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2020, 37(8):808-811.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2020.20083

奥克托今及其主要合成中间体对中国仓鼠肺细胞凋亡和氧化应激的影响


兵器工业卫生研究所毒理技术研究室, 陕西 西安 710065

收稿日期: 2020-03-02;  录用日期:2020-07-07;  发布日期: 2020-09-07

通信作者: 高俊宏, Email: gaoxing2285@126.com  

作者简介: 郭旺旺(1994—),男,学士,助理工程师; E-mail:953381196@qq.com

利益冲突  无申报

[背景] 奥克托今(HMX)是当今综合性能最好的单质炸药。有研究发现HMX可影响职业暴露者神经行为功能和周围神经传导速度。3,7-二硝基-1,3,5,7-四氮杂双环[3,3,1]壬烷(DPT)是合成HMX的主要中间体,但目前国内外关于DPT的毒性研究尚未见报道。

[目的] 探讨HMX及DPT对中国仓鼠肺细胞(CHL)细胞凋亡及氧化应激水平的影响。

[方法] 应用含有0、31.25、62.50、125、250、500 mg·L-1质量浓度(后称浓度)的HMX、DPT分别对体外培养的CHL染毒24 h,利用CCK-8法检测细胞活力;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况;DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)荧光强度。采用抗氧化剂干预,即2.5 mmol·L-1 N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理CHL 4 h,经120 mg·L-1 DPT染毒24 h后检测细胞活力和凋亡情况。

[结果] 细胞活力检测结果显示DPT对CHL的半数抑制浓度为119.55 mg·L-1。当DPT浓度为250 mg·L-1时,细胞活力下降至(17.95±2.18)%;HMX浓度为500 mg·L-1时,细胞活力为(83.34±3.03)%。细胞凋亡结果显示,与各自对照组相比,各染毒组的凋亡率均随染毒剂量增加而逐渐升高(P < 0.05)。62.50~500 mg·L-1范围内,HMX导致的细胞凋亡率由(15.63±0.58)%缓慢升至(37.00±1.25)%,而DPT引起的细胞凋亡率从(33.75±0.57)%迅速升至(96.57±0.53)%。细胞内ROS检测结果显示,HMX和DPT均能引起细胞内ROS水平升高。但HMX引起细胞内ROS变化较小,250、500 mg·L-1 HMX组细胞内ROS荧光强度分别为103.96±5.59和119.61±4.42,而相同剂量DPT组的ROS荧光强度分别为238.52±7.15和451.02±13.02(P < 0.05)。另外,NAC干预可有效缓解DPT引起的细胞活力抑制和凋亡,NAC预处理+DPT组的细胞活力、凋亡率为(76.41±4.91)%、(16.85±0.12)%,而DPT组为(48.02±2.63)%、(62.67±8.49)%(P < 0.05)。

[结论] 相同剂量下DPT对CHL的毒性大于HMX,高剂量DPT引起细胞内ROS水平升高,导致细胞凋亡。

关键词: 奥克托今;  3, 7-二硝基-1, 3, 5, 7-四氮杂双环[3, 3, 1]壬烷;  职业暴露;  细胞凋亡;  活性氧 

奥克托今,即1,3,5,7-四硝基-1,3,5,7-四氮杂环辛烷(1,3,5,7-tetranitro-1,3,5,7-tetraazacyclooctane,HMX),是当今综合性能最好的单质炸药,在国防工业和国民经济建设中得到广泛应用[1]。动物实验研究表明,小鼠急性经口染毒HMX的半数致死剂量(median lethal dose,LD50)为2 710 mg·kg-1(以体重计),大鼠LD50为7 360 mg·kg-1(以体重计)[2]。小鼠急性经口染毒5 000 mg·kg-1(以体重计)HMX 8 h后,出现听觉刺激敏感性增高,过度兴奋、频繁抽搐等神经毒性症状[3]。HMX的人群暴露资料显示,HMX(13.15 mg·m-3)暴露者以神经行为改变为主,主要表现为头疼、记忆力减退等[3],工作场所空气中HMX时间加权平均容许浓度为2mg·m-3,短时间接触容许浓度为4mg·m-3[4]

3,7-二硝基-1,3,5,7-四氮杂双环[3,3,1]壬烷[3,7-dinitro-1,3,5,7-tetraazabicyclo[3,3,1] nonane,DPT]是合成HMX的重要中间体[5-7]。在实际作业场所,HMX和DPT均以气溶胶形式存在于粉尘中,作业人员的暴露途径以吸入为主[8]。因此,迫切需要研究HMX和DPT的毒性及其毒作用机制,为科研、生产人员的职业防护提供依据。本课题以中国仓鼠肺细胞(Chinese hamster lung cells,CHL)为研究对象,进行不同浓度HMX和DPT染毒,探讨两种物质对CHL的毒性及其机制。

