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2018, 35(12):1083-1088.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2018.18394

AMPA受体棕榈酰化在亚慢性铝染毒大鼠海马长时程增强中的作用


山西医科大学公共卫生学院, 山西 太原 030001

收稿日期: 2018-06-09;  发布日期: 2019-01-07

基金项目: 山西医科大学博士启动基金(编号:03201413)

通信作者: 宋静, Email: sj4933749@126.com  

作者简介: 夏欣宇(1992-), 女, 硕士生; 研究方向:化学物的神经毒性; E-mail:

[目的] 研究α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体棕榈酰化修饰在亚慢性铝染毒在大鼠海马长时程增强(LTP)中的作用。

[方法] 健康成年雄性SD大鼠24只,按体重相近者随机分为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组6只,采用腹腔注射麦芽酚铝的方式对大鼠进行染毒,对照组给予生理盐水,低、中、高剂量组的铝染毒剂量分别为10、20、40 μmol/kg,隔天染毒,共染毒12周。染毒结束后采用在体海马CA1区LTP记录技术,记录兴奋性突触后电位,然后断头取海马,采用酰基生物素置换法测定AMPA受体棕榈酰化水平。

[结果] LTP检测结果显示,高频刺激后1 min和60 min时,各剂量组的标准化幅值(后简称“幅值”)差异有统计学意义(P < 0.05);30 min时差异无统计学意义。1 min时,中、高剂量组的幅值低于对照组和低剂量组,差异均有统计学意义(P < 0.05)。60 min时,低、中、高剂量组的幅值均低于对照组,且高剂量组的幅值低于低、中剂量组,差异均有统计学意义(P < 0.05)。酰基生物素置换法结果显示,中、高剂量组的离子型谷氨酸受体1(GluR1)低于对照组,差异有统计学意义(P < 0.05);中剂量组的离子型谷氨酸受体2(GluR2)棕榈酰化水平低于对照组,高剂量组的GluR2棕榈酰化水平低于对照组及低、中剂量组,差异均有统计学意义(P < 0.05)。

[结论] 亚慢性铝染毒后,大鼠海马LTP受到抑制,AMPA受体棕榈酰化水平降低,这提示AMPA受体棕榈酰化降低可能是LTP损害的机制之一。

关键词: 铝;  长时程增强;  棕榈酰化;  AMPA受体;  GluR1;  GluR2 

铝是地壳中含量最丰富的金属元素,在生产中可作为飞机、船舶、车辆的结构材料,生活中还应用于餐具、药物、化妆品及食物中。随着铝的广泛使用,铝的神经毒性也得到越来越多的关注,有研究表明,铝可蓄积于人体脑组织,从而引起认知功能损害,其典型表现为学习与记忆功能下降[1-2]。长时程增强(longterm potentiation,LTP)是指在较高频率的强直刺激后,发生在神经细胞信号传输中持久的增强现象,其作用的改变与学习记忆密切相关。LTP增加会促进学习记忆能力,而LTP减弱会导致学习记忆能力的下降,是研究学习与记忆功能在突触水平的经典模型。本课题组及国内外学者的研究结果都已证实铝对LTP的诱导和维持具有损害作用[3-5],目前对于铝损害LTP的研究主要集中在谷氨酸受体上。

α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体是一种离子型谷氨酸受体,有文献表明,AMPA受体与LTP和突触可塑性的发生密切相关[6-8],突触后膜AMPA受体数目的改变是LTP的一种最主要的表达机制[6, 9]。随着国际上对AMPA受体运输机制的深入研究,以及实验技术的进步,发现蛋白质的棕榈酰化修饰在AMPA受体运输中发挥着重要作用。棕榈酰化修饰是一种很普遍且唯一可逆的翻译后脂质修饰形式,可增加蛋白质的疏水性,对蛋白质的转运,细胞器定位和功能具有重要的作用,能赋予蛋白质多种生理功能[10],棕榈酰化广泛存在于神经系统中,与多种神经退行性疾病和学习记忆有关[11]。而AMPA受体棕榈酰化在突触后运输和兴奋性递质释放具有重要作用[12],与突触可塑性以及LTP的发生密切相关[13-14]。本次研究亚慢性铝染毒对AMPA受体亚单位离子型谷氨酸受体1、2(GluR1、GluR2)棕榈酰化修饰水平和LTP的影响,为LTP损害的机制研究提供新思路。

1   材料与方法

1.1   实验动物及分组

健康雄性清洁级SD大鼠24只,购于山西医科大学实验动物中心,按体重相近者随机分为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组6只。

