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2019, 36(6):571-575.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2019.19081

百草枯对小鼠脾脏淋巴细胞的影响


复旦大学公共卫生学院 教育部公共卫生重点实验室, 上海 200032

收稿日期: 2019-02-21;  录用日期:2019-01-24;  发布日期: 2019-07-10

基金项目: 国家自然科学基金(81673202)

通信作者: 张玉彬, Email: yz001@fudan.edu.cn   周志俊, Email: zjzhou@fudan.edu.cn  

作者简介:

杨正丽(1993-), 女, 硕士生; E-mail:16211020029@fudan.edu.cn

伦理审批  已获取
利益冲突  无申报

[背景] 百草枯(PQ)是一种广泛使用的除草剂。目前的研究主要针对PQ的神经毒性。然而,PQ对外周免疫系统影响的研究尚不全面。

[目的] 观察PQ对外周免疫系统的影响,特别是对淋巴细胞数量、分化及活化状态的影响。

[方法] 6~8周龄SPF级雌性C57BL/6小鼠随机分为对照组、2 mg/kg PQ染毒1周组和2周组,每组8只小鼠。采用皮下注射方式染毒,染毒频率为每周一次,分别于染毒1、2周后取脾脏,用流式细胞术检测脾脏细胞和淋巴细胞数量,以及淋巴细胞分化和活化情况。

[结果] 与对照组相比,PQ染毒小鼠脾脏细胞的数量在第1周和第2周差异无统计学意义(P > 0.05);CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量在第1周和第2周差异亦无统计学意义(P > 0.05);B细胞的数量在第2周时高于对照组(t=-2.304,P < 0.05),在第1周时差异无统计学意义(P > 0.05)。与对照组相比,PQ在第2周时降低辅助性T细胞1(Th1细胞)(t=0.019,P < 0.05)和辅助性T细胞2(Th2细胞)(t=0.038,P < 0.05)占CD4+T细胞的比例,在第1周时无影响(P > 0.05);不影响辅助性T细胞17(Th17细胞)和调节性T细胞(Treg细胞)占CD4+T细胞的比例(P > 0.05)。此外,PQ在第2周时降低B细胞表面主要组织相容性复合体Ⅱ类分子I-A(t=0.047,P < 0.05)和B细胞表面抗原CD40(t=0.000,P < 0.01)的表达,不影响B细胞表面抗原CD86的表达(P > 0.05)。

[结论] PQ可增加B细胞数量,可以抑制CD4+T细胞向Th1和Th2方向分化,并抑制B细胞活化,提示PQ可以通过影响免疫细胞数量、分化和活化而引起免疫功能紊乱。

关键词: 百草枯;  免疫系统;  脾脏;  淋巴细胞;  分化;  活化 

百草枯(paraquat,PQ)是一种广泛使用的除草剂。流行病学研究发现,暴露于PQ可以增加神经退行性疾病的发病风险[1]。目前的研究主要针对PQ的神经毒性,尤其是对多巴胺能神经元的毒性[2-3],而关于PQ对外周免疫系统的影响尚缺乏系统全面的研究。目前已有的研究发现,PQ不影响胸腺的重量,但可以降低脾脏的重量,抑制脾脏细胞增殖,降低巨噬细胞的吞噬活性[4]。PQ亦可引起脾脏组织病理变化,降低自然杀伤(natural killer,NK)细胞的数量[5]。Hassuneh等[6]发现,高剂量PQ发挥免疫抑制的作用,但低剂量PQ可以增加白介素(interleukin,IL)-17B、IL-17C、IL-17E和IL-17F等炎症细胞因子释放。此外,Lim等[7]发现,PQ可以通过增加金属硫蛋白的表达进而降低NK细胞的活性,从而产生免疫抑制的作用。

免疫系统分非特异性免疫和特异性免疫。特异性免疫细胞主要包括CD4+T细胞、CD8+T细胞和B细胞。CD4+T细胞可以向辅助性T细胞1(Th1细胞)、辅助性T细胞2(Th2细胞)、辅助性T细胞17(Th17细胞)和调节性T细胞(Treg细胞)等亚群方向分化。Th1细胞可以通过活化巨噬细胞等来促进细胞介导的炎症反应[8]。Th2细胞可以通过促使IL-4和IL-10等细胞因子的产生来促进B细胞活化,从而促进体液免疫[9]。Th17和Treg细胞在自身免疫疾病中发挥重要作用[10]。若这些细胞数量或功能发生变化,机体的免疫平衡状态会被打破,导致疾病发生[11]

