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2020, 37(6):609-615.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2020.19793

双酚A对大鼠胰岛素瘤细胞凋亡及胰岛素分泌水平的影响


1a. 宁夏医科大学 生育力保持教育部重点实验室, 宁夏 银川 750004 ;
1b. 宁夏医科大学 公共卫生与管理学院, 宁夏 银川 750004 ;
2. 宁夏医科大学 公共卫生与管理学院, 宁夏 银川 750004

收稿日期: 2019-11-19;  录用日期:2020-04-20;  发布日期: 2020-07-09

基金项目: 宁夏高等学校科学技术研究项目(NGY2016109)

通信作者: 李丽萍, Email: coco1809@163.com  

作者简介: 李丽萍(1978-), 女, 硕士, 副教授; E-mail:coco1809@163.com

利益冲突  无申报

[背景] 双酚A(BPA)是一种典型的具有拟雌激素作用的环境内分泌干扰物。越来越多的研究显示,BPA暴露与人类2型糖尿病(T2DM)发生呈正相关,但其作用机制尚不清楚。探讨BPA对糖代谢的影响具有非常重要的意义。

[目的] 探讨双酚A对大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1细胞)凋亡及胰岛素分泌水平的影响。

[方法] 常规培养INS-1细胞,待细胞贴壁后,用含不同浓度BPA(6、30、150 μmol·L-1)的RPMI 1640培养基进行染毒,以DMSO为溶剂(终浓度≤ 0.1%)。采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测BPA对INS-1细胞存活率的影响;流式细胞术检测BPA对INS-1细胞凋亡率的影响;活性氧(ROS)试剂盒检测BPA染毒对INS-1细胞ROS水平的影响;葡萄糖刺激胰岛素分泌实验检测不同浓度BPA对INS-1细胞胰岛素分泌的影响;荧光定量聚合酶链反应、蛋白质印迹法分别检测BPA对INS-1细胞Bcl-2、Bax、半胱天冬酶(caspase)3基因及其蛋白表达水平的影响。

[结果] 与DMSO溶剂对照组比较,30 μmol·L-1 BPA组INS-1细胞存活率增高,150 μmol·L-1 BPA组细胞存活率降低(P < 0.01)。流式细胞术检测结果显示:6、150μmol·L-1 BPA组INS-1细胞总凋亡率增高(均P < 0.05)。6、30、150 μmol·L-1 BPA组INS-1细胞内ROS含量增加(均P < 0.05)。葡萄糖刺激胰岛素分泌实验结果显示:在基础浓度葡萄糖(5.6 mmol·L-1)刺激下,6、30 μmol·L-1 BPA组INS-1细胞胰岛素分泌水平增高(均P < 0.05),150 μmol·L-1 BPA组胰岛素分泌水平下降(P < 0.01),而在高浓度葡萄糖(16.7 mmol·L-1)刺激下,30 μmol·L-1 BPA组胰岛素分泌水平增高(P < 0.05),6、150 μmol·L-1 BPA组胰岛素分泌水平下降(均P < 0.05)。抑制凋亡基因Bcl-2的mRNA及蛋白相对表达水平在6、150 μmol·L-1 BPA组降低,在30 μmol·L-1 BPA组增高(均P < 0.05);促进凋亡基因Bax的mRNA和蛋白相对表达水平在150 μmol·L-1 BPA组增高(均P < 0.05);caspase3的mRNA和蛋白相对表达水平在150 μmol·L-1BPA组增高,在30 μmol·L-1BPA组降低(均P < 0.05);Bcl-2Bax的mRNA和蛋白相对表达比值在6、150 μmol·L-1 BPA组降低(均P < 0.05);cleaved-caspase3与caspase3蛋白相对表达水平比值在6、150 μmol·L-1 BPA组增高(均P < 0.05)。

[结论] 30 μmol·L-1BPA对INS-1细胞具有一定的促进增殖作用,对INS-1细胞胰岛素分泌水平也具有促进作用;6、150 μmol·L-1BPA可降低INS-1细胞活力,诱导INS-1细胞凋亡,降低胰岛素分泌水平,其作用机制可能与氧化损伤有关。