1.2   染毒方法

采用腹腔注射的方法对大鼠进行染毒,按照0.1 mL/100 g体积注射,对照组给予生理盐水,低、中、高剂量组按LIANG等[15]方法分别给予麦芽酚铝10、20、40 μmol/kg,隔天注射,共注射12周。染毒期间,所有大鼠给予普通饲料,自由饮水和进食。

1.3   主要试剂与仪器

麦芽酚及氯化铝、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)、羟胺(hydroxylamine,HAM)、N-乙基顺丁二酰亚胺(N-ethylmaleimide,NEM)(Sigma,美国),牛血清白蛋白(albumin from bovine serum,BSA)、非变性组织细胞裂解液(Solarbio,中国),聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量试剂盒、组织蛋白酶抑制剂、高灵敏度化学发光检测试剂盒、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG、上样缓冲液(北京康为世纪生物科技有限公司,中国),BMCC-Biotin(1-biotinamido)-4[-4'-(maleimidomethyl)cyclohexanecarboxamido]butane、1-生物素酰氨基-4[-4'(-甲基马来酰胺)环己烷甲酰胺]丁烷)、链霉亲和素抗体、蛋白印迹膜再生液(Thermo scientific,美国),GluR1单克隆抗体(Millipore,美国),GluR2单克隆抗体(Abcam,美国),琼脂糖珠(Santa Cruz biotechnology,美国),大鼠脑立体定位仪(Narishige,日本),刺激器(2100)放大器(3000) (A-M System,美国),高速数据采集系统(Micro 1401,CED,英国),同心圆刺激电极、金属记录电极(FHC,美国),超声波破碎仪(Sonics&material,美国),离心机(Eppendorf,德国),电泳仪、凝胶成像仪(Bio-Rad,美国)。

1.4   大鼠LTP的检测

染毒结束后,将大鼠用乌拉坦(1.5 g/kg)麻醉后,固定于三维脑立体定位仪上,剪开头部皮肤,暴露颅骨,以前囟点和矢状缝为基准,用颅骨钻钻孔备用。刺激电极尖端定位在海马Schaffer侧支处,标记坐标点为前囟后4.2 mm、中线右侧旁开3.8 mm,记录电极尖端定位在CA1区放射层,坐标为前囟后3.8 mm、中线右侧旁开2.9 mm。使用微推进装置插入电极,找到预定的记录部位后,开始记录30 min的基础波。基础波的刺激频率为0.033 Hz(即每30 s给1次刺激),刺激强度为引起最大兴奋性突触后场电位(field excitatory post-synaptic potential,fEPSP)幅值的50%。然后给予诱发LTP的高频刺激,三个串刺激,串间隔30 s,每串刺激包含20个脉冲,频率200 Hz,波宽100 μs,高频刺激后继续记录基础波60 min。观察高频刺激前后fEPSP幅值的变化以确定LTP的产生。

1.5   GluR1、GluR2棕榈酰化修饰的检测

GluR1、GluR2棕榈酰化修饰的检测采用酰基生物素置换法[16]。电生理实验结束后,断头取海马,称取对照组和低、中、高剂量组各50 mg海马组织置于冰上,加入400 μL的含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液与2 mol/L的NEM混合溶液,冰上超声粉碎15 s,静置30 min后于4℃,12 000×g,离心20 min,收集上清,BCA法定量蛋白浓度,将所有剂量组的蛋白调整到同一浓度,每个样品中加入5~10 μL目标蛋白一抗,4℃摇床过夜。然后吸弃上清,加入300 μL的琼脂糖珠,4℃摇床孵育3 h。于4℃,1×g,离心1 min,弃去上清,加入600 μL的裂解缓冲液与10 mmol/L的NEM混合溶液,冰上孵育10 min。每个剂量组分别取300 μL作为HAM阴性组,标记为“HAM-”,另外的300 μL作为HAM阳性组,标记为“HAM+”,每个样品中加入500μL stringent buffer(2 mol/L NEM 25 μL+SDS 0.005 g+裂解缓冲剂5 mL)进行洗涤,然后加入500 μL pH=7.2的裂解缓冲液洗涤三次。同时配制1 mol/L HAM溶液,取66 μL HAM加入2 mL pH=7.2的裂解缓冲剂,混匀后每个阳性样品中加入500 μL,阴性样品中加入pH=7.2的裂解缓冲液,室温摇床孵育50 min,弃去上清。用pH=6.2的裂解液轻柔洗涤所有样品,弃去上清,每个样品加入5 μmol/L的BMCC-Biotin 500 μL,4℃摇床孵育50 min,用pH=6.2的裂解液轻轻洗涤所有样品一次。然后用pH=7.5的裂解液轻柔洗涤样品3次,弃上清,留下管底的琼脂糖珠。每个样品中加入15~30 μL,5倍的上样缓冲液,涡旋震荡使珠子与缓冲液充分混匀,100℃煮样5 min。室温冷却后于12 000×g离心3 min。取上清凝胶电泳。电泳结束后,400 mA恒压下将分离胶上的蛋白转至PVDF膜上,用5%BSA室温封闭1 h后,加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素抗体,4℃孵育过夜。用TBST洗膜10 min,3次。涂抹发光液,用Bio-Rad凝胶成像仪进行成像和拍照,Quantity One4.6.5软件进行读数。棕榈酰化测定结束后,用蛋白印迹膜再生液室温摇床洗膜5 min,TBST洗膜10 min,用5%BSA室温封闭PVDF膜1 h。然后将膜浸泡在相应的一抗中4℃过夜。TBST洗膜10 min,3次后,将条带在相应的二抗中37℃孵育2 h。TBST洗膜10 min,3次。配制发光液,用Bio-Rad凝胶成像仪进行检测,用Quantity One4.6.5进行读数,计算各个剂量组GluR1、GluR2棕榈酰化分别与其蛋白的比值表示棕榈酰化水平。

