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2020, 37(1):51-56.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2020.19423

邻苯二甲酸二异癸酯急性染毒对小鼠肾脏的影响及其作用机制


湖北科技学院基础医学研究中心, 环境-免疫与神经系统疾病实验室, 湖北 咸宁 437100

收稿日期: 2019-06-19;  发布日期: 2020-02-14

基金项目: 湖北省大学生创新训练计划项目(s201910927038);湖北省卫生计生委重点支撑项目(WJ2017Z027);湖北省高等学校优秀中青年科技创新团队计划项目(T201717)

通信作者: 马萍, Email: mping68@126.com  

作者简介:

普光吉(1999-), 男, 本科生; E-mail:2605823137@qq.com

伦理审批  已获取

[背景] 邻苯二甲酸二异癸酯(DiDP)是一种新型增塑剂,可经多种途径进入人体。目前国内对DiDP肾毒性作用的研究不多,DiDP是否可通过氧化应激导致受试动物发生肾损伤尚不清楚。

[目的] 探讨不同剂量的DiDP暴露对雄性Balb/c小鼠肾脏的影响及可能机制。

[方法] Balb/c小鼠随机分为空白对照组(生理盐水)、不同剂量DiDP组(0.15、1.5、15、150 mg/kg)、Vit E组(100 mg/kg)、联合处理组(150 mg/kg DiDP+100 mg/kg Vit E)共7组,每组8只。灌胃染毒14 d后,观察肾组织切片病理学变化,检测肾组织活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)、8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)和血清尿素氮(UREA)、肌酐(CREA)水平。

[结果] 与空白对照组比较,150 mg/kg DiDP组小鼠肾组织ROS、MDA、8-OHdG水平及血清UREA、CREA含量升高,GSH水平降低,差异均有统计学意义(P < 0.05);肾组织切片结果显示DiDP剂量越高,肾脏损伤越严重。加入Vit E干预后,与150 mg/kg DiDP组比较,联合处理组小鼠肾组织ROS、MDA、8-OHdG水平及血清UREA、CREA含量下降,GSH水平上升,差异均有统计学意义(P < 0.05),同时肾组织切片结果也显示Vit E可在一定程度上降低150 mg/kg DiDP造成的肾损伤。

[结论] DiDP可能通过氧化应激途径导致受试小鼠肾组织发生病理损伤。

关键词: 增塑剂;  邻苯二甲酸二异癸酯;  肾损伤;  活性氧;  尿素氮;  肌酐 

邻苯二甲酸酯(phthalates,PAEs)类增塑剂因可增加塑料制品的可塑性和柔韧性,被广泛应用于皮革制品、汽车内饰、地板、医疗设备,甚至酒类、调味品中[1-2]。已有研究表明,传统PAEs类增塑剂具有类雌激素作用[3],对人类的生殖发育具有毒性,故欧盟成员国已严格限制传统PAEs类增塑剂的使用。新型增塑剂邻苯二甲酸二异癸酯(diisodecyl phthalate,DiDP)作为传统PAEs类增塑剂的替代品,因其生殖发育毒性相对较低而受到推荐,目前已广泛应用于日用化工领域[4]。Cho等研究[5]发现,>400 mg/L DiDP能使Fischer 344大鼠的存活率和体重均下降,肝脏、肾脏发生肿胀。Cho等[6]研究指出,DiDP和传统PAEs类塑化剂类似,可诱导雄性小鼠肝细胞中过氧化物酶体大量增加,造成肝脏损伤。其他研究显示,DiDP经口摄入可通过氧化应激加重Balb/c小鼠的变态反应性皮炎,通过线粒体-Caspase途径诱导昆明小鼠的肝脏损伤,提示氧化应激可能参与DiDP的毒理学过程[7-8]

目前,国内对DiDP肾毒性作用的研究较少[9],DiDP是否可通过氧化应激导致肾损伤尚不清楚。维生素E(vitamin E,Vit E)是一种天然的抗氧化剂,其抗氧化作用可以保护生物体免受氧化应激损伤[10]。本实验以雄性Balb/c小鼠为实验对象,通过不同剂量DiDP灌胃处理受试小鼠后,观察肾组织切片的病理学变化,以肾组织活性氧(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)、8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxydeoxyguanosine,8-OHdG)、血清尿素氮(urea nitrogen,UREA)、血清肌酐(creatinine,CREA)为评价指标,同时加入Vit E进行干预,探究不同剂量的DiDP对雄性Balb/c小鼠肾脏的影响及其作用机制。

1   材料与方法

1.1   实验动物

56只受试雄性Balb/c小鼠[5周龄,体重(16.1± 0.4)g]购自湖北省实验动物研究中心,实验动物许可证号:SYXK(鄂)2013-0071,动物质量合格证号:No.42000600001035。所有实验程序均经湖北科技学院实验动物伦理委员会批准(编号:2017-02-001)。

