《环境与职业医学》杂志官方网站 《环境与职业医学》杂志官方网站

首页> 当期目录> 正文

2020, 37(2):168-173.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2020.19545

细胞自噬在亚慢性锰染毒致C57BL/6小鼠肝脏损伤中的作用研究


1. 陕西中医药大学公共卫生学院, 陕西 咸阳 712046 ;
2. 空军军医大学预防医学系, 陕西 西安 710032

收稿日期: 2019-08-06;  发布日期: 2020-03-14

基金项目: 国家自然科学基金青年项目(81602815);陕西省自然科学基金青年项目(2018JQ8005)

通信作者: 刘启玲, Email: liuqilingsan@163.com  

作者简介:

申向丽(1993-), 女, 硕士生; E-mail:582356214@qq.com

伦理审批  已获取

[背景] 近年来研究发现锰与肝脏疾病的发生发展密切相关,但其发病机制一直未明。自噬在肝脏疾病中发挥的作用一直具有争议。3-甲基腺嘌呤(3-MA)是自噬功能阻断剂,可通过调控自噬水平为锰致肝损伤的机制研究提供依据。

[目的] 揭示亚慢性锰染毒对C57BL/6小鼠肝脏的损伤效应,阐明细胞自噬在其中的关键作用及机制。

[方法] 利用C57BL/6小鼠建立亚慢性锰染毒模型,随机分为4组,每组14只,分别为对照组、锰染毒组、3-MA处理组、锰染毒联合3-MA干预组。对照组腹腔注射生理盐水(0.01 mg·kg-1),锰染毒组腹腔注射剂量为15 mg·kg-1的氯化锰(每周4次),3-MA处理组腹腔注射7.33 mg·kg-1的3-MA(每周3次),锰染毒联合3-MA干预组先注射15 mg·kg-1的氯化锰,30 min后注射7.33 mg·kg-1的3-MA。造模结束后随即进行相关指标检测。运用HE染色法观察小鼠肝脏形态学的改变;透射电子显微镜下观察各组小鼠肝细胞的损伤及自噬溶酶体的改变;运用原子吸收分光光度计对各组小鼠血锰含量进行检测;使用全自动生化分析仪检测各组小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平的变化;使用细胞凋亡(TUNEL)染色技术评估各组肝细胞的凋亡水平;使用Western blotting检测自噬相关蛋白LC3-II、Beclin1的表达情况。

[结果] HE染色发现与对照组相比,锰染毒组肝细胞间隙有较多炎性细胞浸润,且双核细胞数量增多;3-MA干预后,锰染毒对肝脏的炎性浸润及损伤效应有所降低。透射电镜观察发现锰染毒组小鼠肝细胞内线粒体呈现肿胀空泡化现象,并发现较多待降解的自噬溶酶体;锰染毒联合3-MA干预后线粒体空泡化减少,自噬溶酶体数量降低。与对照组相比,锰染毒组血锰、ALT、AST水平增高(P < 0.01),注射3-MA干预后能够降低锰染毒对ALT、AST水平的增高效应(P < 0.01)。Western blotting检测发现与对照组相比,锰染毒组自噬相关蛋白LC3-II、Beclin1表达水平增高(P < 0.01);与锰染毒组相比,锰染毒联合3-MA干预组自噬相关蛋白LC3-II、Beclin1表达水平降低(P < 0.01)。TUNEL染色发现与对照组相比,锰染毒组肝细胞凋亡数量增高(P < 0.01);3-MA干预后肝细胞凋亡数量较锰染毒组减少(P < 0.01)。

[结论] 亚慢性锰染毒能够诱导小鼠肝细胞自噬水平升高,并伴随着肝细胞损伤及肝脏功能下降,运用自噬抑制剂干预后可改善锰染毒对小鼠的肝脏损伤,提示锰染毒诱导的肝脏细胞损伤部分可能是通过自噬途径实现的。