1.6   统计学分析

用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析。经正态性检验,所有数据服从正态分布。连续型变量以均数±标准差表示;四组比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法。检验水准为双侧α=0.05。

2   结果

2.1   一般情况

染毒期间,对照组、低剂量组大鼠饮食饮水正常,生长状态良好;中、高剂量组大鼠后期摄食量减少,体重增加缓慢,活动量减少。

2.2   亚慢性铝染毒对大鼠海马LTP的影响

大鼠海马LTP的检测结果如图 1所示,在高频刺激后,各组大鼠的fEPSP幅值(后简称“幅值”)瞬间增大,但随着时间推移,各组大鼠幅值均呈现下降的趋势。如表 1所示,高频刺激后1 min,各剂量组幅值差异有统计学意义,中、高剂量组幅值低于对照组和低剂量组(P < 0.05)。高频刺激后30 min,各剂量组幅值差异无统计学意义(P > 0.05)。高频刺激后60 min,低、中、高剂量组的幅值均低于对照组(P < 0.05),且高剂量组的幅值低于低、中剂量组,差异均有统计学意义(P < 0.05)。

图 1

不同剂量亚慢性铝染毒大鼠LTP检测结果

表1

不同时间点各组亚慢性铝染毒大鼠fEPSP的标准化幅值

Table1.Standardized amplitude of fEPSP in rats with subchronic aluminum exposure at different time points

2.3   GluR1、GluR2棕榈酰化水平

酰基生物素置换法结果显示,随着染毒剂量的增加,大鼠海马组织GluR1、GluR2棕榈酰化水平呈现逐渐降低的趋势,见图 2图 3。结果显示:对照组和低、中、高剂量组的GluR1棕榈酰化水平分别为1.54± 0.33、1.26±0.49、0.95±0.26、0.90±0.33,中、高剂量组低于对照组,差异有统计学意义(P < 0.05);4组的GluR2蛋白棕榈酰化水平分别为1.19±0.04,1.08± 0.028,0.95±0.15,0.50±0.19,中剂量组的棕榈酰化水平低于对照组,高剂量组的棕榈酰化水平低于其他3组,差异均有统计学意义(P < 0.05)。

图 2

不同剂量亚慢性铝染毒大鼠GluR1棕榈酰化水平

图 3

不同剂量亚慢性铝染毒大鼠GluR2棕榈酰化水平

3   讨论

AMPA受体是一种离子型谷氨酸受体,对神经元各种形式的突触重塑有着重要作用,本课题组在以往的研究中发现AMPA受体运输与铝影响LTP密切相关,且小G蛋白Ras及下游的信号分子参与了铝致AMPA受体运输与LTP损害[17]。但是,Ras只能解释部分铝损害LTP的机制,在重新审视了影响AMPA受体运输的各种因素后,发现蛋白质的棕榈酰化修饰可以动态调节蛋白质在细胞内不同部位的穿梭以及重新定位[11],在AMPA受体中发挥着重要的作用,与突触可塑性及LTP的发生密切相关。越来越多的研究发现,棕榈酰化对于突触前膜的递质释放以及突触可塑性变化等多个方面起着重要作用,与多种神经退行性病变及学习记忆密切相关的神经精神疾病有关,如阿尔兹海默病、亨廷顿舞蹈病、精神分裂症以及精神发育迟滞和物质成瘾[11, 18]