1.2   试剂与仪器

DiDP(质量分数≥ 99.6%)、Vit E(质量分数≥ 99%)、Hoechst33258荧光染料、二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(质量分数>99.9%)、蛋白酶K(Sigma,美国),硫代巴比妥酸(分析纯,国药集团,中国),GSH试剂盒(南京建成,中国),8-OHdG ELISA试剂盒(济南朋远,中国),CREA、UREA试剂盒(深圳库贝尔,中国);Hidex Chameleon V多功能荧光酶标仪(Hidex,芬兰),Power wave XS酶标仪(Bio-Tek,美国),DP73光学显微镜(Olympus,日本),5424/5424R低温冷冻离心机(Eppendorf,德国),RM2245切片机(Leica,德国),iMagic-V7动物自动生化分析仪(深圳库贝尔,中国)。

1.3   动物分组与染毒

实验小鼠称重记录后随机分为7组(8只/组),含1个空白对照组(生理盐水)、4个不同剂量DiDP组、1个Vit E组和1个联合处理组。美国消费品安全委员会在2010年提出,成人的DiDP可接受日摄入量为0.15 mg/(kg·d)[11]。据此,本研究中DiDP以吐温80(Tween80)助溶(VDiDP: VTween80 =1: 1),再加入生理盐水依次稀释成15、1.5、0.15、0.015 g/L共4种质量浓度的使用液。参考Peng[10]的研究,Vit E剂量选择为100 mg/(kg·d);Vit E组给予100 mg/kg Vit E,联合处理组给予150 mg/kg DiDP 3 h后再给予100 mg/kg Vit E。各组小鼠每天均经口灌胃给药1次,给药量为10 mL/kg,最终染毒剂量是0.15、1.5、15、150 mg/kg,染毒周期14d[9]

1.4   肾脏组织切片的制备和观察

染毒14 d结束后,每组随机选取1只小鼠用于观察病理切片。颈椎脱臼处死小鼠,立即解剖后取出肾脏,并用4%(体积分数)多聚甲醛固定,常规脱水、石蜡切片,经HE染色后镜下观察肾组织切片的病理学变化。

1.5   肾功能的测定

小鼠麻醉后心脏取血,4℃离心15min(3000r/min,离心半径10 cm),取血清样本200 μL,加双蒸水600 μL稀释,用于UREA、CREA的检测。

1.6   肾组织匀浆的制备

肾脏称重后置于预冷的磷酸盐缓冲液(pH=7.5)中漂洗,用滤纸拭干,加预冷的磷酸盐缓冲液制成质量分数为10%的匀浆液,4℃离心10min(10000r/min,离心半径10 cm)后取上清,用于ROS、MDA、GSH和8-OHdG的检测[12]

1.7   氧化应激指标的检测

1.7.1   ROS含量测定

取100 μL肾脏组织匀浆上清液于酶标板中,加入100 μL荧光染料二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯,孵育箱内37℃避光反应5min,用荧光酶标仪检测各孔485 nm处激发光、528 nm处发射光的荧光强度,ROS含量以相对荧光强度表示。

1.7.2   MDA含量测定

取0.5 mL组织匀浆上清于10mL离心管中,加入质量分数为0.6%硫代巴比妥酸溶液,100℃水浴15 min,冷水冷却后取1 mL,4℃离心10 min(10 000 r/min,离心半径10 cm),取上清液200 μL于酶标板内检测450、532、600 nm处的光密度值(D450D532D600)。MDA含量(CMDA,μmol/L)=6.45×(D532-D600)- 0.56×D450

1.7.3   GSH含量测定

严格按照试剂盒的操作说明进行GSH含量的测定,检测各孔412 nm处的光密度值(D测定值),GSH含量(nmol/L)=D测定值/0.0023,R2=0.997。

1.7.4   8-OHdG含量测定

严格按照试剂盒的操作说明进行8-OHdG含量的测定,检测各孔450 nm处的光密度值(D450)。以标准品浓度0、3、6、12、24、48 μg/L等为横坐标,以D450为纵坐标,绘制标准曲线,根据标准曲线来确定样品中8-OHdG的含量。ELISA试剂盒灵敏度为0.5μg/L。

1.8   统计学分析

计量数据均用均数±标准差(x±s)表示,应用GraphPad Prism 6.0进行统计分析,组间比较应用单因素方差分析,多个均数之间两两比较采用q检验,检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   肾组织病理学变化