1   材料与方法

1.1   主要仪器与试剂

CO2培养箱(SHELLAB公司,美国),倒置显微镜(Carl Zeiss AG公司,德国),Enspire 2300多功能酶标仪(珀金埃尔默股份有限公司,美国),流式细胞仪(BD公司,美国),激光共聚焦显微镜(莱卡公司,德国);DMEM高糖培养液、胰酶消化液(Hyclone公司,美国),胎牛血清、青-链霉素(Invitrogen公司,美国),DCFH-DA荧光探针(碧云天生物技术公司,中国),N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl cysteine,NAC)(碧云天生物技术公司,中国),CCK-8试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司,中国),Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒(上海七海复泰生物科技有限公司,中国)。HMX和DPT由西安近代化学研究所提供,纯度为99%,用DMSO(西安试剂公司,中国)溶解至1g·L-1备用。

1.2   细胞培养

CHL购于中科院上海细胞库,培养在完全培养液中(含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素混合液的DMEM高糖培养液),在5% CO2、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中培养。选取对数生长期细胞进行试验,支原体检测结果为阴性。

1.3   分组与处理

HMX和DPT染毒试验各设5个染毒剂量组和1个对照组。染毒剂量分别为31.25、62.50、125、250、500mg·L-1,对照组为完全培养液处理;染毒24h。

抗氧化剂NAC干预:用含2.5 mmol·L-1 NAC的细胞培养液孵育细胞4 h,弃去含NAC的培养液,用PBS洗细胞2次,再用120 mg·L-1 DPT染毒24 h。分别设对照组(完全培养液处理)、NAC预处理+DPT组、DPT组(120mg·L-1)。

1.4   指标与方法

1.4.1   细胞活力检测

细胞活力检测采用CCK-8试剂盒。将CHL按2.5×104个·mL-1、每孔200 μL接种于96孔板。HMX或DPT染毒细胞24 h后,每孔加入10 μL CCK-8试剂,继续孵育2 h。在450 nm处利用酶标仪检测光密度值(D),细胞活力=D实验组/D对照组×100%。每个剂量设5个复孔,试验独立重复3次。

1.4.2   细胞凋亡检测

采用Annexin V-FITC/PI双染法,将CHL以2.5×104个·mL-1、每孔500 μL接种于24孔培养板。HMX或DPT染毒细胞24 h后,收集上清液,并用不含EDTA的胰酶消化所有细胞,用预冷的PBS洗细胞2次,用binding buffer重悬细胞,加入Annexin V室温避光孵育15 min,加入PI染料,冰上孵育5 min后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。细胞凋亡率=(早期凋亡细胞数+晚期凋亡细胞数)/细胞总数×100%。试验独立重复3次。

1.4.3   细胞内ROS检测

将CHL以2.5×104个·mL-1、每孔500μL接种于24孔培养板。将HMX或DPT染毒24h后的细胞收集于离心管,将DCFH-DA探针用不含酚红、不含胎牛血清的DMEM高糖培养液稀释至1mmol·L-1,细胞培养箱内孵育15min,避光条件下用预冷PBS洗细胞2次,PBS重悬,采用流式细胞仪检测荧光强度。试验独立重复3次。

1.4.4   NAC干预

分别检测对照组、NAC预处理+DPT组、DPT组的细胞活力和细胞凋亡情况。

1.5   统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计分析,数据以x±s表示,组间均数比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验。检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   HMX和DPT对CHL活力的影响

细胞活力检测结果显示相同剂量条件下,DPT对细胞的毒性更强并且呈现一定的剂量效应关系。DPT对CHL的半数抑制浓度(half-inhibitory concentration,IC50)为119.55mg·L-1,其95%CI为(70.68,278.30)mg·L-1。当DPT浓度为125mg·L-1时,细胞活力为(57.33±2.00)%;浓度为250mg·L-1时,细胞活力下降至(17.95±2.18)%;浓度为500 mg·L-1时继续下降不明显。HMX没有表现出太大的细胞毒性,500 mg·L-1浓度时,CHL细胞活力为(83.34±3.03)%,与对照组相比,差异有统计学意义(P < 0.05),其余各组差异均无统计学意义,见图 1

图 1

HMX和DPT对CHL细胞活力的影响(n=3)

Figure1.

