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2020, 37(6):622-627.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2020.19733

磷酸化胞外信号调节激酶1/2在邻苯二甲酸二丁酯致雄性小鼠肝损伤中的作用


1. 黄石中心医院普爱院区腹部肿瘤外科, 湖北 黄石 435000 ;
2. 湖北科技学院基础医学院, 湖北 咸宁 437100

收稿日期: 2019-10-28;  录用日期:2020-03-23;  发布日期: 2020-07-09

通信作者: 洪亮, Email: 32041118@qq.com  

作者简介: 万涛(1982-), 男, 硕士, 主治医师; E-mail:627096995@qq.com

利益冲突  无申报

伦理审批  已获取

[背景] 邻苯二甲酸二丁酯(DBP)具有潜在的肝毒性。胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)的活化形式磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)被证实与肝脏损伤有关。但尚不清楚DBP暴露是否通过p-ERK1/2导致肝损伤。

[目的] 探讨氧化应激介导的p-ERK1/2在DBP所致小鼠肝损伤中的作用。

[方法] SPF级雄性KM小鼠28只,随机分为4组:对照组、50 mg·kg-1·d-1 DBP组、2.5 mg·kg-1·d-1 U0126(一种非三磷酸腺苷竞争性的抑制剂,可阻断ERK1/2的磷酸化和激活)组、50 mg·kg-1·d-1 DBP+2.5 mg·kg-1·d-1 U0126组,实验周期28 d。实验结束后测定小鼠肝脏的脏器系数,HE染色观察肝组织病理学变化,采用二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)荧光染料检测各组小鼠肝组织的活性氧(ROS)水平,硫代巴比妥酸比色法检测丙二醛(MDA)含量,化学比色法检测总抗氧化能力(T-AOC),蛋白质印迹法检测肝组织ERK1/2及其磷酸化(p-ERK1/2)蛋白表达,全自动生化分析仪测定各组小鼠血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、白蛋白(ALB)含量。

[结果] 染毒28 d后,与对照组相比,DBP组小鼠肝脏的脏器系数[(4.97±0.14)%]下降,ALT/AST(2.02±0.25)上升,ALB含量[(18.54±2.64)U·L-1]下降,ROS荧光强度(6 387.0±84.80)增加、MDA含量[(1.65±0.10)μmol·g-1(以蛋白计)]上升,T-AOC水平[(0.55±0.05)U·mg-1]下降,p-ERK1/2蛋白表达水平(1.29±0.02)上升(P < 0.05)。经U0126处理后,与DBP组比较,DBP+U0126组小鼠肝脏的脏器系数[(5.36±0.33)%]上升,ALT/AST(1.40±0.17)下降,ALB含量[(28.92±0.69)U·L-1]上升,ROS荧光强度(5 934.8±38.07)减弱、MDA含量[(1.10±0.08)μmol·g-1(以蛋白计)]下降,p-ERK1/2蛋白表达水平(0.90±0.13)下调(P < 0.05)。

[结论] DBP可提高雄性小鼠肝组织的氧化应激水平,上调p-ERK1/2蛋白表达,引起肝功能障碍;而U0126可通过抑制ERK1/2的磷酸化,改善DBP诱导的肝损伤,提示p-ERK1/2参与了DBP诱导的肝损伤。