图 1可知,空白对照组及Vit E组小鼠肾组织切片结构正常,而DiDP组均可见不同程度的病理学变化。0.15mg/kg DiDP组肾小球体积增大,肾小管上皮细胞水肿,管腔变形;1.5 mg/kg DiDP组肾小球体积增大,血管球呈分叶状,肾小管上皮细胞严重水肿,管腔变形;15 mg/kg DiDP组肾小球毛细血管扩张,细胞增生,肾小管上皮细胞进一步水肿,管腔受压;150 mg/kg DiDP组肾小球毛细血管进一步扩张,细胞增生明显,球体肥大,与球囊壁界限不清,肾小管间挤压严重,上皮细胞损伤明显,偶见红细胞;联合处理组肾小球毛细血管扩张明显,球体肥大但与球囊壁界限尚清,肾小管管腔形态尚清,上皮细胞水肿。结果表明,DiDP暴露剂量越大,肾损伤越严重,而Vit E可缓解肾组织损伤。

图 1

各实验组小鼠肾组织的病理学观察结果(×400,HE染色)

2.2   小鼠血清CREA和UREA含量

图 2可知,小鼠血清CREA、UREA含量随着DiDP染毒剂量的升高,有逐渐上升的趋势。与空白对照组比较,15、150mg/kg DiDP组血清CREA含量升高(q=1.584,P=0.012;q=3.649,P=0.007);与150mg/kg DiDP组比较,联合处理组血清CREA含量下降(q=1.314,P=0.027)(图 2A)。与空白对照组比较,150 mg/kg DiDP组血清UREA含量升高(q=1.421,P=0.009);与150 mg/kg DiDP组比较,联合处理组UREA含量下降(q=1.248,P=0.008)(图 2B)。

图 2

各实验组小鼠血清CREA(A)和UREA(B)含量(n=7)

2.3   小鼠肾组织ROS、MDA、GSH和8-OHdG含量

图 3显示,随DiDP暴露剂量的升高,ROS、MDA、8-OHdG含量呈现上升趋势,GSH含量呈现下降的趋势。ROS含量变化见图 3A,与空白对照组比较,DiDP 1.5、15、150 mg/kg组ROS含量升高(q=5.405,P=0.038;q=2.270,P=0.002;q=2.105,P=0.005);而与150 mg/kg DiDP组比较,联合处理组ROS含量下降(q=6.311,P=0.022)。MDA含量变化见图 3B,与空白对照组比较,DiDP 1.5、15、150 mg/kg组MDA含量均升高(q=3.063,P=0.037;q=5.891,P=0.024;q=1.081,P=0.001);与150 mg/kg DiDP组比较,联合处理组MDA含量下降(q=7.603,P=0.041)。GSH含量变化见图 3C,与空白对照组比较,150 mg/kg DiDP组GSH含量下降(q=2.722,P=0.001);与150 mg/kg DiDP组比较,联合处理组GSH含量升高(q=1.242,P=0.027)。8-OHdG含量变化见图 3D,与空白对照组比较,150 mg/kg DiDP组8-OHdG含量升高(q=3.183,P=0.000 1);与150 mg/kg DiDP组比较,联合处理组8-OHdG含量下降(q=3.722,P=0.002)。

图 3

各实验组小鼠肾ROS(A)、MDA(B)、GSH(C)和8-OHdG(D)含量(n=7)

3   讨论

与其他PAEs类似,DiDP不与塑料共价结合,较易进入环境,可通过皮肤、口腔和吸入途径进入人体内[13]。欧盟规定,食品中DiDP和邻苯二甲酸二异辛酯的总和上限为9.0mg/kg[14]。2011年,中国台湾食品中首次检测到包括DiDP在内的增塑剂含量超标[15]。已有动物研究表明,通过饮食摄入的DiDP可诱导受试小鼠的肝毒性[9];Ma等[16]研究也表明,DiDP同系物邻苯二甲酸二异辛酯可通过氧化应激造成肝肾损伤。本研究用肾功能指标UREA、CREA来反映DiDP对小鼠肾组织的影响,明确了DiDP暴露可影响肾组织ROS、MDA、GSH和8-OHdG含量的变化,中、高剂量(≥ 15 mg/kg)的DiDP暴露均可造成小鼠肾组织的形态学损伤,而Vti E可在一定程度上降低DiDP造成的肾损伤,提示氧化应激可能介导了DiDP诱导小鼠肾损伤的毒理学过程。

CREA和UREA主要通过肾脏进行代谢,CREA直接反映肾小球滤过情况,而UREA间接反映肾小球滤过情况;肾实质受损伤时,CREA和UREA含量升高,肾小球重吸收功能下降,故二者是反映肾功能的重要指标[17]。本研究结果提示较高剂量的DiDP(≥ 15mg/kg)暴露可对小鼠肾功能造成一定程度的损害,这一结果与Julia等[18]的研究结果相一致。