关键词: 锰染毒;  自噬;  肝损伤;  3-甲基腺嘌呤 

锰(Mn)在环境中普遍存在,也是机体内重要的微量元素。锰对于许多生理过程如三磷酸腺苷产生和凝血以及调节和维持其正常功能至关重要;它是许多酶的辅助因子和激活剂,如谷氨酰胺合成酶、半乳糖转移酶、精氨酸酶、超氧化物歧化酶和丙酮酸羧化酶;它在骨骼发育、细胞代谢、线粒体抗氧化系统与细胞死亡中也均有一定作用[1]。尽管它具有营养价值,但锰过量或锰缺乏均会对机体产生不良影响。首次在鸡体内报告有锰缺乏症病例,研究发现是糖基转移酶活性不足导致的骨头畸形,这种锰缺乏的症状主要在骨骼和结缔组织的形成和生长过程中表现出来,其特点主要表现为体重减轻、骨骼生长不良、骨骼异常、血液凝结和低胆固醇血症[2]。在人类与成年动物中锰缺乏症极为罕见,因此锰生物学相关疾病的研究主要围绕着锰的过量暴露而不是锰缺乏。无机锰被用于许多行业,包括钢铁生产、汽油防震添加剂制造、采矿、焊接、电池组装以及玻璃和陶瓷制造[3]。由于锰的广泛应用,越来越多的锰接触人群出现了锰中毒症状,并且发现患有肝病的人血液中锰水平有所上升。除了接触水平和持续时间外,年龄、性别、种族、遗传、地域等也均为锰中毒的相关危险因素。Klaassen[4]于1976年最早提出锰可阻碍胆汁排泄,表明锰可能有一定的肝毒性。肝脏是已知最大的锰储存器官,锰的吸收主要发生在肝脏,通过肝胆管排出是人体清除锰的主要途径,占锰清除量的80%,锰过量积累则会使肝功能减弱;多项动物实验也表明大鼠在锰染毒后出现了肝肿大,体重减轻,血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)异常升高等肝损伤表现[5]

细胞自噬是参与细胞稳态和存活机制的正常生理过程,形成的自噬溶酶体负责降解微生物(病毒、细菌、真菌)、受损的细胞器和受损的蛋白质[6]。由于向溶酶体传递物质的通道有所差异,自噬分为三种类型,即巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬。目前实验室中的大部分研究主要集中在巨自噬(以下简称自噬)。在自噬发生过程中,自噬相关蛋白LC3合成后,其羧基端被自噬相关基因Atg4剪切,产生位于细胞浆的LC3-I,LC3-I会被Atg7和Atg3修饰并加工,产生附着于自噬小体的LC3-Ⅱ。自噬过程被认为是内源性防御机制的一种形式,它允许细胞在恶劣的条件下生存,包括缺氧、高温、饥饿和氧化应激等[7]。当机体受到损伤和刺激时,如营养缺乏、细胞器损伤、蛋白质蓄积、组织损伤,可以引起细胞自噬水平增强。但研究发现过度自噬则会损伤细胞,以前被称为Ⅱ型程序性细胞死亡,现在被称为自噬性细胞死亡[8]。阻碍正常自噬过程可能会导致各种疾病,如肝脏相关疾病、神经退行性疾病、癌症和心血管疾病。如今自噬已被认为是一种疾病相关因素,异常的自噬可以促进各种肝脏疾病的发生和发展,包括肝炎、纤维化、脂肪变性、肝硬化甚至肝癌[9]。最重要的是,对自噬的调节已被广泛证明可以改变与肝脏有关疾病的发生和结果,这意味着它代表了一种预防和治疗肝脏疾病的新方法。虽然自噬在疾病中的确切作用仍有待确定,但改变自噬水平已成为各种疾病治疗方法的潜在目标。

