《环境与职业医学》杂志官方网站 《环境与职业医学》杂志官方网站

首页> 过刊浏览> 正文

2018, 35(12):1129-1133.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2018.18349

天门冬水煎剂对氟染毒大鼠脑组织SIRT1和BDNF表达的影响


1. 贵阳中医学院第一附属医院检验科, 贵州 贵阳 550001 ;
2. 贵州医科大学附属医院血液科, 贵州 贵阳 550004

收稿日期: 2018-05-27;  发布日期: 2019-01-07

基金项目: 国家自然科学基金项目(编号:31660326);贵州省科技厅项目(编号:黔科合LH字[2016]7511、[2017]7151号);贵州省教育厅青年科技人才成长项目(编号:黔教合KY[2016]190);贵州省中医药管理局项目(编号:QZYY-2018-018);贵阳中医学院基金[2017]12、13号

通信作者: 刘洋, Email: ly7878@163.com  

作者简介: 王飞清(1988-), 男, 硕士, 主管技师; 研究方向:民族医药防治地方病; E-mail:

[目的] 探讨天门冬水煎剂对氟染毒大鼠脑组织沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)和脑源性神经营养因子(BDNF)表达的影响。

[方法] 将清洁级SD大鼠60只随机分为对照组(自由食用正常玉米饲料)、染氟组(食用50 mg/kg含氟饲料)、天门冬低剂量治疗组(2.5 g/kg天门冬+50 mg/kg含氟饲料)、天门冬中剂量治疗组(5 g/kg天门冬+50 mg/kg含氟饲料)、天门冬高剂量治疗组(10 g/kg天门冬+50 mg/kg含氟饲料),每组12只,雌雄各半。以自由食用含氟饲料方式进行染毒,并以灌胃方式给药天门冬水煎剂,每天1次,1 mL/次,连续3个月,采用实时定量荧光聚合酶链反应(qRT-PCR)和免疫印迹法检测脑组织SIRT1、BDNF的mRNA和蛋白表达水平。

[结果] 染氟组和不同剂量天门冬组大鼠脑组织SITR1、BDNF的mRNA和蛋白水平均低于对照组,且差异均有统计学意义(均P<0.05)。天门冬中剂量和高剂量组大鼠脑组织SITR1、BDNF的mRNA和蛋白表达水平均高于染氟组,差异有统计学意义(P<0.05)。各天门冬剂量组比较,随天门冬剂量增加,大鼠脑组织SITR1、BDNF的mRNA和蛋白表达水平逐渐升高(P<0.05)。光镜下观察染氟组大鼠脑组织星形细胞明显减少,细胞出现肿胀,核仁消失,呈现明显损伤的现象;各天门冬组大鼠脑组织星形细胞逐渐增加,核仁逐渐清晰,较染氟组明显改善。

[结论] 在本实验剂量下,天门冬表现出一定的脑保护作用,可能与天门冬上调氟染毒大鼠脑组织SITR1、BDNF的mRNA和蛋白水平有关。

关键词: 氟染毒;  天门冬;  脑;  沉默信息调节因子2相关酶1;  脑源性神经营养因子 

流行病学报道表明, 氟可在中枢神经系统内蓄积, 导致脑组织损伤, 进而影响记忆和思维能力[1]。实验研究也显示长期过量摄入氟的大鼠学习记忆能力显著下降[2]。氟引起脑损伤与体内的自由基、脂质过氧化物水平相关[3]。近年来参与神经保护作用的沉默信息调节因子2相关酶1 (silent mating type information regulation 2 homolog 1, SIRT1)和脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)广受科研人员关注。SIRT1是一种去乙酰化酶, 其在应激条件下参与调节细胞的凋亡和衰老的过程, 能够增强细胞活性及自我修复和存活的能力, 且减少炎症反应, 对神经损伤起到保护作用[4-5]。BDNF在脑组织中含量丰富, 具有参与神经系统发育分化, 防止脑组织损伤等多种保护作用, 其还可通过信号通路方式影响神经细胞功能, 进一步影响学习记忆行为[6-7]。有研究认为通过上调脑组织SIRT1和BDNF的表达可以增强脑保护作用[8-9]

贵州省是燃煤污染食物引起燃煤型氟中毒重灾区, 氟中毒致脑损伤防治研究一直备受人们关注, 本课题前期研究发现贵州产天门冬具有改善氟中毒大鼠认知行为能力的作用[10-11]。天门冬是否可以通过影响脑组织SIRT1和BDNF表达, 从而减轻氟脑损伤还未见实验报道。为此, 本研究构建氟染毒SD大鼠模型, 对氟染毒大鼠灌胃不同剂量天门冬, 通过检测大鼠脑组织SIRT1和BDNF的表达, 探索天门冬是否对氟染毒大鼠具有脑保护作用, 为临床防治氟中毒提供实验依据。