目前关于PQ对免疫细胞分化及活化的研究尚少。因此,本研究探讨PQ对脾脏细胞和淋巴细胞数量、CD4+T细胞分化功能以及B细胞活化功能的影响,为丰富PQ的免疫毒性及其机制的研究提供科学依据。

1   材料与方法

1.1   实验动物

SPF级雌性C57BL/6小鼠(6~8周龄,体重约20~25g)购于上海斯莱克实验动物有限责任公司(许可证号:2015000559939)。实验期间,小鼠饲养于复旦大学实验动物科学部,饲养条件为:温度22~25℃,湿度40%~60%,昼夜交替为12 h。本研究通过上海市食品药品检验所实验动物福利伦理审查。

1.2   动物分组与处理

将24只健康成年小鼠随机分为对照组、PQ染毒1周组和PQ染毒2周组,每组8只。采用皮下注射方式染毒。染毒组给予2 mg/kg PQ,对照组给予等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)。染毒频率为每周一次,分别于染毒1、2周后取脾脏,进行检测。本实验采用皮下注射的染毒方式,该方式可以模拟人通常接触PQ的方式,且可以准确控制染毒剂量[12]。本实验采用的染毒剂量和频率基于预实验结果以及文献[6],该文献报道,小鼠经口单次染毒2 mg/kg PQ即可对免疫指标产生影响。

1.3   实验试剂与仪器

主要试剂:PQ、伴刀豆球蛋白(concanavalin A,ConA)、植物血凝素(phytohemagglutnin,PHA)、PBS(Sigma,美国),胎牛血清、小牛血清、RPMI-1640培养基(Gibco,美国),抗小鼠CD16/32、抗小鼠CD3-异硫氰酸盐(fluorescein isothiocyanate,FITC)、抗小鼠CD3-藻红素(phycoerythrin,PE)-花青素(cyanine,Cy7)、抗小鼠CD4-别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)、抗小鼠CD8-PE、抗小鼠CD8-多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质(peridinin-chlorophyll-protein,PerCP)、抗小鼠CD19-PE-Cy7、抗小鼠CD86-太平洋蓝(pacifc blue,PB)、抗小鼠CD40-PE、抗小鼠主要组织相容性复合体II类(major histocompatibility complex class Ⅱ,I-A)- FITC、抗小鼠IL-17-FITC、抗小鼠GATA结合蛋白3(GATA binding protein-3,Gata3)-PE-Cy7、抗小鼠干扰素-γ(interferon-γ,IFNγ)-FITC、抗小鼠CD25-PE-Cy7、抗小鼠叉头螺旋转录因子p3(forkhead helix transcripton factor p3,Foxp3)-PE(Biolegend,美国)。

主要仪器:细胞计数仪(Nexcelom,美国),高速冷冻离心机(Beckman,美国),流式细胞仪(BD,美国)。

1.4   细胞处理与检测

1.4.1   脾脏细胞处理

在各时间点处死小鼠后,无菌剖腹取出脾脏并研磨,经细胞过滤筛过滤后,移至离心管中。493×g离心5 min后,弃上清,加入1 mL红细胞裂解液,室温静置5 min 40 s,加入10 mL含4%小牛血清的PBS终止裂解;经493×g离心5min后,弃上清,加入4mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬细胞,计数备用。

