意义（P < 0.001）；且各组子鼠尿、脑、血清氟水平均与NaF浓度呈正相关（P < 0.001），相关系数r分别为：0.948、0.996与0.914。见表 3。

如图 2所示，对照组子鼠脑海马组织层次较为清晰，神经元大小均一，且紧密、均匀排列、细胞核形态规则，染色淡，核仁可见。低氟暴露组见少数海马神经元体积缩小，胞质红染，细胞核发生固缩，染色变深，结构模糊，核仁消失，病变神经元主要分布于海马1区（hippocampus 1，CA1）、CA2。中、高氟组海马神经元出现与低氟组相似的变化，但随染氟程度增加，细胞形态改变更明显，受累细胞数量增多，可见于海马各分区。

与对照组比较，中、高氟染毒组miR-204及各染毒组miR-34b-5P表达均升高（P < 0.001）。二者相对表达量均与NaF的暴露浓度呈正相关（r=0.984，r=0.980，均P < 0.001）。见表 4。

体重增长是反映健康状况的一个重要指标。本研究中，随NaF染毒浓度升高和染毒时间延长，与对照组比较，染毒组增长速度逐渐变缓，提示氟暴露抑制了子鼠体重的增长。尿、血、脑氟水平是反映子鼠氟蓄积及评价氟接触的客观指标。本研究结果显示，染毒组子鼠尿、血清及脑氟含量均高于对照，且与NaF暴露量呈正相关，提示氟进入体内后，虽可经尿液排出，仍可蓄积在血液和大脑中，这与氟可穿透血脑屏障有关^[24]。

海马是大脑参与学习记忆的重要结构，故空间记忆的形成依赖于海马结构的完整^[25]。本研究发现染毒组子鼠出现海马神经元数量减少、体积缩小，细胞核固缩，结构模糊，核仁消失等病理改变，提示氟蓄积于脑后，可损害海马神经元结构。

Morris水迷宫实验是常用于评价动物空间学习记忆能力的方法。测试内容主要包括定位航行试验和空间探索试验，前者用于测量大鼠对水迷宫学习和记忆的获取能力，后者用于测量大鼠学会寻找平台后，对平台空间位置记忆的保持能力。本研究发现，与对照组比较：训练第4天，中、高氟组逃避潜伏期均延长；高氟暴露组子鼠首次到达平台时间延长，穿越平台次数明显减少，提示持续过量氟暴露可损害子鼠的空间学习记忆能力。

miRNA在脑组织中含量和种类均十分丰富。在脑发育、神经元分化、突触形成中发挥重要作用^[26-27]。阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）患者病变脑区可检测到miRNA异常表达^[28]。因此miRNA可作为早期标记物用于检测和评估认知功能障碍。miRNA可直接调控细胞通路大多数基因的转录后表达^[29]，通常通过与mRNA的3'-非翻译区域结合后对其进行降解，阻断翻译和表达^[30-31]。已有部分实验证明氟化物暴露可以影响脑组织中miRNA正常表达。Daiwile等^[32]研究发现，亚致死浓度（8、20 mg·L^-1）的NaF可诱导非编码RNA表达谱的改变。此外，当大鼠暴露氟化物全氟辛烷磺酸盐后，其脑组织中多个与突触传递相关的miRNA出现明显差异表达^[33]。本课题组前期高通量测序研究也发现：亲代孕哺期至子代成年前氟暴露致子鼠海马中miR-34b-5P等多个miRNA异常表达，miRNA可能参与氟暴露致子鼠学习记忆损伤^[16]。miR-204与miR-34b-5P失调参与包括AD在内的多种神经退行性疾病的发生^[34]。miR-204高表达能降低海马神经元中突触可塑性相关因子N-甲基-D-天冬氨酸受体数量；降低TrkB表达^[35]。在脊髓神经系统损伤致学习记忆损伤研究中发现miR-34b-5P的上调可抑制环磷酸腺苷反应元件结合蛋白的表达^[36]；在AD小鼠模型中，抑制miR-34后，参与突触囊泡融合并释放神经递质的蛋白质—突触小泡膜蛋白2水平恢复，记忆缺陷减弱，进一步说明miR-34在维持学习记忆功能方面的作用^[37]，此外，miR-34b-5P可通过介导Bcl-2蛋白表达促进海马星形胶质细胞凋亡^[19]。而神经细胞数量和功能的正常是维持突触可塑性的基本保障。本研究结果：孕哺期至成年前持续氟暴露可导致子鼠海马中miR-204、miR-34b-5P高表达，结合Morris水迷宫实验结果推测：miR-204、miR-34b-5P的高表达可能直接或间接影响子鼠空间学习记忆能力，具体机制值得进一步探讨。

综上所述，慢性持续氟暴露可以损害子鼠的空间学习记忆能力；子鼠海马中miR-204、miR-34b-5P的表达升高可能是空间学习记忆能力降低的机制之一。