1   材料与方法

1.1   动物模型构建与染毒

选用100~120g清洁级SD大鼠60只, 雌雄各半, 由贵州医科大学动物实验中心提供, 大鼠合格证号SCXK (黔)2012-0001。实验室环境温度20~25℃, 湿度(60± 20)%, 正常明暗交替。依据人体使用剂量及可溶性氟化物的半数致死剂量设立染毒剂量。将大鼠适应性喂养1周, 随机分为5组:对照组(玉米饲料, 实测氟含量4.7 mg/kg)、染氟组(50 mg/kg含氟饲料, 实测氟含量48.7 mg/kg)、天门冬低剂量治疗组(2.5 g/kg天门冬+ 50 mg/kg含氟饲料)、天门冬中剂量治疗组(5 g/kg天门冬+50 mg/kg含氟饲料)、天门冬高剂量治疗组(10 g/kg天门冬+50 mg/kg含氟饲料), 每组12只。对照组大鼠正常饮食和饮水; 各模型组自由食用含氟的玉米饲料, 每天对各天门冬组大鼠分别灌胃服用天门冬水煎剂1次, 1 mL/次, 连续90 d, 观察大鼠生长发育情况。染氟90 d股动脉取血后, 处死大鼠, 迅速分离脑组织, 于-80℃保存备用。本研究经贵阳中医学院第一附属医院伦理委员会批准, 符合动物伦理学要求。

1.2   试剂与仪器

天门冬(贵阳仁济堂, 批号: 20160901, 中国), 实时定量荧光PCR试剂盒(北京全式金生物, 中国), 引物序列使用Primer3设计(上海英俊, 中国), SIRT1和BDNF抗体(Santa Cruz, 美国), 高速台式冷冻离心机(湖南长沙湘仪离心机仪器, 中国), 电子天平(上海精科天美科学仪器, 中国), -80℃超低温冰箱(Sanyo, 日本), PCR仪(ABI StepOnePlus, 美国), 电泳仪(伯乐, 美国), 显影成像仪(Syngene G: BOX EF 2, 英国), 酶标仪(DNM-9606, 中国), 二抗(碧云天, 中国), 内参(Santa Cruz, 美国), lowery试剂(索莱宝, 中国), 组织裂解液(索莱宝, 中国)。

1.3   方法

1.3.1   氟斑牙标准

每周观察各组大鼠牙齿变化情况, 判定损伤程度并记录。氟斑牙分为正常、轻度、中度、重度[12]。轻度牙表面黄白相间, 白垩条纹清晰; 中度牙表面呈无光泽粉笔样白色; 重度牙表面出现小沟、裂纹或部分脱落, 牙齿呈锯齿状严重缺损。

1.3.2   脑组织脏器系数

动脉取血处死大鼠, 处死前称体重, 处死后立即断头取出脑组织, 剔除脏器周围脂肪和结缔组织, 滤纸吸干表面血液, 用电子天平称重。计算脏器系数。脏器系数= (脏器重量/大鼠体重)×100%。

1.3.3   测定脑组织中

SIRT1和BDNF mRNA表达采用Trizol法提取脑组织总RNA, 根据试剂盒说明书具体方法进一步采用实时定量-反转录聚合酶链反应(Real-time PCR)进行基因片段扩增并定量。各PCR反应管中所加模板RNA的量约为1 μg。SIRT1 PCR扩增条件如下。逆转录反应体系:将混匀好样本45℃孵育15 min, 85℃加热5 s失活得cDNA; 扩增反应体系: 95 ℃ 5 s, 65 ℃ 5 s, 72 ℃ 20 s, 40个循环。结果通过PCR仪记录的Ct值对起始模板相对定量分析。引物序列见表 1

表1

Real-time PCR引物序列

1.3.4   检测脑组织SIRT1和BDNF蛋白表达

采用lowery法检测蛋白含量。取低温保存的大鼠脑组织标本, 置于15 mL试管中, 加入预冷的组织裂解液, 用玻璃匀浆器在冰上匀浆, 4℃, 21 500×g离心10 min。取上述制备的上清液进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳, 全湿式电转法将分离胶上的蛋白转移到PVDF膜上, 室温下封闭2 h。将一抗均匀加到PVDF膜上, 4℃过夜。然后将膜放入TBST中于摇床上漂洗3次, 每次10 min。加二抗, 室温下孵育2 h, 放入TBS中于摇床上漂洗3次, 每次10 min, 再用TBST漂洗10 min。信号用发光剂显影于感光胶片上成像, 分析条带灰度值。

