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2020, 37(10):1011-1016.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2020.19835

砷酸氢钠对人肝星状细胞凋亡和自噬的影响


新疆医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室, 新疆 乌鲁木齐 830011

收稿日期: 2019-12-04;  录用日期:2020-08-25;  发布日期: 2020-11-06

基金项目: 新疆维吾尔自治区自然科学基金(2017D01C192)

通信作者: 吴顺华, Email: wushunhua@126.com  

作者简介: 惠瑜(1993-), 女, 硕士生; E-mail:1282120251@qq.com

利益冲突  无申报

[背景] 肝星状细胞是肝脏主要的效应细胞,其活化被认为是促进肝纤维化发展的主要机制之一。自噬和凋亡在肝星状细胞的激活中起关键作用。

[目的] 探讨砷酸氢钠(Na2HAsO4)对人肝星状细胞(LX-2细胞)凋亡和自噬的影响。

[方法] 体外培养LX-2细胞株,使用红色荧光蛋白(RFP)-绿色荧光蛋白(GFP)-微管相关蛋白轻链3(LC3)慢病毒稳定感染LX-2细胞,采用流式细胞仪进行筛选和感染率的测定。用不同浓度Na2HAsO4(0、0.6、6、60 μmol·L-1)孵育慢病毒稳定感染的LX-2细胞,同时设立未经慢病毒感染正常培养的LX-2细胞为空白组。采用CCK-8法检测LX-2细胞活性;采用流式细胞仪检测LX-2细胞凋亡;采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测自噬指标[LC3、重组人自噬效应蛋白(Beclin-1)、泛素结合蛋白P62(SQSTM-1/P62)]以及凋亡指标[B淋巴细胞瘤-2(BCL-2)]。

[结果] RFP-GFP-LC3慢病毒稳定感染后,LX-2细胞慢病毒感染率为70%,在激光共聚焦下观察RFP和GFP的荧光强度无明显差异。Na2HAsO4处理LX-2细胞24、48、72 h后,与Na2HAsO4(0 μmol·L-1)比较,除LC3+Na2HAsO4(0 μmol·L-1)组外,其余各剂量组细胞抑制率均升高(P < 0.05)。随着Na2HAsO4染毒剂量的增加,凋亡率呈上升趋势,且与Na2HAsO4(0 μmol·L-1)组相比,差异均有统计学意义(P < 0.05)。各组间LC3F=5.64,340.66)、Beclin-1F=20.59,87.70)、SQSTM-1/P62F=15.91,107.24)、BCL-2F=113.29,9.41)mRNA和蛋白表达水平差异均具有统计学意义(P < 0.05)。

[结论] Na2HAsO4可诱导LX-2细胞发生细胞凋亡和自噬,凋亡和自噬之间可能存在拮抗作用。

关键词: 砷;  肝星状细胞;  凋亡;  自噬 

砷作为一种有毒的化学物质,主要在肝脏中完成代谢。砷代谢涉及一系列氧化还原反应,在此反应过程中五价态的砷化合物被还原为毒性更强的三价态砷化合物[1-2]。无机砷可诱发肝脏癌变,相关机制研究主要集中在染色体变异、DNA甲基化、氧化应激及表观遗传等方面[3-5]。细胞自噬在砷致肝损伤中起关键作用。自噬可以通过降解脂滴为肝星状细胞的活化提供能量,从而促进肝纤维化的发生[6]。细胞凋亡是细胞的自然程序性死亡,在饥饿或细胞损伤时维持体内平衡,凋亡和自噬可相互作用[7],但其机制有待进一步研究。自噬是一个动态过程,在电镜下观察自噬小体或自噬溶酶体是检测自噬的金标准。以慢病毒感染人肝星状细胞(LX-2细胞),可观察自噬的动态变化。基于本课题组以往研究[8-9],本研究拟探讨不同浓度砷酸氢钠对慢病毒感染的LX-2细胞凋亡和自噬的影响,从凋亡和自噬的角度进一步探讨无机砷致肝纤维化发生的可能机制。