关键词: 双酚A;  INS-1细胞;  细胞凋亡;  Bcl-2 Bax caspase3 cleaved-caspase3 

双酚A(bisphenol A,BPA)是一种典型的具有拟雌激素作用的环境内分泌干扰物[1],作为原料被广泛用于黏合剂、牙科填充材料、食品饮料包装材料、塑料容器、婴幼儿奶瓶奶嘴、眼镜镜片等产品[2]。BPA可通过皮肤接触、空气吸入、饮水摄食等多种途径进入人体,其中胃肠道途径被认为是其暴露的主要途径[3]

以往关于BPA的研究主要集中于其生殖发育毒性、致癌毒性等,近年来越来越多的学者开始关注其对2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)的影响,Hwang等[4]对1980—2018年间发表的BPA暴露与T2DM风险的研究进行meta分析,发现BPA暴露与T2DM风险呈正相关(OR=1.28,95%CI:1.14~1.44)。另有研究显示:BPA暴露可引起大鼠发生氧化应激和胰腺β细胞功能破坏,干扰腓肠肌胰岛素信号转导,导致成年雄性大鼠胰岛素信号传导障碍,发生胰岛素抵抗[5]。氧化应激被认为是影响T2DM发生发展的重要因素,也是许多内分泌学专家公认的机制之一[6]。在糖尿病的发生发展过程中,胰岛β细胞不能随着氧化应激水平的升高而增加抗氧化酶的表达,这使得β细胞容易受到氧化应激的影响,发生细胞凋亡,导致胰岛β细胞数量的进行性减少和功能的进行性恶化,将直接导致胰岛素分泌水平下降,从而延迟胰岛素分泌高峰,加剧血糖浓度的波动,餐后血糖浓度会迅速升高[7]

基于此,本课题组提出这样的研究假设:BPA能否通过诱导胰岛β细胞发生氧化损伤,诱导胰岛β细胞凋亡,导致胰岛β细胞数量的进行性减少,进而影响胰岛β细胞的胰岛素分泌水平?为了验证这一研究假设,本研究以大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1细胞)为靶细胞,通过建立体外细胞模型,进一步探讨BPA对INS-1细胞凋亡和胰岛素分泌水平的影响及机制。

1   材料与方法

1.1   实验材料

1.1.1   细胞株

INS-1细胞系源自X射线照射的移植胰岛瘤的大鼠,胰岛素阳性,可合成胰岛素原Ⅰ和Ⅱ,可用于胰岛β细胞功能研究,本研究中的INS-1细胞由宁夏医科大学陶虹老师馈赠。

1.1.2   主要试剂与仪器

BPA标准品(上海麦克林生化科技有限公司,中国),DMSO(索莱宝,中国),RPMI 1640培养基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(BI,以色列),丙酮酸钠(Gibco,美国),2β-巯基乙醇(Sigma,美国),含/不含EDTA胰酶(索莱宝生物技术公司,中国),100×青霉素/链霉素溶液(Life Technologies,美国),四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(methyl thiazol tetrazolium assay,MTT)试剂盒(凯基生物技术有限公司,中国),活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司,中国),Annexin V-FITC/PI检测试剂盒(贝博生物技术有限公司,中国),胰岛素放射免疫试剂盒(伊莱瑞特试剂有限公司,中国),RNA提取试剂盒(OMGA,中国),RNA反转录试剂盒、PCR试剂盒[宝日医生物技术(北京)有限公司,日本],抗Bcl-2一抗、抗Bax一抗(Proteintech,美国),抗半胱天冬酶(cysteinyl aspartate-specific proteinase,caspase) 3一抗、抗活化型半胱天冬酶(cleaved caspase) 3一抗(abcam,美国),抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)一抗(博奥森生物有限公司,中国),山羊抗兔辣根过氧化物酶二抗(中杉金桥,中国),含0.05% Tween20的TBST(海利克斯,中国),PBS缓冲液(pH=7.4,Hyclon,中国),0.22 μm的聚偏氟乙烯膜(Millipore,美国)。