关键词: 邻苯二甲酸二丁酯;  胞外信号调节激酶1/2;  氧化应激;  肝损伤;  U0126 

邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)是一类主要的邻苯二甲酸酯塑化剂,通过淋洗、迁移、蒸发等方式被释放到环境中,导致人类潜在的环境相关疾病,如引起发育和(或)生殖障碍[1]。大量证据表明,DBP可通过血液循环和代谢转化进入人体并作用于肝脏[2-3]。人体内邻苯二甲酸酯代谢产物与氧化应激生物标志物活性氧(reactive oxygen species,ROS)的增加密切相关[4]。胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)是真核生物中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)家族的成员之一[5],可被具有抑制蛋白磷酸酶活性的ROS激活,其活化形式—磷酸化ERK1/2 (phosphorylated ERK1/2,p-ERK1/2)与肝脏病理损伤有关[6]。U0126是一种有效、非三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)竞争性的抑制剂,可阻断ERK1/2的磷酸化和激活,对ERK通路活化所致的细胞死亡有保护作用[7],可抑制肝癌细胞的增殖[8]。本研究拟通过检测DBP暴露后昆明小鼠肝组织氧化应激水平、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达水平、肝功能,同时观察U0126对DBP所致肝损伤的影响,探讨氧化应激介导的p-ERK1/2在DBP所致小鼠肝损伤中的作用。

1   材料与方法

1.1   主要仪器与试剂

全自动生化分析仪(iMagic-M7,中国深圳市库贝尔生物科技有限公司),酶标仪(ELx800,美国BioTek),电泳仪(DYY-6C,中国北京市六一仪器厂),显微镜(BX51,日本Olympus)。DBP(纯度≥ 99.6%,美国Sigma),U0126(美国MedChemExpress),DCFH-DA荧光染料(美国Sigma),小鼠血清白蛋白(albumin,ALB)、谷丙转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase,ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)检测试剂盒(深圳市库贝尔生物科技有限公司),总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)检测试剂盒(中国南京建成生物工程研究所),十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶制备试剂盒、放射免疫沉淀分析总蛋白裂解液、聚氰基丙烯酸正丁酯蛋白质浓度测定试剂盒、免疫印迹底物化学发光检测试剂盒(美国ASPEN),一抗均为兔抗小鼠,肌动蛋白(β-actin)(英国Abcam),ERK、p-ERK(美国CST),其他试剂均为国产分析纯。

1.2   实验动物与分组

SPF级雄性昆明小鼠28只,购自湖北省实验动物研究中心,体重(17±1) g,随机分成四组(n=7):对照组、50 mg·kg-1·d-1 DBP组、2.5 mg·kg-1·d-1 U0126组、50 mg·kg-1·d-1 DBP+2.5 mg·kg-1·d-1 U0126(DBP+U0126)组。王彝白纳等[9]报道我国居民膳食24类食品中的DBP含量范围为0~46.50 mg·kg-1[9],据此,本实验DBP暴露浓度设置为50 mg·kg-1·d-1。参考Kim等[10]研究,U0126组小鼠腹腔注射2.5 mg·kg-1·d-1 U0126,DBP+U0126组先腹腔注射2.5 mg·kg-1·d-1 U0126,30 min后再灌胃50 mg·kg-1·d-1 DBP。各组小鼠每日均给药1次,给药体积为10 mL·kg-1,实验周期28 d。在动物实验中遵循3R(替代、优化、减少)原则,本研究经黄石中心医院实验动物伦理委员会批准(编号:2018-03)。

1.3   方法

1.3.1   小鼠脏器系数的测定

实验前后称量小鼠体重并记录,颈椎脱臼法处死小鼠,取完整肝组织,称重并记录,计算脏器系数。

1.3.2   肝组织切片观察

实验结束后,取小鼠部分肝脏,用质量分数4%多聚甲醛固定,经常规脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋后,制备肝组织切片(厚度约4 μm),HE染色,在显微镜下观察不同组小鼠肝组织的病理学变化。

1.3.3   肝功能测定

采用全自动生化分析仪测定各组小鼠的肝功能指标ALB、ALT及AST。

1.3.4   小鼠肝组织匀浆制备

取约2 g的肝组织置于预冷PBS(pH=7.4)中漂洗,滤纸拭干,置于匀浆器中按照每克组织加入10 mL预冷的PBS制成10%匀浆液,4℃,10 000×g离心10 min后取上清,用于ROS、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和T-AOC的检测。

1.3.5   ROS水平测定

肝组织匀浆中ROS水平采用DCFH-DA荧光染料定量分析[11],取肝组织上清液,加入100 μL荧光染料DCFH-DA进行染色,避光反应5 min,用酶标仪检测,结果用相对荧光强度表示。