1   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   细胞

LX-2细胞(中国武汉普诺赛生命科技有限公司),具有短串联重复序列鉴定报告。

1.1.2   仪器和试剂

超净工作台(中国江苏苏净集团有限公司),Leica DMI4000B/DM5000B激光扫描共聚焦显微镜(美国Leica公司),流式细胞仪、实时荧光定量PCR仪、凝胶成像分析系统、Western blotting电泳装置及转膜装置(美国Bio-Rad公司)。砷酸氢钠(Na2HAsO4)(中国北京化学试剂三厂),胎牛血清、DMEM高糖培养基(美国Hyclone公司),CCK-8试剂盒(中国武汉博士德生物公司),红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)-绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)-微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)自噬慢病毒载体(中国上海吉凯基因生物公司),Western Breeze化学发光蛋白印迹检测试剂盒、总RNA提取试剂盒、实时荧光定量PCR检测试剂盒、RIPA裂解液、Tizol试剂盒(美国赛默飞公司),LC3、重组人自噬效应蛋白(Beclin-1)、泛素结合蛋白P62(sequestosome 1/P62,SQSTM-1/P62)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma,BCL-2)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因引物序列设计与合成(中国深圳华大基因股份基因引物序列设计与合成(中国深圳华大基因股份有限公司),4×蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、碱性磷酸酯酶显色试剂盒(中国北京索莱宝科技有限公司),LC3、Beclin-1、SQSTM-1/P62、BCL-2、GAPDH抗体(英国Abcam公司)。

1.2   方法

1.2.1   细胞培养

采用含10%胎牛血清、双抗的高糖培养基,在5% CO2、37℃条件下培养细胞。细胞隔两天换一次液,待细胞生长融合度达到80%左右时,使用0.25%胰酶消化收集细胞,依照1: 2进行传代培养,收集生长状况良好且处于对数生长期的细胞进行后续试验。

1.2.2   细胞感染

感染前1 d,将LX-2细胞接种于6孔板内,培养16~24 h,待细胞融合度达50%左右。在感染前吸出旧培养基,用含有病毒滴度为1×107 TU·mL-1慢病毒的培养基继续培养。转染72 h后,在荧光显微镜下观察RFP和GFP。收集感染后的细胞,采用流式细胞术进行筛选,将筛选过的细胞转移到新的T25瓶中用完全培养基继续培养6 d,收集部分感染病毒的稳定细胞株(已携带自噬标记蛋白LC3),采用流式细胞术检测RFP、GFP的表达,并在激光共聚焦显微镜下观察和拍摄感染后的细胞。

1.2.3   细胞染毒和分组

Na2HAsO4用灭菌纯水制备浓度为1 mmol·L-1的母液,并用0.22 μm的微孔滤器过滤除菌后储备于4℃冰箱,用无血清的DMEM培养基配制成所需浓度的应用液。将细胞融合度达80%的LX-2细胞以每孔5000个细胞接种于96孔板中,至次日细胞融合度达60%左右加入不同浓度梯度的Na2HAsO4(0、5、10、20、40、80、100 μmol·L-1),分别处理24、48、72 h,用CCK-8试剂盒测定细胞活性,并计算细胞抑制率,用GraphPad5软件通过细胞抑制率和染砷剂量计算得到IC50为80 μmol·L-1。根据实验需求,以IC50为参照制定所需浓度,将染毒剂量梯度设置为10倍,故该实验分为Na2HAsO4(0 μmol·L-1)、LC3+Na2HAsO4(0 μmol·L-1)、LC3+Na2HAsO4(0.6μmol·L-1)、LC3+Na2HAsO4(6μmol·L-1)、LC3+Na2HAsO4(60μmol·L-1)组。

1.2.4   CCK-8法测定细胞抑制率

将未加任何处理的LX-2细胞及慢病毒稳定感染后的LX-2细胞以每孔5 000个细胞接种到96孔板中,待细胞融合度达到80%时,弃去旧培养基,加入相应浓度的Na2HAsO4。染砷24、48、72 h后,向每孔加入10 μL CCK-8溶液,置于37℃孵育箱继续孵育2 h,用酶标仪测定其在450 nm处的光密度(D)。细胞抑制率=(1-D实验组/D空白组)×100%。