培养瓶、6孔板、24孔板、96孔板(Corning,美国),超净工作台台(北京东联哈尔仪器制造公司,中国),CO2培养箱(Thermo Fisher,美国),倒置显微镜、荧光倒置显微镜(Olympus,日本),酶标仪(Thermo Fisher,美国),流式细胞仪(Sysmex,德国),荧光分光光度计(UV-1900,SHIMADZU,日本)。

1.2   方法

1.2.1   细胞培养

将INS-1细胞(17~35代)常规接种于含10% FBS的RPMI1640培养基中(含100 U·mL-1青霉素、100 mg·mL-1链霉素、0.11 g·L-1丙酮酸钠、2 mmol·L-1 L-谷氨酰胺和50 μmol·L-1 β-巯基乙醇),于37℃、5% CO2的培养箱中培养。细胞每1~2d换培养基1次,3~4d传代1次。

1.2.2   分组与细胞处理

将INS-1细胞用胰酶消化吹打混匀后,按照一定密度接种于培养皿或培养板中,于37℃、5% CO2的培养箱中常规培养,待细胞贴壁后弃去原培养液,分别加入含不同浓度BPA(6、30、150 μmol·L-1)的RPMI 1640培养基进行染毒处理,以DMSO为溶剂(终浓度≤ 0.1%),每组实验设3个复孔或重复3次。

1.3   检测指标与检测方法

1.3.1   MTT试剂盒测定BPA对INS-1细胞活力的影响

按3×104~4×104个·孔-1的细胞密度接种INS-1细胞于96孔培养板,每孔接种体积为100 µL,置于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后,按照“1.2.2”中细胞处理方法染毒24 h后,每孔加入50 µL 1×MTT,37℃孵育4 h。吸去培养液,加入150 µL DMSO,用平板摇床振荡10 min,采用酶标仪检测490 nm波长下各孔光密度(D)值,利用公式计算细胞存活率。

细胞存活率=[(BPA实验组D值-空白对照D值) / (DMSO溶剂对照组D值-空白对照D值)] ×100%。

1.3.2   Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡

按2×105个·孔-1接种INS-1细胞于6孔板中,待细胞贴壁后,按照“1.2.2”中细胞处理方法染毒细胞,收集每孔漂浮细胞和贴壁细胞,冷PBS洗涤细胞2次,400 μL 1×Annexin V结合液悬浮细胞,每管中加入5 μL Annexin V-FITC染色液于2~8℃避光孵育15 min,再加入10 μL的PI染色液于2~8℃避光孵育5 min,应用流式细胞仪进行细胞凋亡检测。

1.3.3   ROS测定

按3×105个·孔-1的细胞密度接种INS-1细胞于6孔培养板中,每孔加培养基2 mL,待细胞贴壁后,按照“1.2.2”中细胞处理方法进行BPA染毒,弃旧培养液,将ROS检测试剂盒中的DCFH-DA用无血清培养液按1:1 000稀释,使其终浓度为10 μmol·L-1,每孔加入1 mL的10 μmol·L-1 DCFH-DA,37℃培养箱内孵育20 min,PBS洗2遍,尽可能洗净孔中DCFH-DA,0.25%胰酶消化收集细胞,800×g离心5 min,再用2 mL PBS重悬细胞,用荧光分光光度计检测荧光强度(λ激发=488nm,λ发射=525nm)。