1.3.6   MDA含量测定

肝组织匀浆中MDA含量用硫代巴比妥酸法[12]进行测定。

1.3.7   T-AOC水平测定

肝组织匀浆中T-AOC水平的测定参照试剂盒说明书进行。

1.3.8   蛋白质印迹法检测肝组织ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达

小鼠肝组织被剪成小块,加总蛋白裂解液裂解,冰浴匀浆后,提取总蛋白,并测定样品中蛋白浓度。上样量10 μg,10%电泳胶分离蛋白,然后转膜至0.45 μm聚偏二氟乙烯膜上,加一抗封闭缓冲液室温震荡1 h,再分别加入β-actin(5%脱脂牛奶,稀释比例1: 10 000)、ERK1/2(5%牛血清白蛋白,稀释比例1: 2 000)及p-ERK1/2(5%牛血清白蛋白,稀释比例1: 1 000)抗体,4℃封闭过夜。TBST缓冲液洗膜,加羊抗兔二抗室温孵育1 h,显影。采集β-actin、ERK1/2及p-ERK1/2条带,以β-actin作内参,分别得到各样品ERK1/2、p-ERK1/2与β-actin的灰度比值。

1.4   统计学分析

采用SPSS 19.0进行统计分析。计量资料以x±s表示,两因素两水平比较采用析因设计的方差分析,组间多重比较SNK-q检验,检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   脏器系数的变化

染毒后DBP组小鼠的肝脏脏器系数较对照组下降(P < 0.05);DBP+U0126组小鼠的肝脏脏器系数较DBP组升高(P < 0.05),与U0126组间的差异无统计学意义(P> 0.05)。见表 1

表1

各组小鼠染毒前、后体重变化及染毒后肝脏脏器系数(n=7,x±s)

Table1.

Weight change and liver organ coefficient of mice in each group before and after exposure (n=7, x±s)

2.2   肝组织的病理学观察结果

对照组小鼠的肝组织结构及肝细胞形态正常;DBP组小鼠肝组织中央静脉淤血,肝细胞水肿,胞内圆形空泡较大(空泡较大是细胞核被挤于一边所造成),肝索结构尚清晰,肝窦明显受压变窄;U0126组小鼠肝组织结构及肝细胞形态也趋于正常,病理学改变不明显;DBP+U0126组小鼠部分肝细胞内可观察到大小不等的圆形空泡,以及一定程度的水肿。见图 1

图 1

各组小鼠肝组织的HE染色结果(×200)

Figure1.

HE staining results of liver tissues of mice in each group (×200)

[注] A:对照组;B:DBP组:C:U0126组;D:DBP+U0126组。黄色箭头表示肝细胞,蓝色箭头表示肝索,绿色箭头表示中央静脉。

2.3   肝功能指标的变化

与对照组比较,DBP组小鼠血清中AST、ALT及AST/ ALT上升,ALB下降(P < 0.05)。与DBP组比较,DBP+U0126组小鼠血清中AST/ALT下降,ALB上升(P < 0.05),AST、ALT在两组间的差异均无统计学意义。DBP+U0126组小鼠血清中AST、ALT、AST/ALT和ALB与U0126组相比,差异均无统计学意义(P> 0.05)。见表 2

表2

各组小鼠肝功能指标的变化(n=7,x±s)

Table2.

Changes of liver function indicators of mice in each group (n=7, x±s)

2.4   肝组织ROS荧光强度、MDA含量及T-AOC水平的变化

与对照组比较,DBP组小鼠肝组织ROS荧光强度、MDA含量增加,T-AOC水平下降(P < 0.05);与DBP组比较,DBP+U0126组小鼠肝组织ROS荧光强度、MDA含量下降(P < 0.05),T-AOC水平改变均无统计学意义;DBP+U0126组小鼠肝组织ROS荧光强度、MDA含量及T-AOC水平与U0126组相比,差异均无统计学意义(P> 0.05)。见表 3

表3

各组小鼠肝组织ROS荧光强度、MDA含量及T-AOC水平(n=7,x±s)

Table3.