1.3.5   大脑组织病理形态

大脑组织经多聚甲醛溶液固定2 d后, 常规取材、脱水、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色。光镜200倍镜下观察大脑组织的形态学改变。

1.4   统计学分析

应用SPSS 22.0软件对数据进行分析。检测结果符合正态分布且方差齐, 组间用单因素方差分析进行比较, 两两比较采用最小显著性差异法, 检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   各组大鼠氟斑牙发生情况

染氟3个月后, 染氟组氟斑牙严重程度明显高于其他治疗组, 主要是中、重度氟斑牙。各治疗组随天门冬剂量增加, 氟斑牙程度呈现逐渐降低的趋势, 轻、中度偏多, 见表 2

表2

染氟90 d后大鼠氟斑牙的情况(n=12)

2.2   大鼠脑组织脏器系数

实验结果显示, 对照组与染氟组、各治疗组间大鼠脑组织脏器系数变化, 差异无统计学意义(F=0.067, P >0.05)。

2.3   大鼠脑组织SIRT1BDNF mRNA基因情况

染氟组和不同剂量天门冬治疗组大鼠脑组织SITR1BDNF mRNA均低于对照组, 且差异均有统计学意义(F=102.384, F=149.702, 均P<0.05)。天门冬中剂量和高剂量组大鼠脑组织SITR1BDNF mRNA均高于染氟组, 差异有统计学意义(P<0.05)。各天门冬剂量组比较, 随着灌胃天门冬剂量增加, 大鼠脑组织SITR1BDNF mRNA逐渐升高(P<0.05) (图 1)。

图 1

染氟90d后各组大鼠脑组织SIRT1BDNF mRNA比较

2.4   各组大鼠脑组织SIRT1和BDNF蛋白水平

染氟组和各天门冬组大鼠脑组织SITR1和BDNF蛋白水平均低于对照组, 差异有统计学意义(F=91.824, F=45.952, 均P<0.05)。天门冬中剂量和高剂量组大鼠脑组织SITR1和BDNF蛋白水平高于染氟组, 差异有统计学意义(P<0.05)。各天门冬剂量组比较, 随灌胃天门冬剂量增加, 大鼠脑组织SITR1和BDNF蛋白水平逐渐升高(P<0.05) (图 2)。

图 2

染氟90d后各组大鼠脑组织SIRT1和BDNF蛋白水平比较

2.5   大鼠脑组织病理形态

光镜下观察对照组可见形态规则的星形细胞, 核仁清晰, 未见细胞损伤现象。染氟组大鼠脑组织星形细胞明显减少, 细胞出现肿胀, 核仁消失, 呈现明显损伤的现象。各天门冬治疗组大鼠脑组织星形细胞逐渐增加, 核仁逐渐清晰, 脑组织细胞损伤缓解, 与染氟组比较明显改善(图 3)。

图 3

染氟90d后各组大鼠脑组织病理结果(×200)

3   讨论

研究证实, 脏器系数的异常可暗示了病理组织学改变的可能性, 有不少学者在研究化学毒物的靶器官毒性时, 发现毒物对靶器官的脏器系数有影响[13-14], 但本实验中染氟组和不同剂量天门冬治疗组大鼠脑组织脏器系数与对照组相比差异均无统计学意义。

氟离子可以通过血脑屏障在大脑组织中蓄积并造成中枢神经系统损伤, 目前临床已发现氟中毒地区人员可表现出记忆力障碍等功能损伤。SIRT1是一种依赖蛋白去乙酰化酶类, 广泛表达于皮质、海马、小脑和丘脑部位, 通过抑制氧化应激、炎性反应、细胞凋亡等途径, 发挥脑组织神经保护作用[15-19]。研究显示, SIRT1在多种神经系统疾病, 如脑缺血、阿尔茨海默病、帕金森等病中发挥神经保护作用, 并在学习记忆和适应性方面发挥积极作用[20-21]。本课题组前期实验发现, 氟中毒大鼠脑组织SIRT1明显降低, 且伴随行为学改变[22]。本实验结果显示染氟组SIRT1的mRNA和蛋白表达水平明显低于天门冬中、高剂量组。通过贵州产天门冬灌胃氟染毒大鼠实验发现, 随天门冬剂量增加, 大鼠脑组织SIRT1的mRNA和蛋白表达水平逐渐升高。