Effects of HMX and DPT on the viability of CHL (n=3)

[注] *:与对照组相比,P < 0.05,#:相同剂量的DPT与HMX比较,P < 0.05。

2.2   HMX和DPT对CHL细胞凋亡和ROS的影响

与各自对照组相比,DPT和HMX各染毒组的凋亡率均随染毒剂量增加而逐渐升高(P < 0.05)。62.50~500 mg·L-1范围内HMX导致的细胞凋亡率由(15.63±0.58)%缓慢升至(37.00±1.25)%,而DPT引起的细胞凋亡率从(33.75±0.57)%迅速升至(96.57± 0.53)%,在相同剂量下,DPT对CHL细胞凋亡的影响大于HMX(均P < 0.05)。见表 1

表1

HMX和DPT对CHL细胞凋亡和ROS的影响(n=3)

Table1.

Effects of HMX and DPT on apoptosis and ROS of CHL (n=3)

细胞内ROS检测结果显示,HMX和DPT均能引起细胞内ROS水平升高。但HMX引起细胞内ROS变化较小,250、500 mg·L-1剂量下细胞内ROS荧光强度分别为103.96±5.59和119.61±4.42;而相同剂量的DPT组细胞内ROS荧光强度分别为238.52±7.15和451.02±13.02,约是前者的2.3倍和3.8倍(P < 0.05)。在≤ 62.50 mg·L-1剂量范围内,HMX引起的细胞内ROS荧光强度略高于DPT(P < 0.05)。见表 1

2.3   NAC可减弱DPT诱导的CHL凋亡

结果显示,对照组的细胞活力和凋亡率分别为(100±0.80)%、(4.75±0.40)%;NAC预处理+DPT组、DPT组的细胞活力为(76.41±4.91)%、(48.02±2.63)%,凋亡率分别为(16.85±0.12)%、(62.67±8.49)%,与对照组相比,差异具有统计学意义(P < 0.05)。

3   讨论

本研究结果显示,HMX对CHL的毒性较DPT小。有文献报道HMX对大鼠经口染毒的LD50大于5 000 mg·kg-1,前期研究发现DPT对大鼠经口染毒LD50约为2 802 mg·kg-1[9-10],这一结果与两种化学品对CHL的抑制趋势一致。进一步研究发现两种化学品均能引起CHL凋亡,但DPT的作用能力更强。同时发现两种化学品可使细胞内ROS水平出现不同程度的升高。但在≤ 62.50 mg·L-1剂量范围内,两种物质引起的细胞内ROS变化水平相近,但细胞活力表现出了差异,说明在低剂量暴露条件下,DPT引起的细胞活力抑制可能与其引起的细胞内ROS变化无关。在高于125 mg·L-1剂量时,DPT引起细胞内ROS水平快速上升,同时细胞活力大幅降低。NAC是一种常见的抗氧化剂,在本研究中利用NAC预处理CHL后,发现120 mg·L-1 DPT对细胞活力的抑制程度下降,并且DPT引起细胞凋亡的能力也下降。说明在较大剂量暴露时,细胞损伤和凋亡与DPT引起的细胞内ROS水平升高有关。

通常化学品或抗肿瘤药物通过诱导细胞凋亡达到抑制其生长的作用,凋亡与细胞活力抑制呈正相关[11]。在本研究中HMX对CHL的细胞毒性较小,500 mg·L-1剂量染毒24h后细胞活力仅被抑制16.66%,而在相同染毒条件下细胞凋亡率却高达37.00%。可以看出,HMX引起的细胞凋亡并没有导致细胞活力发生相应的变化。可能是因为低溶解度的HMX在培养液中析出并黏附在细胞表面,影响了Annexin V与细胞膜磷脂酰丝氨酸的结合。

ROS在细胞内具有双向作用,即正常生理水平的ROS作为细胞内氧化还原信号分子,发挥信号传递作用。而过量的ROS会引起细胞内生物大分子氧化修饰,影响其结构和功能,最终引起细胞损伤[14]。细胞凋亡是过量ROS引起正常细胞不良结局之一,其机制与ROS引起的以死亡分子/死亡受体、肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因子受体、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体等死亡受体通路激活,线粒体膜通透性增加、通透性转运通道开放、细胞色素C和凋亡诱导因子释放为特点的线粒体凋亡通路激活[15-17],丝裂原活化蛋白激酶超家族相关的应激活化蛋白激酶介导的凋亡通路激活[18]等诸多因素有关。DPT如何引起CHL内ROS水平升高以及通过何种机制诱导细胞凋亡,对于研究DPT职业危害特征和职业防护具有重要意义,也将是下一步的研究重点。

图 1

HMX和DPT对CHL细胞活力的影响(n=3)

Figure 1

Effects of HMX and DPT on the viability of CHL (n=3)

[注] *:与对照组相比,P < 0.05,#:相同剂量的DPT与HMX比较,P < 0.05。
表1

HMX和DPT对CHL细胞凋亡和ROS的影响(n=3)

Table 1

Effects of HMX and DPT on apoptosis and ROS of CHL (n=3)

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[收稿日期] 2020-03-02

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