本实验结果提供了DiDP引起肾脏组织病理学变化的证据。在150 mg/kg DiDP暴露剂量下,肾组织病理切片可观察到肾小管间隙明显缩小,肾小球上皮细胞极度水肿。DiDP不同剂量组均可见不同程度的病理学损伤,且随着DiDP暴露剂量的升高,小鼠肾组织的病理损伤程度越明显,给予Vit E后,病理学改变得到一定程度的缓解,提示DiDP暴露所导致的小鼠肾损伤机制可能为氧化损伤,Vit E的抗氧化作用可改善DiDP所致的肾损伤。

ROS、MDA、GSH、8-OHdG是氧化应激反应的重要观测指标。研究表明,ROS的产生和抗氧化防御之间的不平衡会引起氧化应激,导致ROS对细胞的损害[19]。氧化应激进一步导致GSH耗竭、脂质过氧化、膜损伤、DNA链断裂以及蛋白酶、核酸酶和蛋白激酶的激活。本研究中随着DiDP暴露剂量的增加,肾组织的ROS、MDA和8-OHdG含量逐渐上升,GSH水平逐渐降低,这表明DiDP增加了各种组织和细胞的氧化应激水平和/或导致氧化损伤。

近年来相关研究结果证明,Vit E作为体内重要的抗氧化物质,在保护动物机体损伤、维持组织基本结构稳定等方面作用显著[20];另一方面,Vit E对氧化应激以及有害物质诱导的动物机体损伤具有保护作用。本研究中,Vit E处理组的ROS、MDA、8-OHdG等氧化应激指标呈下降趋势而GSH呈上升趋势,进一步证明DiDP所致的机体肾损伤机制可能与氧化应激有关。

由于本研究只是初步探讨了不同剂量的DiDP对雄性Balb/c小鼠肾脏的影响,以及可能的参与机制如氧化应激通路,至于DiDP导致机体损伤是否同时存在其他分子机制还有待进一步研究。综上,较高剂量的DiDP(≥ 15 mg/kg)可诱导小鼠肾组织产生过量ROS,破坏机体氧化与抗氧化平衡,使小鼠肾组织细胞抗氧化能力下降,继而造成肾组织的氧化损伤。而Vit E作为抗氧化剂,可通过拮抗ROS的产生,在一定程度上缓解DiDP所致的肾损伤,提示氧化应激可能是DiDP导致肾损伤的关键机制之一。

图 1

各实验组小鼠肾组织的病理学观察结果(×400,HE染色)

Figure 1

Pathological presentation of renal tissues of mice in different groups (×400, HE staining)

[注]蓝色箭头为肾小球,黄色箭头为肾小管;Δ为红细胞,▲为水肿。A:空白对照;B~E:0.15、1.5、15、150 mg/kg DiDP;F:100 mg/kg Vit E;G:150mg/kg DiDP+100mg/kg Vit E。 [Note] The blue arrow is renal glomerulus, and the yellow arrow is renal tubule; Δis red cell, ▲ is edema. A: Control; B-E: 0.15, 1.5, 15, 150mg/kg DiDP; F: 100mg/kg Vit E; G: 150mg/kg DiDP+100mg/kg Vit E.
图 2

各实验组小鼠血清CREA(A)和UREA(B)含量(n=7)

Figure 2

Serum CREA (A) and UREA (B) levels of mice in different groups

[注]与空白对照组比较,*:P< 0.05;**:P< 0.01。与联合处理组比较,#:P < 0.05;##:P < 0.01。1:空白对照;2~5:0.15、1.5、15、150mg/kg DiDP;6:100mg/kg Vit E;7:150mg/kg DiDP+100mg/kg Vit E。 [Note] Compared with the control group, *: P<0.05; **: P<0.01. Compared with the 150 mg/kg DiDP+100 mg/kg Vit E group, #: P < 0.05; ##: P < 0.01. 1: Control; 2-5: 0.15, 1.5, 15, 150 mg/kg DiDP; 6: 100 mg/kg Vit E; 7: 150mg/kg DiDP+100mg/kg Vit E.
图 3

各实验组小鼠肾ROS(A)、MDA(B)、GSH(C)和8-OHdG(D)含量(n=7)

Figure 3

ROS (A), MDA(B), GSH (C), and 8-OHdG (D) levels in renal tissues of mice in different groups

[注]与空白对照组比较,*:P < 0.05;**:P < 0.01。与联合处理组比较,#:P < 0.05;##:P < 0.01。1:空白对照;2~5:0.15、1.5、15、150 mg/kg DiDP;6:100mg/kg Vit E;7:150mg/kg DiDP+100mg/kg Vit E。 [Note] Compared with the control group, *: P < 0.05; **: P < 0.01. Compared with the 150 mg/kg DiDP + 100 mg/kg Vit E group, #: P < 0.05; ##: P < 0.01. 1: Control; 2-5: 0.15, 1.5, 15, 150mg/kg DiDP; 6: 100mg/kg Vit E; 7: 150mg/kg DiDP+100mg/kg Vit E.

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