1.2.5   流式细胞术测定细胞凋亡率

取对数生长期LX-2细胞株于T25瓶,根据细胞活性检测结果,在37℃、5% CO2培养箱中孵育48 h后收集细胞,将细胞悬于500 μL结合缓冲液。加入5 μL Annexin V-FITC,再加入5μL碘化丙啶,轻轻混匀,避光,室温反应15min,流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次。

1.2.6   实时荧光定量PCR检测LC3Beclin-1SQSTM-1/P62BCL-2 mRNA表达

收集48 h的细胞,使用试剂盒提取LX-2细胞总RNA,经纯度及完整性鉴定后反转录生成cDNA。根据实时荧光定量PCR试剂盒说明建立反应体系。以GAPDH用作内参基因,确定每个样品和每个基因扩增的循环阈值(cycle threshold,Ct),依据2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达量。所有引物序列见表 1

表1

实时荧光定量PCR引物序列

Table1.

RT-PCR primer sequences

1.2.7   Western blotting法检测LC3、Beclin-1、SQSTM-1/P62、BCL-2蛋白表达

收集48 h的细胞,用放射免疫沉淀裂解液提取各组细胞总蛋白,聚氰基丙烯酸正丁酯法测定蛋白浓度,取相同质量的蛋白上样,经SDS-PAGE转移至聚偏二氟乙烯膜,用Western Breeze试剂盒中的封闭液室温封闭30 min,LC3一抗(稀释比1: 1 000)、Beclin-1一抗(稀释比1: 2000)、SQSTM-1/P62一抗(稀释比1: 1 000)、BCL-2一抗(稀释比1: 500)、GAPDH(稀释比1: 10 000),4℃摇床孵育过夜,抗体洗液漂洗3次,二抗室温孵育30 min,抗体洗液漂洗3次,碱性磷酸酯酶显色试剂盒显影。使用图像分析软件Image J v1.51测量条带的灰度值,并计算每组蛋白质的相对表达。

1.3   统计学分析

选用SPSS 22.0软件进行统计学分析。数据均呈正态分布且方差齐,多组间比较采用单因素方差分析,多组样本两两比较采用LSD法。检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   慢病毒感染LX-2细胞RFP、GFP的表达结果

感染72 h后,可在荧光显微镜下观察到绿色荧光和红色荧光,流式细胞仪测定其感染率为70%。用激光共聚焦显微镜观测RFP和GFP的荧光强度无明显差别,说明稳定表达RFP-GFP-LC3融合蛋白的LX-2细胞株筛选成功。见图 1

图 1

激光共聚焦显微镜下RFP、GFP在RFP-GFP-LC3-LX2细胞中的表达

Figure1.

Expressions of RFP and GFP in RFP-GFP-LC3-LX2 cells under laser confocal microscope

[注] A:透射光源下的LX-2细胞;B:蓝色激发光源下的LX-2细胞;C:绿色激发光源下的LX-2细胞。

2.2   Na2HAsO4对感染后LX-2细胞抑制率的影响

与Na2HAsO4(0μmol·L-1)组比较,除LC3+Na2HAsO4(0 μmol·L-1)组外,其余各组细胞抑制率均升高(均P < 0.05);与LC3+Na2HAsO4(60μmol·L-1)组比较,24、48、72 h时,LC3+Na2HAsO4(0.6 μmol·L-1)组、LC3+Na2HAsO4(6 μmol·L-1)组的细胞抑制率降低(均P < 0.05)。同一时间点,随着染砷浓度的降低,细胞抑制率呈下降趋势。见表 2。同一剂量,与24 h比较,高剂量组在48 h时细胞抑制率降低,出现增殖现象(P < 0.05),故选用48h进行后续的实验。

表2

Na2HAsO4对感染后LX-2细胞抑制率的影响(x±sn=3)

Table2.

