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2018, 35(11):1025-1030.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2018.18431

PC12细胞铝染毒后代谢型谷氨酸受体1在PKC和NMDAR表达中的调控作用


山西医科大学公共卫生学院劳动卫生学教研室, 山西 太原 030001

收稿日期: 2018-06-30;  发布日期: 2018-12-06

基金项目: 国家自然科学基金重点项目(编号:81430078)

通信作者: 牛侨, Email: niuqiao55@163.com  

作者简介: 王翡(1993-), 女, 硕士生; 研究方向:铝的神经毒性; E-mail:

[目的] 探讨激动和抑制代谢型谷氨酸受体1(mGluR1)蛋白表达对麦芽酚铝染毒的大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株(PC12)蛋白激酶C(PKC)及N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)表达的影响。

[方法] 取对数生长期PC12细胞,分为空白对照组(正常PC12细胞)、激动剂组(100 μmol/L mGluR1激动剂)、抑制剂组(100 μmol/L mGluR1抑制剂)、麦芽酚铝染毒组(200 μmol/L麦芽酚铝)、染铝+激动剂组(100 μmol/L mGluR1激动剂+200μmol/L麦芽酚铝)、染铝+抑制剂组(100 μmol/L mGluR1抑制剂+200 μmol/L麦芽酚铝),染毒时间为24 h。采用实时荧光定量PCR法测定各组PC12细胞中PKCNMDAR亚基的mRNA表达水平;采用Western blot法测定各组PC12细胞中PKC及NMDAR亚基的蛋白表达水平;采用ELISA法测定各组PC12细胞的PKC酶活性。

[结果] 与空白对照组相比,麦芽酚铝染毒组的PKCNMDAR1NMDAR2ANMDAR2B mRNA表达水平分别下降39%、21%、38%和26%,差异有统计学意义(P < 0.05),其蛋白表达水平分别下降39%、31%、41%和46%,差异有统计学意义(P < 0.05)。染铝+抑制剂组的NMDAR1 mRNA和蛋白表达与麦芽酚铝染毒组相比分别上调32%和36%(P < 0.05);与麦芽酚铝染毒组相比,染铝+抑制剂组NMDAR2B mRNA表达下调46%,染铝+激动剂组NMDAR2B蛋白表达上调95%,差异有统计学意义(P < 0.05)。与对照组相比,麦芽酚铝染毒组PKC酶活性下降56%,而染铝+激动剂组PKC酶活性相对于麦芽酚铝染毒组上调116%(P < 0.05)。

[结论] 麦芽酚铝可以抑制PC12细胞的PKCNMDAR各亚基的mRNA和蛋白表达;麦芽酚铝可通过mGluR1调节NMDAR表达和PKC酶活性;mGluR1对NMDAR的调节主要作用于NMDAR1和NMDAR2B。

关键词: 麦芽酚铝;  mGluR1激动;  mGluR1抑制;  PKC;  NMDAR 

自19世纪以来,人类暴露于各种高浓度金属毒物中,其中就包括铝[1]。近年来,铝是否为阿尔茨海默病的独立危险因素仍然存在争议,但高浓度的铝暴露能够引起认知功能损害却是学界公认的事实[2]。在铝的神经毒性中,铝致神经元的突触可塑性改变一直是研究的热点。研究表明,铝可经消化道、呼吸道等途径吸收入血并透过血脑屏障蓄积于大脑海马体,通过影响N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methy-D-aspartate receptor,NMDAR)和代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptors,mGluR)的表达而影响神经元突触可塑性[3-4]。O’CONNOR等[5]发现NMDAR和mGluR可以双向调节突触可塑性。另有研究表明,mGluR1对NMDAR的调节作用主要依赖于蛋白激酶C(PKC)- Src信号通路[6],但是在铝致突触可塑性改变中mGluR调节NMDAR是否依赖PKC还未知。本研究通过分析mGluR1的激动和抑制对染铝PC12细胞PKC和NMDAR各亚基表达的影响来初步阐明mGluR在PKC和NMDAR表达中的调控作用。