ROS fluorescence intensity, MDA content, and T-AOC level in liver tissues of mice in each group (n=7, x±s)

2.5   肝组织ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达

DBP组小鼠肝组织p-ERK1/2表达水平较对照组上调(P < 0.05);DBP+U0126组小鼠肝组织p-ERK1/2表达水平较DBP组下调,较U0126组上调(P < 0.05)。各组小鼠肝组织ERK1/2表达水平无明显差别。见图 2图 3

图 2

各组小鼠肝组织ERK1/2、p-ERK1/2的电泳条带

Figure2.

Electrophoretic bands of ERK1/2 and p-ERK1/2 in liver tissues of mice in each group

图 3

各组小鼠肝组织ERK1/2、p-ERK1/2的相对表达量

Figure3.

Relative expressions of ERK1/2 and p-ERK1/2 in liver tissues of mice in each group

[注] a:与对照组比较,P < 0.05;b:与DBP组比较,P < 0.05;c:与U0126组比较,P < 0.05。经析因方差分析,FDBP=12.018,FU0126=12.801,P < 0.05;F交互=4.233,P < 0.05。

3   讨论

在人体内,某些邻苯二甲酸盐通过水解、氧化和结合代谢过程被消化;消化的邻苯二甲酸盐进入血液并到达肝脏进行解毒,肝脏在这些暴露物的解毒过程中发挥着重要功能[3]。DBP是一种研究较多的涉及人体代谢的化合物,人类持续暴露于DBP可能导致肝脏解毒酶被抑制,并可能导致肝功能障碍[13]。体内毒理学实验结果表明,DBP作为一种外源性氧化物,可引起肝组织的氧化应激反应,并可能激活MAPK级联信号转导通路[3, 14]。其他研究表明,50 mg·kg-1 DBP可诱导白化大鼠的肝细胞增生,胆红素升高,而总蛋白和胆固醇下降(P < 0.01) [15]。本研究进一步发现,相同剂量下DBP短期内持续暴露可提高雄性小鼠肝组织的氧化应激水平,上调p-ERK1/2蛋白表达,引起肝功能指标紊乱并导致肝损伤;而U0126可通过抑制ERK1/2的磷酸化,改善DBP诱导的肝损伤,提示p-ERK1/2亦介导DBP诱导的肝损伤。

目前研究认为DBP诱导肝毒性的上游分子机制之一是氧化应激[3, 14]。本实验结果显示,DBP暴露后小鼠肝组织的ROS、MDA水平上升、T-AOC水平降低,进一步证实了DBP可以提高雄性小鼠肝组织的氧化应激水平。ROS是氧化应激的主要标志物,ROS的过量产生导致胞内大分子如脂质被攻击,MDA是脂质过氧化终产物,其含量的增加与细胞膜的破坏或改变相关,这也为解释DBP暴露后肝功能之所以出现障碍提供了细胞结构基础[16]

此外,在氧化应激过程中产生的ROS作为上游信号分子还参与了信号转导[16]。ROS可激活ERK1/2,使其发生磷酸化[5-6]。ERK1/2是信号转导通路的枢纽分子,其激活或磷酸化可将信号从细胞质转移到细胞核内,从而介导下游转录因子如核因子-κB和激活蛋白-1的活化,进而调节细胞增殖、分化、凋亡和其他生物学功能[17-18]。Ghosh等[19]研究发现,DBP的同系物邻苯二甲酸二辛酯可激活ERK1/2,p-ERK1/2诱导肝细胞凋亡是邻苯二甲酸二辛酯引起肝毒性的分子机制之一。本实验结果显示,DBP组小鼠肝组织p-ERK1/2的表达水平随着氧化应激的增强而升高;给予U0126处理后,DBP+U0126组小鼠肝组织p-ERK1/2水平降低,以上结果进一步说明ERK1/2的激活亦参与了DBP暴露引起的肝损伤。