1.3.4   葡萄糖刺激胰岛素分泌实验

按2×105个·孔-1密度接种INS-1细胞于24孔板中,每孔加1 mL RPMI 1640培养基,待细胞贴壁后,按照“1.2.2”中细胞处理方法染毒细胞BPA,弃去含受试物培养液,用PBS洗1遍,每孔加入含3 mmol·L-1葡萄糖KRBH缓冲液(含115 mmol·L-1 NaCl、5 mmol·L-1 KCl、1 mmol·L-1 MgCl2、24 mmol·L-1 NaHCO3、2.5 mmol·L-1 CaCl2、10 mmol·L-1 HEPES缓冲液、0.5%牛血清白蛋白) 200 µL平衡1 h,弃上清,每孔换含5.6、16.7 mmol·L-1葡萄糖KRBH缓冲液200 μL,分别干预细胞1 h,分别建立基础葡萄糖刺激胰岛素分泌模型和高糖刺激胰岛素分泌模型,收集上清液于-20℃保存,采用胰岛素放射免疫试剂盒于562 nm波长条件下检测各孔D值,并使用物理裂解的方法裂解细胞,二喹啉甲酸法测定各孔细胞总蛋白含量。每孔胰岛素分泌水平以每孔细胞总蛋白量校正,胰岛素浓度(IU·g-1,以蛋白计) =每孔胰岛素含量(μIU) /每孔细胞总蛋白含量(μg)。

1.3.5   细胞凋亡相关基因Bcl-2Baxcaspase3 mRNA表达水平的检测

按2×105个·孔-1密度接种INS-1细胞于6孔板中,每孔2 mL,待细胞贴壁后,按照“1.2.2”中细胞处理方法染毒细胞,弃上清,PBS洗涤细胞2次,用无EDTA胰酶消化收集细胞,100×g离心5 min,按照RNA提取试剂盒操作方法提取总RNA并测定RNA浓度与纯度。按RNA反转录试剂盒操作方法进行反转录,以20μL体系进行荧光定量PCR,反应条件为:95℃ 30 s,95℃ 5 s,57℃ 30 s,40个循环。每组设置3个复孔,重复3次,按照2-ΔΔCt法计算各组基因mRNA相对表达量,引物设计合成由上海生工完成,引物序列见表 1

表1

引物序列

Table1.

Primer sequence

1.3.6   凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase3、cleavedcaspase3蛋白表达水平的检测

取对数生长期INS-1细胞,接种于10 cm培养皿中,待细胞贴壁后,按照“1.2.2”中细胞处理方法染毒细胞24 h,用细胞刮刮下细胞,冷PBS洗2遍,100×g离心10 min,用RIPA裂解缓冲液(含1%蛋白酶抑制剂和1%磷酸盐抑制剂)裂解细胞20 min后,4 ℃、12 000×g离心20 min后收集上清,用二喹啉甲酸蛋白检测试剂盒测定上清液中的蛋白浓度,每份样品用裂解缓冲液稀释至相同的浓度,并按照4: 1的比例加入5×上样缓冲液。上样体积15 μL,上样量30 μg,浓缩胶5%,分离胶12%。电泳条件:浓缩胶80 V 30 min,分离胶120 V 60 min。转膜条件:恒流300 mA,0.22 μm聚偏氟乙烯膜,Bcl-2蛋白转膜30 min、Bax蛋白转膜30 min、caspase3蛋白转膜50 min、cleaved-caspase3蛋白转膜30 min、GAPDH蛋白转膜60 min,转膜完成后,5%脱脂牛奶封闭1 h。4℃孵育一抗过夜,TBST洗膜3次,每次5 min,室温敷育二抗(1: 5 000) 1 h,TBST洗膜3次,每次5 min,电化学发光法曝光拍照,利用Image J 1.8.0软件进行蛋白条带灰度分析。

1.4   统计学分析

结果均采用SPSS 23.0统计软件进行分析。计量资料以x±s表示,多组间比较采用one-way ANOVA进行统计分析;组间两两比较,方差齐时采用LSD法,方差不齐时采用Dunnett T3检验。检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   BPA对INS-1细胞活性的影响

与DMSO溶剂对照组[(100.00±1.23) %]比较,30 μmol·L-1 BPA组INS-1细胞存活率[(121.83±4.09) %]增高(P < 0.01),150 μmol·L-1 BPA组INS-1细胞存活率[(72.84± 9.13) %]降低(P < 0.01)。

2.2   BPA对INS-1细胞凋亡的影响

图 1可见,与DMSO溶剂对照组比较,6、150μmol·L-1BPA组INS-1细胞总凋亡率增高(均P < 0.05)。

图 1

BPA对INS-1细胞凋亡率的影响(n=3)

Figure1.