1   材料与方法

1.1   仪器和试剂

高糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM,赛默飞世尔科技公司,美国);标准胎牛血清、D-Hanks液(武汉博士德生物工程有限公司,中国);麦芽酚、(S)-3,5-二羟基苯基甘氨酸水合物[(S)-3,5-dihydroxyphenylglycine hydrate,DHPG]和(±)-α-甲基-(4-羧基苯基)甘氨酸[(±)-α-methyl-(4-carboxyphenyl)glycine,MCPG](纯度分别为99%、98%、98%,Sigma-Aldrich公司,美国);三氯化铝(纯度为97.00%,天津市风船化学试剂科技有限公司,中国);青链霉素混合液、Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞增殖-毒性检测试剂盒、胰蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司,中国);mGluR1PKCNMDAR1NMDAR2ANMDAR2B引物、总RNA提取试剂Trizol、哺乳动物蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、蛋白示踪上样缓冲液(还原型,5×)、SDSPAGE凝胶制备试剂盒、高灵敏度化学发光检测试剂盒、抗GAPDH鼠单克隆抗体、山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG(北京康为世纪生物科技有限公司,中国);反转录试剂盒(5×Prime Script RT Master Mix试剂)、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(TaKaRa生物工程有限公司,日本);PKC抗体(Abcam公司,美国);NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B抗体(GeneTex公司,美国);PKC Kinase Activity Ki(t Enzo Biochem公司,美国)。

Bio Tek酶标仪(伯腾仪器有限公司,美国);实时荧光定量聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)仪(赛默飞世尔科技公司,美国);Biospectrometer fluorescence分光光度计(Eppendorf,德国);二氧化碳恒温培养箱(Heraeus公司,德国);倒置荧光数码显微镜(奥林巴斯公司,日本)。

1.2   细胞培养及染毒

大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株(PC12)在37℃恒温、饱和湿度的CO2(5%)细胞培养箱培养,DMEM细胞完全培养液包含10%的胎牛血清、100U/mL的青霉素、100 μg/mL的链霉素,隔天用2.5 g/L的胰酶消化后进行传代。

本课题组前期研究结果发现,麦芽酚铝中剂量染毒组(200 μmol/L)PC12细胞活力为70%~80%,且产生明显神经毒作用[7]。本研究预实验结果发现100μmol/L DHPG和MCPG分别作用于PC12细胞24 h,细胞活力可维持在90%以上,其本身的化学毒性可忽略不计,且干扰效力明显。故实验取生长良好的对数生长期PC12细胞分为空白对照组、激动剂组、抑制剂组、麦芽酚铝染毒组、染铝+激动剂组和染铝+抑制剂组,其中麦芽酚铝染毒剂量为200 μmol/L,激动剂和抑制剂染毒剂量为100μmol/L,染毒时间为24h。

1.3   实时荧光定量PCR

采用Trizol法提取细胞总RNA,使用BioSpectrometer fluorescence分光光度计测定样品总RNA的纯度及浓度。使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix进行反转录得到cDNA产物,反转录反应条件:65℃ 5 min预变性,37 ℃ 15min,50 ℃ 5min,98 ℃ 5min;使用SYBR® Green Realtime PCR Master Mix进行反转录(RT)-PCR,RT-PCR反应条件(两步法):95℃ 60s,1个循环;95℃ 5s,60℃ 30s,40个循环;95℃ 60s,65℃ 30s,95℃ 1s,1个循环。每个样品做3个复孔,各样品Ct值经内参基因GAPDH标化后,根据2-ΔΔCt公式计算各组PKCNMDAR1NMDAR2ANMDAR2B mRNA的相对表达量。

表1

引物序列

1.4   Western blot

细胞样品总蛋白的提取按照哺乳动物蛋白抽提试剂盒说明书进行,BCA蛋白定量法测各组蛋白浓度,加入蛋白示踪上样缓冲液,充分混匀,沸水浴5 min,冷却至室温。取约80 μg总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶60 V恒压垂直电泳130 min,后湿转至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。用5%脱脂奶粉室温封闭2 h后,加入一抗(一抗稀释比例分别为:GAPDH,1:3000;PKC,1:1 000;NMDAR1,1:500;NMDAR2A,1:500;NMDAR2B,1:500),4℃过夜。次日TBST漂洗8 min×5次,加入二抗(二抗稀释比例均为1:3 000),37℃孵育2 h,TBST漂洗8 min×5次。用Universal Hood Ⅱ凝胶成像仪进行检测,用Quantity One-4.6.5软件进行灰度值的分析。

1.5   ELISA

按照哺乳动物蛋白抽提试剂盒说明书提取总蛋白,采用BCA蛋白定量法测定各组蛋白浓度并调至同一浓度。按照PKC Kinase Activity Kit分别设阳性对照和空白对照,操作步骤与试剂盒说明书一致,在波长450 nm处测定吸光度值。按照说明书计算方法计算出各组PC12细胞的PKC相对活性,即每微克总蛋白中活性PKC的量(ng/μg)。