ERK1/2分布在肝组织中,在肝癌病例中可以发现ERK1/2的过度激活或磷酸化[20-21]。ALT主要存在于肝细胞的细胞浆中,AST主要存在于肝细胞的细胞浆和线粒体中。正常肝细胞由于细胞膜完整,ALT和AST不会被释放到血液中,但当肝细胞受到损伤时,细胞膜通透性增加,肝细胞中的ALT和AST释放入血,从而导致血清中ALT和AST水平升高。AST/ALT值是临床常用的反映肝细胞损害的指标[22]。如果AST/ALT值高于1.44,提示可能患有慢性肝炎[22]。ALB是人体血浆中最主要的蛋白质,维持机体营养与渗透压。Chen等[23]研究表明,灌胃给药邻苯二甲酸二异壬酯可降低Balb/c小鼠血清中ALB水平,且下降的程度与暴露浓度呈负相关。本研究中肝功能指标检测结果表明,DBP组雄性小鼠血清AST/ALT值升高,ALB降低;经U0126处理后,DBP所引起的AST/ALT值明显降低,ALB相应升高,提示通过抑制ERK1/2的激活,可改善DBP引起的肝功能指标紊乱。

ERK1/2的激活还与肝脏的病理状态有关[6]。本研究中组织学切片观察结果表明,DBP暴露后小鼠的肝细胞有一定程度的水肿,肝细胞结构出现病理学改变;经U0126处理后,DBP+U0126组小鼠的肝细胞的形态及结构未见明显异常。本实验结果提供了ERK1/2的激活参与DBP引起肝脏组织病理学变化的证据。

尽管本研究并未检测ERK1/2信号通路的全部指标,但鉴于ERK1/2激酶是通路中的关键分子且发生了磷酸化,这为后续深入探究DBP诱导肝毒性的机制提供了一个新的思路。综上,本研究探讨了DBP所致肝损伤与ERK1/2的关联,并以拮抗剂U0126作为分子事件阻断剂,明确了ERK1/2的激活或磷酸化在DBP致雄性小鼠肝损伤中的介导作用。

表1

各组小鼠染毒前、后体重变化及染毒后肝脏脏器系数(n=7,x±s)

Table 1

Weight change and liver organ coefficient of mice in each group before and after exposure (n=7, x±s)

图 1

各组小鼠肝组织的HE染色结果(×200)

Figure 1

HE staining results of liver tissues of mice in each group (×200)

[注] A:对照组;B:DBP组:C:U0126组;D:DBP+U0126组。黄色箭头表示肝细胞,蓝色箭头表示肝索,绿色箭头表示中央静脉。
表2

各组小鼠肝功能指标的变化(n=7,x±s)

Table 2

Changes of liver function indicators of mice in each group (n=7, x±s)

表3

各组小鼠肝组织ROS荧光强度、MDA含量及T-AOC水平(n=7,x±s)

Table 3

ROS fluorescence intensity, MDA content, and T-AOC level in liver tissues of mice in each group (n=7, x±s)

图 2

各组小鼠肝组织ERK1/2、p-ERK1/2的电泳条带

Figure 2

Electrophoretic bands of ERK1/2 and p-ERK1/2 in liver tissues of mice in each group

图 3

各组小鼠肝组织ERK1/2、p-ERK1/2的相对表达量

Figure 3

Relative expressions of ERK1/2 and p-ERK1/2 in liver tissues of mice in each group

[注] a:与对照组比较,P < 0.05;b:与DBP组比较,P < 0.05;c:与U0126组比较,P < 0.05。经析因方差分析,FDBP=12.018,FU0126=12.801,P < 0.05;F交互=4.233,P < 0.05。

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[作者简介]

[收稿日期] 2019-10-28

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磷酸化胞外信号调节激酶1/2在邻苯二甲酸二丁酯致雄性小鼠肝损伤中的作用

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