BDNF是脑神经营养因子家族成员之一, 广泛存在于中枢神经系统。有研究表明BDNF可调节脑组织细胞中的抗氧化水平, 发挥抗氧化、保护神经细胞的作用[23]。动物实验显示, BDNF在神经损伤后的修复、生长及再生, 参与学习记忆过程起到重要作用, 且BDNF缺乏或功能异常可伴有严重的学习记忆功能障碍[24-25]。机体氧化产物蓄积会对BDNF相关通路产生影响, 诱导神经细胞凋亡。本实验结果显示染氟组BDNF的mRNA和蛋白表达水平明显低于各组。随天门冬剂量增加, 大鼠脑组织BDNF的mRNA和蛋白表达水平逐渐升高。病理形态结果显示, 染氟组大鼠脑组织星形细胞明显减少, 部分核仁固缩边缘化, 细胞出现肿胀, 呈现明显损伤的现象。灌胃不同剂量天门冬水煎剂后大鼠脑组织星形细胞逐渐增加, 大鼠脑组织明显改善。

综上, 氟染毒可引起大鼠脑组织SIRT1和BDNF蛋白与mRNA表达降低, 且脑组织形态学损伤明显。天门冬灌胃后表现出一定的脑保护作用, 可能与天门冬上调氟染毒大鼠脑组织SITR1、BDNF的mRNA和蛋白水平有关。

表1

Real-time PCR引物序列

Table 1
表2

染氟90 d后大鼠氟斑牙的情况(n=12)

Table 2
图 1

染氟90d后各组大鼠脑组织SIRT1BDNF mRNA比较

Figure 1 [注]▲:与对照组比较,P<0.05;◆:与染氟组比较,P<0.05;■:与前一剂量天门冬治疗组比较,P<0.05。
图 2

染氟90d后各组大鼠脑组织SIRT1和BDNF蛋白水平比较

Figure 2 [注]▲:与对照组比较,P<0.05;◆:与染氟组比较,P<0.05;■:与前一剂量天门冬治疗组比较,P<0.05。
图 3

染氟90d后各组大鼠脑组织病理结果(×200)

Figure 3 [注]A:对照组;B:染氟组;C:天门冬低剂量治疗组;D:天门冬中剂量治疗组;E:天门冬高剂量治疗组。

参考文献

[1]

SAXENA S, SAHAY A, GOEL P. Effect of fluoride exposure on the intelligence of school children in Madhya Pradesh, India[J]. J Neurosci Rural Pract, 2012, 3(2):144-149.

[2]

GE Y, NIU R, ZHANG J, et al. Proteomic analysis of brain proteins of rats exposed to high fluoride and low iodine[J]. Arch Toxicol, 2011, 85(1):27-33.

[3]

BHARTI VK, SRIVASTAVA RS, KUMAR K, et al. Effects of melatonin and epiphyseal proteins on fluoride-induced adverse changes in antioxidant status of heart, liver, and kidney of rats[J]. Adv Pharmacol Sci, 2014, 2014:532969.

[4]

CHEN J, ZHOU Y, MUELLER-STEINER S, et al. SIRT1 protects against microglia-dependent amyloid-β toxicity through inhibiting NF-κB signaling[J]. J Biol Chem, 2005, 280(48):40364-40374.

[5]

YU Q, WANG T, ZHOU X, et al. WldS reduces paraquatinduced cytotoxicity via SIRT1 in non-neuronal cells by attenuating the depletion of NAD[J]. PLoS One, 2011, 6(7):e21770.

[6]

LEE S H, KO I G, KIM S E, et al. Aqueous extract of cordyceps alleviates cerebral ischemia-induced short-term memory impairment in gerbils[J]. J Exerc Rehabil, 2016, 12(2):69-78.

[7]

SAWAMOTO A, OKUYAMA S, YAMAMOTO K, et al. 3, 5, 6, 7, 8, 3', 4'-Heptamethoxyflavone, a citrus flavonoid, ameliorates corticosterone-induced depression-like behavior and restores brain-derived neurotrophic factor expression, neurogenesis, and neuroplasticity in the hippocampus[J]. Molecules, 2016, 21(4):541.

[8]

GHOSH S, ZHOU Z. SIRTain regulators of premature senescence and accelerated aging[J]. Protein Cell, 2015, 6(5):322-333.