本研究显示,亚慢性麦芽酚铝染毒对海马LTP的诱导和维持有明显的抑制作用,并且存在剂量-反应关系,这与本课题组前期[19]的研究一致;同时,随着铝染毒剂量的增加,GluR1、GluR2棕榈酰化水平呈现出下降的趋势。亚慢性铝染毒对AMPA受体亚单位GluR1、GluR2棕榈酰化和LTP都存在剂量-反应关系,根据已有研究:突触后膜AMPA受体的改变与LTP的发生密切相关,LTP保持时间越长,则突触后AMPA受体数目增加越多、敏感性增加程度越高[6]。且棕榈酰化修饰可以调节AMPA受体的定位和运输[13],提示GluR1、GluR2棕榈酰化降低可能是LTP损害的机制之一。推测铝影响GluR1、GluR2棕榈酰化的机制是因为棕榈酰化修饰是一种酶促反应,催化该反应过程的酶被称为蛋白质S-酰基转移酶(protein S-acyltransferases,PATs)。PAT由50个氨基酸残基组成,形成半胱氨酸残基聚集域(aspartatehistidine-histidine-cysteine within a cys-rich domain,DHHC-CRD)的锌指状结构,这个结构域对于PAT的酶活性是必需的,铝的理化特性决定铝进入机体后往往以金属离子的形式发挥其毒性作用,其化学特性决定它可能主要干扰正常金属离子相关的生物大分子。Al3+尺寸很小,但却有最大带电量,这使其具有非常高的电荷密度,因而Al3+具有高亲和性,含金属的酶在体内能进行正常的生化反应在于这些金属离子和配体可快速可逆性的分离,但Al3+脱离配体的速度相当慢,这就造成Al3+竞争代替必需金属进行酶反应时不能快速地与配体解离,从而造成生化反应异常[20]。早年有研究表明Al3+在与一些含Zn2+酶蛋白结合后,可将Zn2+替代出[21-22],也可见一斑。

由此我们推测,Al3+可能通过竞争性代替PATs内锌指结构中的Zn2+来抑制PATs的活性,从而影响AMPA受体棕榈酰化修饰这种酶促反应,进而使AMPA受体运输下降,最终导致LTP受损。但是,本研究只从动物实验方面初步探索了亚慢性铝染毒对LTP和AMPA受体棕榈酰化的影响,未研究AMPA受体棕榈酰化失衡对AMPA受体运输以及Al3+对PATs活性的影响。所以,本课题组接下来会进行棕榈酰化修饰失衡对AMPA受体运输以及PATs活性相关实验的研究,并用细胞实验加以验证。

图 1

不同剂量亚慢性铝染毒大鼠LTP检测结果

Figure 1 Results of LTP in rats with subchronic aluminum exposure

[注]以给予高频刺激(HFS)开始计时,将高频刺激前记录基础波30 min记为负值,高频刺激后记录基础波60 min记为正值。 [Note]The basic wave is recorded negative at 30 min before high frequency stimulation(HFS) and positive at 60 min after HFS.
表1

不同时间点各组亚慢性铝染毒大鼠fEPSP的标准化幅值

Table 1 Standardized amplitude of fEPSP in rats with subchronic aluminum exposure at different time points

图 2

不同剂量亚慢性铝染毒大鼠GluR1棕榈酰化水平

Figure 2 GluR1 palmitoylation levels in rats with subchronic aluminum exposure

[注]a:与对照组比较,P < 0.05。 [Note]a: Compared with the control group, P < 0.05.
图 3

不同剂量亚慢性铝染毒大鼠GluR2棕榈酰化水平

Figure 3 GluR2 palmitoylation levels in rats with subchronic aluminum exposure

[注]a:与对照组比较,P < 0.05;b:与低剂量组比较P < 0.05;c:与中剂量组比较,P < 0.05。 [Note]a: Compared with the control group, P < 0.05; b: Compared with the low-dose group, P < 0.05; c: Compared with the middle-dose group, P < 0.05.

参考文献

[1]

LU X, LIANG R, JIA Z, et al. Cognitive disorders and tauprotein expression among retired aluminum smelting workers[J]. J Occup Environ Med, 2014, 56(2):155-160.

[2]

ZAWILLA N H, TAHA F M, KISHK N A, et al. Occupational exposure to aluminum and its amyloidogenic link with cognitive functions[J]. J Inorg Biochem, 2014, 139:57-64.

[3]

SONG J, LIU Y, ZHANG H F, et al. Effects of exposure to aluminum on long-term potentiation and AMPA receptor subunits in rats in vivo[J]. Biomed Environ Sci, 2014, 27(2):77-84.