Effects of BPA on apoptosis of INS-1 cells (n=3)

注] A:流式细胞术凋亡检测结果图,第1~4象限分别表示坏死细胞、晚期凋亡细胞、早期凋亡细胞和活细胞;B:INS-1细胞总凋亡率。与DMSO溶剂对照组比较,*:P < 0.05,**:P < 0.01。

2.3   BPA对INS-1细胞内ROS含量的影响

表 2可知,与DMSO溶剂对照组比较,6、30、150 μmol·L-1BPA组INS-1细胞内ROS含量增加(均P < 0.05)。

表2

BPA对INS-1细胞胰岛素分泌水平(IU·g-1,以蛋白计)和ROS荧光强度的影响(x±s,n=3)

Table2.

Effects of BPA on insulin secretion level (IU·g-1, in protein) and ROS fluorescence intensity of INS-1 cells (x±s, n=3)

2.4   不同浓度BPA对INS-1细胞胰岛素分泌的影响

表 2可见,与DMSO溶剂对照组比较,在基础浓度葡萄糖(5.6 mmol·L-1)刺激下,6、30 μmol·L-1 BPA组胰岛素分泌水平增高(均P < 0.05),150 μmol·L-1 BPA组INS-1细胞胰岛素分泌水平下降(P < 0.01);而在高浓度葡萄糖(16.7 mmol·L-1)刺激下,30 μmol·L-1 BPA组胰岛素分泌水平增高(P < 0.05),而6、150 μmol·L-1 BPA组INS-1细胞胰岛素分泌水平下降(均P < 0.05)。

2.5   BPA对INS-1细胞凋亡相关基因Bcl-2Baxcaspase3 mRNA表达水平的影响

图 2可见,与DMSO溶剂对照组比较,Bcl-2 mRNA相对表达水平(图 2A)在6、150μmol·L-1 BPA组降低(均P < 0.05),在30 μmol·L-1 BPA组增高;Bax mRNA相对表达水平(图 2B)在6、150 μmol·L-1 BPA组增高(均P < 0.05);caspase3 mRNA相对表达水平(图 2C)在6、150 μmol·L-1 BPA组增高(均P < 0.01),在30 μmol·L-1 BPA组降低(P < 0.01);Bcl-2与Bax的mRNA相对表达水平比值(图 2D)在6、150 μmol·L-1 BPA组降低(均P < 0.01)。

图 2

BPA对INS-1细胞Bcl-2Baxcaspase3 mRNA相对表达水平的影响(n=3)

Figure2.

Effects of BPA on mRNA relative expression levels of Bcl-2, Bax, and caspase3 of INS-1 cells (n=3)

[注]与DMSO溶剂对照组比较,*:P < 0.05,**:P < 0.01。1:DMSO溶剂对照组;2:6μmol·L-1BPA组;3:30μmol·L-1BPA组;4:150 μmol·L-1 BPA组。

2.6   BPA对INS-1细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase3、cleaved-caspase3表达水平的影响

图 3A为蛋白质印迹法电泳图。与DMSO溶剂对照组比较,30 μmol·L-1 BPA组Bcl-2蛋白表达水平增高,6、150 μmol·L-1 BPA组表达水平降低(均P < 0.05,图 3B)。Bax蛋白在150 μmol·L-1 BPA组表达水平增高(P < 0.05,图 3C)。caspase3在30 μmol·L-1 BPA组表达降低(P < 0.01),而在150 μmol·L-1 BPA组表达增高(P < 0.05,图 3D)。Bcl-2与Bax蛋白相对表达水平的比值在6、150 μmol·L-1 BPA组降低(均P < 0.05)(图 3E)。cleavedcaspase3与caspase3蛋白相对表达水平的比值在6、150 μmol·L-1 BPA组表达增高(均P < 0.05)(图 3F)。

图 3

BPA对INS-1细胞Bcl-2、Bax、caspase3、cleavedcaspase3蛋白相对表达水平的影响(n=3)

Figure3.