Effect of Na2HAsO4 on the inhibition rate of LX-2 cells after infection (x±s, n=3) 单位(Unit): %

2.3   Na2HAsO4对感染后LX-2细胞凋亡的影响

经流式细胞术的检测结果分析,不同剂量组间的细胞凋亡率差异具有统计学意义(F=194.033,P < 0.05)。随着Na2HAsO4浓度的增加,凋亡率逐渐升高,各砷染毒剂量组与Na2HAsO4(0 μmol·L-1)组相比较,差异均有统计学意义(均P < 0.05)。见图 2表 3

图 2

Na2HAsO4对感染后LX-2的细胞凋亡的影响

Figure2.

Effect of Na2HAsO4 on the apoptosis of LX-2 after infection

[注] A:Na2HAsO4(0 μmol·L-1);B:LC3+Na2HAsO4(0 μmol·L-1);C:LC3+Na2HAsO4(0.6 μmol·L-1);D:LC3+Na2HAsO4(6 μmol·L-1);E:LC3+Na2HAsO4(60μmol·L-1)。
表3

Na2HAsO4对感染后LX-2细胞凋亡率的影响(x±sn=3)

Table3.

Effect of Na2HAsO4 on the apoptosis rate of LX-2 cells after infection (x±s, n=3)

2.4   Na2HAsO4对感染后LX-2细胞LC3Beclin-1SQSTM-1/P62BCL-2 mRNA水平的影响

各组LC3Beclin-1SQSTM-1/P62BCL-2 mRNA水平差异均有统计学意义(F=5.64、20.59、15.91、113.29,均P < 0.05)。LC3 mRNA水平:除LC3+Na2HAsO4(0μmol·L-1)组外,其余各剂量组均高于Na2HAsO4(0 μmol·L-1)组;LC3+Na2HAsO4(6 μmol·L-1)组高于LC3+Na2HAsO4(0 μmol·L-1)组(均P < 0.05)。Beclin-1 mRNA水平:除LC3+Na2HAsO4(0 μmol·L-1)组外,其余各剂量组均高于Na2HAsO4(0μmol·L-1)组;LC3+Na2HAsO4(6μmol·L-1)组、LC3+Na2HAsO4(60 μmol·L-1)组高于LC3+Na2HAsO4(0 μmol·L-1)组;LC3+Na2HAsO4(6μmol·L-1)组高于LC3+ Na2HAsO4(0.6μmol·L-1)组;LC3+Na2HAsO4(60μmol·L-1)组低于LC3+Na2HAsO4(6 μmol·L-1)组(均P < 0.05)。SQSTM-1/P62 mRNA水平:LC3+Na2HAsO4(6 μmol·L-1)组、LC3+Na2HAsO4(60μmol·L-1)组高于Na2HAsO4(0μmol·L-1)组;LC3+Na2HAsO4(60μmol·L-1)组高于其余各剂量组(均P < 0.05)。BCL-2 mRNA水平:除LC3+Na2HAsO4(0μmol·L-1)组外,其余各剂量组均高于Na2HAsO4(0 μmol·L-1)组,并随着Na2HAsO4浓度的升高而上调(均P < 0.05)。见表 4

表4

Na2HAsO4对感染后LX-2细胞LC3Beclin-1SQSTM-1/P62BCL-2 mRNA水平的影响(x±sn=3)

Table4.

Effect of Na2HAsO4 on the mRNA levels of LC3, Beclin-1, SQSTM-1/P62, and BCL-2 in LX-2 cells after infection (x±s, n=3)