在本课题前期的研究中已经发现亚慢性锰染毒可使小鼠肝细胞自噬水平增高,但是自噬水平的改变在锰致小鼠肝损伤的过程中具体扮演了怎样的角色仍是未知的。为了阐明这一点,本研究拟使用自噬抑制剂三甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)进行自噬过程的干预,从而探讨细胞自噬在锰致肝脏损伤的发生发展过程中可能发挥的作用,进一步为亚慢性锰暴露所致肝损伤的防治提供线索。

1   材料与方法

1.1   实验动物和试剂

在该研究中共使用56只6周龄雄性C57BL/6小鼠,体重(20±2) g,购自第四军医大学实验动物中心。实验动物伦理批准号为20190503。将C57BL/6小鼠饲养在标准条件下(每笼3~4只小鼠,20~24℃,相对湿度45%~65%,12 h光照/黑暗循环),并在整个研究过程中给予充足的食物和水。

用电子秤称取90mg MnCl2·4H2O(分子量:197.91,美国ACROS ORGANICS),随即溶于30 mL去离子水中,混匀后用孔径为0.22 μm的过滤器滤过杂质,最后分装在2.5 mL EP管中,保存于4℃备用。自噬抑制剂3-MA(分子量:149.15)购自美国Sigma公司。称量22 mg 3-MA溶于30 mL PBS中,使其充分溶解后分装在2.5 mL EP管中,保存于4℃备用。本实验过程中所需的LC3-Ⅱ、Beclin1、β-actin抗体均购自CST中国分公司。

1.2   建立亚慢性锰染毒小鼠模型

适应性喂养7 d后将C57BL/6小鼠随机分为4组:对照组、锰染毒组、3-MA处理组、锰染毒联合3-MA干预组,每组14只。锰染毒组按照15 mg·kg-1的剂量腹腔注射MnCl2·4H2O,注射体积按0.01 mL·g-1计;对照组给予相同体积的0.9%(质量分数) NaCl,采用相同的给药方式;3-MA处理组按照7.33mg·kg-1的剂量腹腔注射3-MA;锰染毒联合3-MA组先给予15mg·kg-1的MnCl2·4H2O,半小时后再给予7.33mg·kg-1的3-MA。各组MnCl2·4H2O一周注射4次,注射时间为每周一、二、四、五;3-MA一周注射3次,注射时间为每周一、四、五,造模时间一共为4周。

1.3   HE染色检测肝组织损伤

造模4周后,用5%的水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠,充分麻醉后将小鼠放于泡沫板上用剪刀剖开胸腹,使心脏完全暴露,使用1 mL注射器穿刺小鼠右心室并缓慢抽取全血,立即存于促凝管,静置5 min后对称放于离心机内,将离心机转速设置为3 000 r·min-1,离心半径为5 cm,离心时间为15 min。待血清完全分离后用1 mL移液器缓慢吸出上层血清,保存于冻存管内,暂放于-80℃冰箱。

抽取全血后用0.9% NaCl冲洗心脏与血管,用4%的多聚甲醛对心脏进行灌注固定,迅速分离肝脏组织,浸泡于多聚甲醛液中48 h,用15%蔗糖脱水24 h,取出组织再用25%蔗糖脱水24 h之后行冰冻连续切片,进行常规HE染色。在光镜下评估肝脏组织损伤程度。

1.4   电镜观察

各组动物解剖并心脏抽血后,剪破小鼠右心耳,抽取生理盐水穿刺左心室后将小鼠心血管中残存的血液冲干净,直至小鼠肝脏从红色渐变至棕色,立即取出肝脏组织块,在固定液中剪切成1 mm3的小正方体后放入提前备好的小瓶固定液中,送电镜室切片,染色,将染色后的超薄切片放到单孔铜网盒上,在透射电镜下观察肝细胞超微结构并拍照。

1.5   血锰含量检测

在各组小鼠血样中加入1%硝酸溶液稀释贮备液,运用原子吸收分光光度计检测稀释后各组血锰浓度,并依据稀释倍数计算血锰含量。

1.6   ALT和AST含量测定