1.6   统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料以x±s表示,经正态性检验和方差齐性检验,不同组间均数比较采用单因素方差分析,多组间两两比较采用LSD法,方差不齐时采用Games-Howell检验。检验水准以α=0.05。

2   结果

2.1   mGluR1激动和抑制对染铝PC12细胞PKC mRNA表达的影响

与对照组相比,麦芽酚铝染毒组、染铝+激动剂组和染铝+抑制剂组的PKC mRNA表达分别下降39%、45%和38%(均P < 0.05),而染铝+激动剂组和染铝+抑制剂组的PKC mRNA表达同麦芽酚铝染毒组相比,差异没有统计学意义。

2.2   mGluR1激动和抑制对染铝PC12细胞NMDAR各亚基mRNA表达的影响

与对照组相比,麦芽酚铝染毒组、染铝+激动剂组和染铝+抑制剂组的NMDAR2ANMDAR2B mRNA表达分别下降38%、31%、35%和26%、32%、60%,麦芽酚铝染毒组和染铝+激动剂组的NMDAR1 mRNA表达分别下降21%、32%,差异有统计学意义(P < 0.05)。与麦芽酚铝染毒组相比,染铝+抑制剂组NMDAR1 mRNA表达上调32%,而NMDAR2B则下调46%,差异有统计学意义(P < 0.05),见表 2

表2

各组PC12细胞NMDAR各亚基mRNA表达的改变(x±sn=3,2-ΔΔCt

2.3   mGluR1激动和抑制对染铝PC12细胞PKC蛋白表达的影响

与对照组相比,麦芽酚铝染毒组、染铝+激动剂组和染铝+抑制剂组的PKC蛋白表达分别下降39%、48%、51%(P < 0.05),而染铝+激动剂组和染铝+抑制剂组的PKC蛋白表达同麦芽酚铝染毒组相比,差异没有统计学意义。见图 1

图 1

各组PC12细胞PKC蛋白表达的改变

2.4   mGluR1激动和抑制对染铝PC12细胞NMDAR各亚基蛋白表达的影响

与对照组相比,麦芽酚铝染毒组NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B蛋白表达分别下降31%、41%、46%,差异有统计学意义(P < 0.05)。与麦芽酚铝染毒组相比,染铝+抑制剂组NMDAR1蛋白表达上调36%,染铝+激动剂组NMDAR2B蛋白表达上调95%,差异有统计学意义(P < 0.05),见图 2

图 2

各组PC12细胞NMDAR各亚基蛋白表达的改变

2.5   mGluR1激动和抑制对染铝PC12细胞PKC酶活性的影响

空白对照组PC12细胞PKC酶活性为(153.85± 9.87)ng/μg,麦芽酚铝染毒组PC12细胞PKC酶活性为(67.64±8.34)ng/μg,与对照组相比,麦芽酚铝染毒组PKC酶活性下降56%(P < 0.05);而染铝+激动剂组PC12细胞PKC酶活性为(145.91±28.44)ng/μg,染铝+抑制剂组PC12细胞PKC酶活性为(81.25±18.30)ng/μg,相对于麦芽酚铝染毒组,染铝+激动剂组PC12细胞PKC酶活性上调116%(P < 0.05),染铝+抑制剂组PC12细胞PCK酶活性与麦芽酚铝染毒组的差异无统计学意义。

3   讨论

PC12因其与神经元相似的形态、生理和生化功能而被广泛应用于各种神经系统毒物毒作用机制的研究中[8-9],临床上也常应用PC12细胞研究各种神经系统疾病的发病机制[8, 10]。本课题组前期对铝致PC12细胞神经毒性的作用剂量及作用时间进行了探索,发现麦芽酚铝在较低剂量即对PC12细胞产生明显的剂量依赖性毒作用,且麦芽酚铝是呈电中性的铝化合物,在pH值为3.0~10.0时理化特性较为稳定,因此采用麦芽酚铝作为染铝剂比其他铝化合物更具有优势。中剂量染毒组即200 μmol/L剂量组细胞活力为70%~80%,且会对细胞产生明显神经毒作用[7]。故本研究采用PC12细胞作为研究对象,麦芽酚铝作为PC12细胞的铝染毒剂,200μmol/L作为麦芽酚铝染毒剂量。