2.5   Na2HAsO4对感染后LX-2细胞LC3、Beclin-1、SQSTM-1/P62、BCL-2蛋白表达的影响

各组LC3、Beclin-1、SQSTM-1/P62、BCL-2蛋白表达水平差异均有统计学意义(F=340.66、87.70、107.24、9.41,均P < 0.05)。LC3蛋白:各剂量组高于Na2HAsO4(0μmol·L-1)组;LC3+Na2HAsO4(6μmol·L-1)组低于LC3+Na2HAsO4(0.6 μmol·L-1)组;LC3+Na2HAsO4(60μmol·L-1)组高于LC3+Na2HAsO4(6μmol·L-1)组(均P < 0.05)。Beclin-1蛋白:除LC3+Na2HAsO4(0 μmol·L-1)组外,其余各剂量组均高于Na2HAsO4(0 μmol·L-1)组,随着Na2HAsO4浓度的升高呈下调趋势(均P < 0.05)。SQSTM-1/P62蛋白:LC3+Na2HAsO4(60 μmol·L-1)组高于其余各剂量组;LC3+Na2HAsO4(6 μmol·L-1)组低于LC3+Na2HAsO4(0 μmol·L-1)组、LC3+Na2HAsO4(0.6 μmol·L-1)组(均P < 0.05)。BCL-2蛋白:LC3+Na2HAsO4(6 μmol·L-1)组高于Na2HAsO4(0 μmol·L-1)组,LC3+Na2HAsO4(60 μmol·L-1)组高于其于各剂量组(均P < 0.05)。见图 3表 5

图 3

蛋白免疫印迹法检测Na2HAsO4对感染后LX-2细胞LC3、Beclin-1、SQSTM-1/P62、BCL-2蛋白表达水平电泳图

Figure3.

Western blotting results of Na2HAsO4 on the protein expression levels of LC3, Beclin-1, SQSTM-1/P62, BCL-2 in LX-2 cells after infection

表5

Na2HAsO4对感染后LX-2细胞LC3、Beclin-1、SQSTM-1/P62、BCL-2蛋白表达的影响(x±sn=3)

Table5.

Effect of Na2HAsO4 on the protein levels of LC3, Beclin-1, SQSTM-1/P62, and BCL-2 in LX-2 cells after infection (x±s, n=3)

3   讨论

自噬是一种哺乳动物细胞中特殊的自我消化过程,巨自噬是其主要的形式。自噬是一种分解大细胞器及蛋白质聚集体的独特机制。自噬是一个动态过程,可通过在透射显微镜下观察自噬体和自噬溶酶体。本研究用RFP-GFP-LC3慢病毒感染LX-2细胞,在激光共聚焦显微镜下可见绿色荧光斑点和红色荧光斑点,两者的荧光斑点强度无明显差别,证明成功构建慢病毒稳定感染的LX-2细胞株。

在肝脏中,慢性疾病多伴随着肝细胞的凋亡,是肝脏发生癌变的突出病理特征。体外细胞实验表明,活化的肝星状细胞会自发凋亡[10]。本实验用Na2HAsO4干预LX-2细胞,发现随着染砷时间延长及染砷剂量增加,细胞的生存能力明显降低。在同一时间点,随着染毒剂量的增加,细胞凋亡率呈上升趋势。这可能与砷代谢激活LX-2细胞的凋亡机制有关。细胞凋亡受自噬活性的调控,适当的自噬是一种自我保护机制,而过度自噬则导致细胞死亡[11-12]。自噬活性和生物学功能受LC3、SQSTM-1/P62、Beclin-1、BCL-2等各种自噬基因和自噬蛋白的调节[13]。细胞内存在两种形式的LC3蛋白,LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ,当自噬发生时,胞质中的LC3-Ⅰ降解转化为LC3-Ⅱ,LC3-Ⅱ位于自噬体膜上,其含量与自噬泡数量呈正比[14]。当存在受损的DNA、细胞器或蛋白聚集时,SQSTM-1/P62会形成双层膜结构的自噬体,吞噬受损物质。故LC3和SQSTM-1/P62被视为自噬的生物标记物[15]。Beclin-1是自噬关键调节因子,其的增加促进LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化,反映自噬被激活[16]。BCL-2是特性良好的抗凋亡蛋白,也是调控自噬的关键因子,可通过与Beclin-1的BH-3结构域结合,抑制细胞自噬,并且BCL-2表达的上调提示细胞自噬紊乱[17]。Beclin-1可结合BCL-2形成BCL-2/Beclin-1复合体,降低Beclin-1单体,从而抑制自噬[18]。本研究中,实时荧光定量PCR结果显示,Na2HAsO4干预LX-2细胞后,LC3Beclin-1 mRNA水平升高,除LC3+Na2HAsO4(0.6 μmol·L-1)组外,其余各剂量组SQSTM-1/P62 mRNA水平升高,BCL-2 mRNA表达水平随着染砷浓度的增加逐渐升高。Western blotting结果显示,各剂量组LC3蛋白表达水平上调,LC3+Na2HAsO4(60 μmol·L-1)组SQSTM-1/P62蛋白表达水平上调,说明高剂量的砷促进了自噬的发生;随着染砷浓度的增加,Beclin-1蛋白表达水平呈下调趋势,BCL-2蛋白表达水平呈现上调趋势,在LC3+Na2HAsO4 60 μmol·L-1)组中明显上调。其中,LC3SQSTM-1/P62Beclin-1基因水平与蛋白表达水平出现不一致情况,有可能存在从蛋白水平上调节该基因的表达,或由于蛋白降解及稳定性的降低,导致转录水平及蛋白水平上的调节变化[19]。综合上述结果,Na2HAsO4可激活LX-2细胞发生自噬,并导致自噬体过度积累,从而造成自噬受损,其可能与无机砷导致肝损伤的机制有关。随着Na2HAsO4剂量的增加,Beclin-1、BCL-2在LC3+Na2HAsO4(60 μmol·L-1)组的拮抗作用最强,提示高剂量的砷可促进BCL-2与Beclin-1拮抗作用,抑制自噬发生,导致自噬紊乱。细胞凋亡和细胞自噬作为引起细胞程序性死亡的两种不同方式,并非是独立存在的。自噬反应早于凋亡细胞死亡,自噬的过度激活可能通过不受抑制的降解过程导致细胞凋亡死亡。