1.4.2   体外刺激脾脏细胞及检测

取重悬好的脾脏细胞,将细胞数调至相同,以每孔300μL铺于96孔板中,共铺3组,第1组用于检测Th17细胞,第2组用于检测Th1细胞和Th2细胞,第3组用于检测Treg细胞。往各孔加入ConA(50 μg/mL)和PHA(20 μg/mL)。然后将96孔板置于含5%CO2的37℃孵箱中培养48 h。取出96孔板,经493×g离心5 min,弃上清,每孔加入50 μL稀释好的抗小鼠CD16/32(1:1 000),冰上孵育20 min。经493×g离心5 min后,弃上清。于第1组中加入50 μL稀释好的抗小鼠CD3-PE-Cy7(1:266)、抗小鼠CD4-APC(1:266)和抗小鼠CD8-PerCP(1:333)的混合液,于第2组中加入50 μL稀释好的抗小鼠CD4-APC(1:266)和抗小鼠CD8-PerCP(1:333)的混合液,于第3组中加入50 μL稀释好的抗小鼠CD4- APC(1:266)、抗小鼠CD8-PerCP(1:333)和抗小鼠CD25-PE-Cy7(1:266)的混合液,冰上避光30 min。493×g离心5 min后,弃上清,固定破膜,室温避光60 min。493×g离心5 min后,弃上清,于第1组中加入50 μL稀释好的抗小鼠IL-17-FITC(1:200),于第2组中加入50μL稀释好的抗小鼠Gata3-PE-Cy7(1:100)和抗小鼠IFNγ-FITC(1:200)的混合液,于第3组中加入50 μL稀释好的抗小鼠Foxp3-PE(1:100),室温避光120 min。493×g离心5 min后,弃上清,用破膜的稀释液洗涤一遍,493×g离心5 min后,弃上清,每孔加入200 μL简单清洗液用于重悬细胞,流式细胞仪进行检测。

1.4.3   淋巴细胞数量及活化检测

取上述剩下的脾脏细胞悬液,以每孔200 μL铺于96孔板中,共铺2组,第1组用于检测CD4+T细胞和CD8+T细胞,第2组用于检测B细胞和B细胞的活化指标I-A、CD40和CD86。经493×g离心5 min后,弃上清,每孔各加入50 μL稀释好的抗小鼠CD16/32(1:1 000),冰上孵育20 min。经493×g离心5 min后,弃上清,于第1组中加入50 μL稀释好的抗小鼠CD3-FITC(1:400)、抗小鼠CD4-APC(1:400)和抗小鼠CD8-PO(1:300)的混合液,于第2组中加入50 μL稀释好的抗小鼠CD19-PE-Cy7(1:800)、抗小鼠CD86-PB(1:400)、抗小鼠CD40-PE(1:400)和抗小鼠I-A-FITC(1:400)的混合液,冰上避光30 min。493×g离心5 min后,弃上清,用PBS洗涤一遍,493×g离心5 min后,弃上清,每孔加入200 μL 1%多聚甲醛固定细胞,用流式细胞仪进行检测。

1.5   统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计分析,计量资料采用均数±标准差表示。对照组与染毒组间比较采用单因素方差分析。根据方差齐性结果,如果方差齐,两两比较采用LSD-t检验;如果方差不齐,两两比较则采用Dunnet-t检验。检验水准为α=0.05。

2   结果

2.1   一般情况

PQ染毒期间,染毒组和对照组小鼠精神状态、毛色、行为活动和皮肤未见异常,眼耳鼻和其他腔道未见异常分泌物。各组小鼠的食物摄入量和水消耗量无差异,体重增长亦无差异。染毒期间未见小鼠死亡。

2.2   PQ对小鼠脾脏细胞和淋巴细胞数量的影响

与对照组相比,染毒组小鼠脾脏细胞的数量差异无统计学意义(P > 0.05)。PQ在第1周时不影响B细胞的数量,但在第2周时可增加B细胞的数量(t=-2.304,P < 0.05);PQ不影响CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量(图 1)。

图 1

百草枯对小鼠脾脏细胞和淋巴细胞数量的影响

[注] *:与对照组相比,P < 0.05。

2.3   PQ对小鼠脾脏中CD4+T细胞分化功能的影响

与对照组相比,Th1细胞占CD4+T细胞的比例在PQ染毒第1周时无明显变化(P > 0.05),在PQ染毒第2周时低于对照组(t=0.019,P < 0.05)。Th2细胞占CD4+T细胞的比例在PQ染毒第1周时与对照组相比差异无统计学意义(P > 0.05),在第2周时低于对照组(t=0.038,P < 0.05)。与对照组相比,PQ染毒第1周和第2周时Th17细胞和Treg细胞占CD4+T细胞的比例差异无统计学意义(P > 0.05)(图 2)。