DHPG和MCPG分别作为mGluR1的激动剂和抑制剂在研究中应用广泛[11-13]。据文献报道,DHPG和MCPG的作用浓度为100μmol/L时,分别会对mGluR1产生明显的激动和抑制作用[14-15]。本研究前期预实验结果发现,100 μmol/L的DHPG和MCPG分别作用于PC12细胞,细胞活力可维持在90%以上,其本身的化学毒性可忽略不计。故本研究采用DHPG和MCPG分别作为mGluR1的激动剂和抑制剂,干扰剂量均为100μmol/L。

近年来,多项研究表明PKC在突触可塑性和长时程增强(long-term potentiation,LTP)的形成中发挥重要作用[16],PKC的激活是LTP产生的重要条件[17]。NMDAR在兴奋性突触功能中发挥作用,LTP的产生依赖于NMDAR的激活[18]。研究发现PKC可以解除Mg2+对NMDAR通道的阻滞,使Ga2+内流增多,经过一系列级联反应最终引起突触可塑性的改变[19-20]。mGluR属于G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCR),能够调节中枢神经系统功能,介导神经元信号转导[21],文献报道称Ⅰ组mGluRs介导的NMDAR活性增强,在突触传递和突触可塑性以及LTP形成过程中起重要作用[22]。有文献提出Ⅰ组mGluRs通过PKC信号通路调节NMDAR功能,PKC是Ⅰ组mGluRs和NMDAR相互作用的关键因素[23]

本课题组前期研究发现,职业性铝暴露可能影响工人的记忆功能,外周血淋巴细胞中NMDAR的亚基NR1和NR2A的表达与认知功能指数相关[24]。动物实验发现[25-26],铝会通过影响NMDAR的表达进而影响大鼠的学习记忆功能。这与本研究麦芽酚铝可以抑制NMDAR表达的结果一致。同时本研究发现麦芽酚铝暴露抑制了NMDAR各亚基的mRNA和蛋白表达,其中受mGluR1调控的主要是NMDAR1和NMDAR2B,且对二者的调控机制不同,mGluR1对NMDAR2B起正向调控作用,而对NMDAR1起负向调控作用。

KRIEGER等[27]对八目鳗运动神经元的研究发现Ⅰ组mGluRs增强NMDAR的作用,而PKC抑制剂则无此作用,说明在此条件下NMDAR和Ⅰ组mGluRs的相互作用不依赖于PKC,而本研究发现激动和抑制mGluR1没有影响PKC的基因和蛋白表达,激动mGluR1使PKC的酶活性显著增强,但抑制mGluR1尚未发现PKC的酶活性有显著差异。提示mGluR1对PKC的调节作用可能为单向的,而PKC作为一种丝/苏氨酸蛋白激酶,其被Ⅰ组mGluRs激活可能仅仅表现于酶活性的增强而不导致基因和蛋白表达的增加。

本研究分别从基因、蛋白以及酶活性分析了mGluR1的激动和抑制对染铝PC12细胞PKC和NMDAR各亚基表达的影响,发现麦芽酚铝通过mGluR1调节NMDAR表达和PKC酶活性,而mGluR1对NMDAR表达的调控作用是否依赖PKC的参与仍有待进一步深入研究。

表1

引物序列

Table 1
表2

各组PC12细胞NMDAR各亚基mRNA表达的改变(x±sn=3,2-ΔΔCt

Table 2
图 1

各组PC12细胞PKC蛋白表达的改变

Figure 1 [注]A:空白对照组;B:激动剂组;C:抑制剂组;D:麦芽酚铝染毒组;E:染铝+激动剂组;F:染铝+抑制剂组。*:与麦芽酚铝染毒组比较,P < 0.05;a:与空白对照组比较,P < 0.05。
图 2

各组PC12细胞NMDAR各亚基蛋白表达的改变

Figure 2 [注]A:空白对照组;B:激动剂组;C:抑制剂组;D:麦芽酚铝染毒组;E:染铝+激动剂组;F:染铝+抑制剂组。*:与麦芽酚铝染毒组比较,P < 0.05;a:与空白对照组比较,P < 0.05。

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[基金项目] 国家自然科学基金重点项目(编号:81430078)

[作者简介] 王翡(1993-), 女, 硕士生; 研究方向:铝的神经毒性; E-mail: wflxs55@163.com

[收稿日期] 2018-06-30 00:00:00.0

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