综合以上研究结果,Na2HAsO4可以导致LX-2细胞发生细胞凋亡和自噬,二者可能存在拮抗作用。

表1

实时荧光定量PCR引物序列

Table 1

RT-PCR primer sequences

图 1

激光共聚焦显微镜下RFP、GFP在RFP-GFP-LC3-LX2细胞中的表达

Figure 1

Expressions of RFP and GFP in RFP-GFP-LC3-LX2 cells under laser confocal microscope

[注] A:透射光源下的LX-2细胞;B:蓝色激发光源下的LX-2细胞;C:绿色激发光源下的LX-2细胞。
表2

Na2HAsO4对感染后LX-2细胞抑制率的影响(x±sn=3)

Table 2

Effect of Na2HAsO4 on the inhibition rate of LX-2 cells after infection (x±s, n=3) 单位(Unit): %

图 2

Na2HAsO4对感染后LX-2的细胞凋亡的影响

Figure 2

Effect of Na2HAsO4 on the apoptosis of LX-2 after infection

[注] A:Na2HAsO4(0 μmol·L-1);B:LC3+Na2HAsO4(0 μmol·L-1);C:LC3+Na2HAsO4(0.6 μmol·L-1);D:LC3+Na2HAsO4(6 μmol·L-1);E:LC3+Na2HAsO4(60μmol·L-1)。
表3

Na2HAsO4对感染后LX-2细胞凋亡率的影响(x±sn=3)

Table 3

Effect of Na2HAsO4 on the apoptosis rate of LX-2 cells after infection (x±s, n=3)

表4

Na2HAsO4对感染后LX-2细胞LC3Beclin-1SQSTM-1/P62BCL-2 mRNA水平的影响(x±sn=3)

Table 4

Effect of Na2HAsO4 on the mRNA levels of LC3, Beclin-1, SQSTM-1/P62, and BCL-2 in LX-2 cells after infection (x±s, n=3)

图 3

蛋白免疫印迹法检测Na2HAsO4对感染后LX-2细胞LC3、Beclin-1、SQSTM-1/P62、BCL-2蛋白表达水平电泳图

Figure 3

Western blotting results of Na2HAsO4 on the protein expression levels of LC3, Beclin-1, SQSTM-1/P62, BCL-2 in LX-2 cells after infection

表5

Na2HAsO4对感染后LX-2细胞LC3、Beclin-1、SQSTM-1/P62、BCL-2蛋白表达的影响(x±sn=3)

Table 5

Effect of Na2HAsO4 on the protein levels of LC3, Beclin-1, SQSTM-1/P62, and BCL-2 in LX-2 cells after infection (x±s, n=3)

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