[9]

NAGAHARA A H, TUSZYNSK M H. Potential therapeutic uses of BDNF in neurological and psychiatric disorders[J]. Nat Rev Drug Discov, 2011, 10(3):209-219.

[10]

刘洋, 李艳菊, 唐东昕, 等.天门冬对氟中毒大鼠认知行为能力的影响及机制[J].山东医药, 2017, 57(42):37-39.

[11]

刘洋, 李艳菊, 李红日, 等.天门冬对氟中毒大鼠学习记忆能力干预作用[J].中国公共卫生, 2017, 33(6):922-925.

[12]

王连方.氟斑牙的几种" Dean氏分类法"浅析[J].地方病通报, 2007, 22(1):71-73.

[13]

陈陵, 赵学成, 邓琼, 等.纳米氧化铈急性染毒对雄性小鼠体重和脏器系数及血常规的影响[J].环境与健康杂志, 2010, 27(10):899-902.

[14]

汪纪仓, 朱华丽, 林霖, 等.镉致大鼠血液、肝脏、肾脏和睾丸的毒性损伤[J].毒理学杂志, 2017, 31(1):10-13.

[15]

GUARENTE L. Linking DNA damage, NAD+/SIRT1, and aging[J]. Cell Metab, 2014, 20(5):706-707.

[16]

WANG J, FIVECOAT H, HO L, et al. The role of Sirt1:at the crossroad between promotion of longevity and protection against Alzheimer's disease neuropathology[J]. Biochim Biophys Acta, 2010, 1804(8):1690-1694.

[17]

HISAHARA S, CHIBA S, MATSUMOTO H, et al. Histone deacetylase SIRT1 modulates neuronal differentiation by its nuclear translocation[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(40):15599-15604.

[18]

PROZOROVSKI T, SCHULZE-TOPPHOFF U, GLUMM R, et al. Sirt1 contributes critically to the redox-dependent fate of neural progenitors[J]. Nat Cell Biol, 2008, 10(4):385-394.

[19]

PARAISO A F, MENDES K L, SANTOS S H. Brain activation of SIRT1:role in neuropathology[J]. Mol Neurobiol, 2013, 48(3):681-689.

[20]

ZHANG F, WANG S, GAN L, et al. Protective effects and mechanisms of sirtuins in the nervous system[J]. Prog Neurobiol, 2011, 95(3):373-395.

[21]

MICHÁN S, LI Y, CHOU M M, et al. SIRT1 is essential for normal cognitive function and synaptic plasticity[J]. J Neurosci, 2010, 30(29):9695-9707.

[22]

刘洋, 李艳菊, 王宁, 等.细胞沉默调节蛋白1在氟中毒大鼠脑组织中的表达[J].中华地方病学杂志, 2018, 37(1):30-34.

[23]

IKEDA O, MURAKAMI M, INO H, et al. Effects of brainderived neurotrophic factor(BDNF)on compression-induced spinal cord injury:BDNF attenuates down-regulation of superoxide dismutase expression and promotes up-regulation of myelin basic protein expression[J]. J Neuropathol Exp Neurol, 2002, 61(2):142-153.

[24]

LIU Q, WONG-RILEY M T. Postnatal development of brainderived neurotrophic factor(BDNF)and tyrosine protein kinase B(TrkB)receptor immunoreactivity in multiple brain stem respiratory-related nuclei of the rat[J]. J Comp Neurol, 2013, 521(1):109-129.

[25]

NOVKOVIC T, MITTMANN T, MANAHAN-VAUGHAN D. BDNF contributes to the facilitation of hippocampal synaptic plasticity and learning enabled by environmental enrichment[J]. Hippocampus, 2015, 25(1):1-15.

上一张 下一张
上一张 下一张

[基金项目] 国家自然科学基金项目(编号:31660326);贵州省科技厅项目(编号:黔科合LH字[2016]7511、[2017]7151号);贵州省教育厅青年科技人才成长项目(编号:黔教合KY[2016]190);贵州省中医药管理局项目(编号:QZYY-2018-018);贵阳中医学院基金[2017]12、13号

[作者简介] 王飞清(1988-), 男, 硕士, 主管技师; 研究方向:民族医药防治地方病; E-mail: wfq8806@163.com

[收稿日期] 2018-05-27

【点击复制中文】
【点击复制英文】
计量
  • PDF下载量 (29)
  • 文章访问量 (180)
  • XML下载量 (0)
  • 被引次数 (0)

目录

天门冬水煎剂对氟染毒大鼠脑组织SIRT1和BDNF表达的影响

导出文件

格式

内容

导出 关闭
《环境与职业医学》杂志官方网站