Effects of BPA on protein relative expression levels of Bcl-2, Bax, caspase3, and cleaved-caspase3 of INS-1 cells (n=3)

[注] A:蛋白电泳图,B、C、D图为Bcl-2、Bax、caspase3蛋白相对表达水平,E图为Bcl-2和Bax蛋白相对表达水平的比值,F图为cleaved-caspase3和caspase3蛋白相对表达水平的比值。与DMSO溶剂对照组比较,*:P < 0.05,**:P < 0.01。1:DMSO溶剂对照组;2:6μmol·L-1BPA组;3:30μmol·L-1BPA组;4:150 μmol·L-1 BPA组。

3   讨论

T2DM是一种代谢性疾病,表现为胰岛素抵抗和胰岛素缺乏的症状[8]。全球成人中T2DM的患病人数约为4.15亿,但根据国际糖尿病联合会的预测,预计到2040年将达到6.42亿[9]。糖尿病的发病机制非常复杂,遗传因素和环境因素是影响T2DM发生和发展的主要因素,其中环境因素至关重要。在过去的十年中,越来越多的研究表明人类在早期发育过程中接触不利的环境因素可明显增加慢性疾病的发病率,其中,环境内分泌干扰物暴露与糖尿病发生的关系越来越受到学者们的关注。一项流行病学调查结果显示:环境内分泌干扰物污染严重地区居民T2DM的发病率较其他地区增高[10]。BPA是一种普遍存在于环境中具有拟雌激素功能的环境内分泌干扰物,其以一种内源性雌激素类似的形式与雌激素受体结合,从而产生一系列的生理病理反应,长期低剂量BPA暴露与肥胖、糖尿病、高血压等代谢紊乱疾病存在关联[4]

本研究结果显示,与DMSO溶剂对照组比较,30μmol·L-1BPA组INS-1细胞活力增高(P < 0.01),150μmol·L-1组INS-1细胞活力降低(P < 0.01),表明30 μmol·L-1 BPA对INS-1细胞具有一定的促增殖作用,使细胞活力增高,而150 μmol·L-1 BPA可以抑制细胞增殖,对细胞具有一定毒性,这与以往研究结果一致[11]

葡萄糖刺激胰岛素分泌实验是体外用于评价胰岛β细胞功能最常用的方法。本项研究结果显示:在基础浓度葡萄糖(5.6 mmol·L-1)刺激下,6 μmol·L-1 BPA组胰岛素分泌水平高于对照组,但在高浓度葡萄糖(16.7 mmol·L-1)刺激下,胰岛素分泌水平降低,相应的ROS荧光强度高于对照组,分析其可能的原因是由于BPA在低剂量水平下使细胞处于一种代偿状态,INS-1细胞虽未出现明显增殖抑制,但其功能可能已经受损,进而影响了INS-1细胞胰岛素分泌功能,导致在高糖水平下胰岛素分泌水平下降,发生胰岛素抵抗。30 μmol·L-1 BPA组胰岛素分泌水平增高(P < 0.05),其原因在于在该剂量水平下BPA对INS-1细胞具有一定的促增殖作用;150 μmol·L-1 BPA组胰岛素分泌水平降低(P < 0.05),其原因可能是由于该剂量水平下BPA可以抑制细胞的活力,对细胞具有一定毒性作用。

胰岛β细胞是唯一分泌胰岛素的细胞,其功能缺陷是血糖代谢紊乱的中心环节。胰岛β细胞中抗氧化酶含量低,极易受到氧化应激的影响,造成细胞数量的进行性减少和细胞功能的恶化。本次研究结果显示6、30、150 μmol·L-1 BPA组INS-1细胞内ROS水平升高(P < 0.05),说明BPA可诱导INS-1细胞发生氧化损伤。