图 2

百草枯对CD4+T细胞分化功能的影响

[注] *:与对照组相比,P < 0.05。

2.4   PQ对B细胞活化的影响

经PQ染毒后,I-A的表达在第1周无明显变化(P > 0.05),在第2周时低于对照组(t=0.047,P < 0.05)。B细胞表面CD40的表达在PQ染毒第1周时低于对照组(t=0.043,P < 0.05),在PQ染毒第2周时亦低于对照组(t=0.000,P < 0.01)。B细胞表面CD86的表达无明显变化(P> 0.05)(图 3)。

图 3

百草枯对B细胞活化的影响

[注] *:与对照组相比,P < 0.05;**:与对照组相比,P < 0.01。

3   讨论

PQ与土壤接触后迅速钝化,无大气污染和残留,对周围环境无害,而被广泛使用[13-14]。然而PQ对人类与动物有高毒性[6],因此其对身体造成的危害不容忽视。

免疫细胞的数量在一定程度上可以反映机体的免疫功能。脾脏是重要的免疫器官,因此本研究观察了小鼠脾脏细胞的数量,发现PQ不影响脾脏细胞的数量。Riahi等[4]也有类似的发现,给予Balb/c小鼠腹腔注射1 mg/kg PQ连续21 d后,发现PQ并不影响小鼠脾脏细胞的数量,此外,PQ可以降低小鼠CD4+T细胞的数量,但不影响CD8+T细胞的数量;在临床研究中发现,服用PQ剂量大于10 mL(PQ 20%的水溶剂)的患者即PQ中重度中毒患者CD4+T细胞的数量明显减少,而CD8+T细胞的数量不受影响[15-16]。本研究发现PQ不影响CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量,表明CD4+T细胞的数量不是PQ造成外周免疫系统损伤的敏感指标,只有PQ对机体造成中重度损伤时,CD4+T的数量方有变化。此外,本研究发现PQ可以增加小鼠脾脏中B细胞的数量。在蒋白丽等[16]的临床研究中亦有类似的发现,PQ中毒患者外周血B细胞水平升高。以上结果提示B细胞的数量可以作为PQ造成外周免疫系统损伤的一个敏感指标。

辅助性T细胞是直接反映机体免疫功能的物质之一[17]。因此,本研究观察了PQ对Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞和Treg细胞这四个亚群的影响,发现PQ可以抑制CD4+T细胞向Th1细胞和Th2细胞方向分化,但不影响CD4+T细胞向Th17细胞和Treg细胞方向分化。Riahi等[4]的研究亦有类似的发现,PQ可以降低IFNγ和IL-4的水平。IFNγ和IL-4是由Th1细胞和Th2细胞分泌而来,这两种因子水平的降低,说明PQ抑制了CD4+T淋巴细胞向Th1细胞和Th2细胞方向分化。因此推测,PQ可以影响辅助性T细胞,造成机体的免疫功能紊乱。

B细胞是机体重要的免疫细胞之一,在免疫应答过程中发挥重要的作用,其异常活化或功能改变均提示机体免疫功能的紊乱[18]。在本研究中,PQ抑制B细胞表面CD40和I-A的表达。CD40和I-A这两种分子水平的降低,提示B细胞活化受到抑制。CD40可以与T细胞表面CD40L相互作用,在体液免疫中发挥重要作用。PQ降低了CD40的水平,提示PQ可以抑制体液免疫[19]。I-A的生物学功能是参与抗原加工与呈递[20]。在本研究中PQ降低了I-A的水平,提示PQ可以抑制B细胞的抗原提呈功能,进一步说明PQ抑制免疫应答。

综上所述,PQ可增加B细胞数量,抑制CD4+T细胞向Th1和Th2方向分化,并抑制B细胞活化,提示PQ可影响正常的免疫应答,导致机体免疫功能紊乱。这为深入研究PQ的免疫毒性机制提供了理论依据。

图 1

百草枯对小鼠脾脏细胞和淋巴细胞数量的影响

Figure 1 [注] *:与对照组相比,P < 0.05。
图 2

百草枯对CD4+T细胞分化功能的影响

Figure 2 [注] *:与对照组相比,P < 0.05。
图 3

百草枯对B细胞活化的影响

Figure 3 [注] *:与对照组相比,P < 0.05;**:与对照组相比,P < 0.01。

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