[4]

ZHANG L, JIN C, LU X, et al. Aluminium chloride impairs long-term memory and downregulates cAMP-PKA-CREB signalling in rats[J]. Toxicology, 2014, 323:95-108.

[5]

ZHANG H, YANG X, QIN X, et al. Caspase-3 is involved in aluminum-induced impairment of long-term potentiation in rats through the AKT/GSK-3β pathway[J]. Neurotox Res, 2016, 29(4):484-494.

[6]

LEE H K, KIRKWOOD A. AMPA receptor regulation during synaptic plasticity in hippocampus and neocortex[J]. Semin Cell Dev Biol, 2011, 22(5):514-520.

[7]

CHEN Z, STOCKWELL J, CAYABYAB F S. Adenosine a1 receptor-mediated endocytosis of AMPA receptors contributes to impairments in long-term potentiation (LTP)in the middleaged rat hippocampus[J]. Neurochem Res, 2016, 41(5):1085-1097.

[8]

GIRALT A, GÓMEZ-CLIMENT M Á, ALCALÁ R, et al. The AMPA receptor positive allosteric modulator S 47445 rescues in vivo CA3-CA1 long-term potentiation and structural synaptic changes in old mice[J]. Neuropharmacology, 2017, 123:395-409.

[9]

WANG G, GILBERT J, MAN H Y. AMPA receptor trafficking in homeostatic synaptic plasticity:functional molecules and signaling cascades[J]. Neural Plast, 2012, 2012:825364.

[10]

GUAN X, FIERKE C A. Understanding protein palmitoylation:biological significance and enzymology[J]. Sci China Chem, 2011, 54(12):1888-1897.

[11]

ZAREBA-KOZIOL M, FIGIEL I, BARTKOWIAK-KACZMAREK A, et al. Insights into protein s-palmitoylation in synaptic plasticity and neurological disorders:potential and limitations of methods for detection and analysis[J]. Front Mol Neurosci, 2018, 11:175.

[12]

VAN DOLAH D K, MAO L M, SHAFFER C, et al. Reversible palmitoylation regulates surface stability of AMPA receptors in the nucleus accumbens in response to cocaine in vivo[J]. Biol Psychiatry, 2011, 69(11):1035-1042.

[13]

HAN J, WU P, WANG F, et al. S-palmitoylation regulates AMPA receptors trafficking and function:a novel insight into synaptic regulation and therapeutics[J]. Acta Pharm Sin B, 2015, 5(1):1-7.

[14]

SHIPSTON MJ. Ion channel regulation by protein palmitoylation[J]. J Biol Chem, 2011, 286(11):8709-8716.

[15]

LIANG R F, LIWQ, WANG X H, et al. Aluminium-maltolateinduced impairment of learning, memory and hippocampal long-term potentiation in rats[J]. Ind Health, 2012, 50(5):428-436.

[16]

BRIGIDI G S, BAMJI S X. Detection of protein palmitoylation in cultured hippocampal neurons by immunoprecipitation and acyl-biotin exchange(ABE)[J]. J Vis Exp, 2013(72):e50031.

[17]

SONG J, LIU Y, ZHANG H F, et al. The RAS/PI3K pathway is involved in the impairment of long-term potentiation induced by acute aluminum treatment in rats[J]. Biomed Environ Sci, 2016, 29(11):782-789.

[18]

KORYCKA J, ŁACH A, HEGER E, et al. Human DHHC proteins:a spotlight on the hidden player of palmitoylation[J]. Eur J Cell Biol, 2012, 91(2):107-117.

[19]

宋静, 张慧芳, 刘莹, 等.麦芽酚铝对大鼠在体海马长时程增强影响[J].中国公共卫生, 2013, 29(5):688-691.

[20]

WALTON J R. Aluminum disruption of calcium homeostasis and signal transduction resembles change that occurs in aging and alzheimer's disease[J]. J Alzheimers Dis, 2012, 29(2):255-273.

[21]

DI J, YAO K, HAN W, et al. Study on the interaction of copper-zinc superoxide dismutase with aluminum ions by electrochemical and fluorescent method[J]. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, 2006, 65(3/4):896-900.

[22]

CHAKRABORTY A, BASAK S. Interaction with Al and Zn induces structure formation and aggregation in natively unfolded caseins[J]. J Photochem Photobiol B, 2008, 93(1):36-43.

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[基金项目] 山西医科大学博士启动基金(编号:03201413)

[作者简介] 夏欣宇(1992-), 女, 硕士生; 研究方向:化学物的神经毒性; E-mail: xiaxinyu3@126.com

[收稿日期] 2018-06-09 00:00:00.0

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