凋亡是细胞受基因调控的一种程序性死亡,它是一种自然死亡的过程,与生长分化一样是多细胞生物生命活动中必不可少的过程。Bcl-2是公认的细胞凋亡调控靶点,它可以通过与Bax拮抗,抑制Bax的游离数量,下调Bcl-2的蛋白表达,会增加Bax转位到线粒体膜,进而增加线粒体通透性,释放细胞色素c,激活caspase3的级联反应,从而促进细胞凋亡,Bcl-2与Bax的比值决定了caspase3的激活程度,比值越低,激活程度越高[12]。当机体受到外来因素作用时,往往会通过诱导细胞凋亡而导致细胞功能的降低。本次研究发现6、150 μmol·L-1 BPA组INS-1细胞均发生不同程度的凋亡,Annexin V-FITC/PI流式细胞凋亡检测结果显示6、150 μmol·L-1 BPA组总凋亡率均高于DMSO溶剂对照组(P < 0.05);凋亡相关蛋白Bcl-2Baxcaspase3cleaved-caspase3表达情况也验证了这一现象,分析其原因是BPA诱导了INS-1细胞发生氧化损伤,而氧化应激是诱导细胞凋亡的主要原因之一。

综上,30 μmol·L-1 BPA对INS-1细胞具有一定的促进增殖作用,对INS-1细胞胰岛素分泌水平也具有促进作用;6、150 μmol·L-1 BPA可引起INS-1细胞活力降低、胰岛素分泌水平降低,其机制可能是BPA可诱导INS-1细胞发生氧化损伤,进而诱导促进凋亡相关蛋白Bax、caspase3、cleaved-caspase3表达增加,抑制了Bcl-2表达,进而导致INS-1细胞凋亡率增高,从而导致INS-1细胞胰岛素分泌水平下降。

表1

引物序列

Table 1

Primer sequence

图 1

BPA对INS-1细胞凋亡率的影响(n=3)

Figure 1

Effects of BPA on apoptosis of INS-1 cells (n=3)

注] A:流式细胞术凋亡检测结果图,第1~4象限分别表示坏死细胞、晚期凋亡细胞、早期凋亡细胞和活细胞;B:INS-1细胞总凋亡率。与DMSO溶剂对照组比较,*:P < 0.05,**:P < 0.01。
表2

BPA对INS-1细胞胰岛素分泌水平(IU·g-1,以蛋白计)和ROS荧光强度的影响(x±s,n=3)

Table 2

Effects of BPA on insulin secretion level (IU·g-1, in protein) and ROS fluorescence intensity of INS-1 cells (x±s, n=3)

图 2

BPA对INS-1细胞Bcl-2Baxcaspase3 mRNA相对表达水平的影响(n=3)

Figure 2

Effects of BPA on mRNA relative expression levels of Bcl-2, Bax, and caspase3 of INS-1 cells (n=3)

[注]与DMSO溶剂对照组比较,*:P < 0.05,**:P < 0.01。1:DMSO溶剂对照组;2:6μmol·L-1BPA组;3:30μmol·L-1BPA组;4:150 μmol·L-1 BPA组。
图 3

BPA对INS-1细胞Bcl-2、Bax、caspase3、cleavedcaspase3蛋白相对表达水平的影响(n=3)

Figure 3

Effects of BPA on protein relative expression levels of Bcl-2, Bax, caspase3, and cleaved-caspase3 of INS-1 cells (n=3)

[注] A:蛋白电泳图,B、C、D图为Bcl-2、Bax、caspase3蛋白相对表达水平,E图为Bcl-2和Bax蛋白相对表达水平的比值,F图为cleaved-caspase3和caspase3蛋白相对表达水平的比值。与DMSO溶剂对照组比较,*:P < 0.05,**:P < 0.01。1:DMSO溶剂对照组;2:6μmol·L-1BPA组;3:30μmol·L-1BPA组;4:150 μmol·L-1 BPA组。

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[基金项目] 宁夏高等学校科学技术研究项目(NGY2016109)

[作者简介]

[收稿日期] 2019-11-19

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