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2018, 35(8):702-708.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2018.18228

氟砷联合染毒对大鼠牙齿组织BMP-2RANKPI3KAkt1基因转录水平的影响


a. 贵州医科大学公共卫生学院, 贵州 贵阳 550025 ;
b. 贵州医科大学环境污染与疾病监控教育部重点实验室, 贵州 贵阳 550025

收稿日期: 2018-03-18;  发布日期: 2018-11-05

基金项目: 国家自然科学基金(编号:81472927)

通信作者: 洪峰, Email: hongfeng-73@163.com  

作者简介: 覃子秀(1990-), 女, 硕士生; 研究方向:毒物联合作用; E-mail:

[目的] 通过建立慢性氟砷联合染毒大鼠模型,观察骨形态发生蛋白2(BMP-2)、核因子κB受体活化因子(RANK)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B1(Akt1)基因mRNA相对表达水平在氟砷联合染毒大鼠牙齿组织中的变化情况。

[方法] 选取清洁级Wistar大鼠作为研究对象,按析因设计随机分为16组,每组10只,雌雄各半,采用不同浓度NaF(0.0、5.0、10.0、20.0 mg/kg)和NaAsO2(0.0、2.5、5.0、10.0 mg/kg)单独和联合灌胃染毒,每周连续灌胃染毒6 d,停灌1 d,连续染毒6个月。实验结束后处死大鼠。采用氟离子选择电极测牙氟含量,原子荧光光谱法测牙砷含量,实时荧光定量PCR检测大鼠牙齿组织BMP-2RANKPI3KAkt1 mRNA相对量表达。

[结果] 无氟染毒的4组大鼠均无氟斑牙发生,余12组大鼠均出现氟斑牙。牙氟、牙砷含量随单独氟、砷染毒剂量升高而增加。大鼠牙齿组织BMP-2Akt1 mRNA表达水平呈现随氟染毒剂量增加而升高的趋势(P<0.05),但并未随砷染毒剂量的改变而发生变化(P>0.05)。RANKPI3K mRNA表达水平呈现随氟染毒剂量增加而下降的趋势(P<0.05),各砷染毒剂量组间差异则无统计学意义(P>0.05)。氟染毒剂量、牙氟含量与BMP-2Akt1 mRNA表达水平呈正相关(r=0.382、0.302,0.292、0.246,均P<0.05),与RANKPI3K mRNA表达水平呈负相关(r=-0.323、-0.332,-0.193、-0.185,均P<0.05),氟斑牙与牙齿组织RANKPI3K mRNA表达呈负相关(r=-0.283、-0.273,均P<0.05),其余无相关性。

[结论] 过量氟暴露可上调大鼠牙组织BMP-2Akt1转录水平,下调RANKPI3K转录水平,从而参与牙齿釉质发育或矿化过程,导致牙齿损伤。氟砷联合暴露致牙齿损伤主要表现为氟的主效应,砷间接参与氟致牙齿损伤作用。

关键词: 氟;  砷;  联合作用;  BMP-2 RANK PI3K Akt1 氟斑牙;  大鼠 

氟牙症是地方性氟中毒早期最典型的临床症状,由于牙齿发育矿化时期机体摄入过量氟,导致牙釉质呈现多孔性改变和矿化不全,易吸附外来色素并极易沉着,难以清除。轻者主要表现为牙齿颜色异常,严重者可影响牙釉质发育,牙齿表面形成实质性缺损,此时不仅会影响人们的咀嚼和消化功能,还会影响外貌美观,严重影响着患者的身心健康[1]。由于自然环境复杂性,存在氟砷共暴露病区[2],研究发现氟、砷对骨的损伤存在联合作用[3-4]

研究发现骨形态发生蛋白家族(bone morphogenetic proteins,BMPs)、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinases B,Akt)信号通路和骨保护素/核因子κB受体活化因子配体/核因子κB受体活化因子(receptor activator for nuclear factor-κB,RANK)信号轴对骨骼生长、发育及损伤具有重要的调控作用[5-7]。有报道,氟可影响骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein Ⅱ,BMP-2)在成釉细胞中表达,影响釉基质分泌[8]。氟化钠可诱导BMP-2促进成骨细胞分化成熟,亦可通过影响RANKPI3KAkt1基因转录水平引起骨骼损伤,可能是氟骨症发生的相关分子机制[9-11],但尚未见其在牙齿损伤中相关研究报道。因此,本研究拟从分子水平探讨BMP-2RANKPI3KAkt1基因相对表达量在慢性氟砷联合暴露致大鼠氟牙症损伤中的变化情况,为进一步氟牙症损伤的机制研究提供理论依据。

1   材料与方法

1.1   大鼠分组及染毒

选择SPF级8周龄Wistar大鼠160只[许可证号:SCXK(渝)2012-0003],适应性饲养1周,根据析因设计随机分为16组,每组10只,雌雄各半。

用去离子水溶解NaF和NaAsO2(Sigma,美国),采用不同浓度NaF(0.0、5.0、10.0、20.0 mg/kg,本文中记为F0.0、F5.0、F10.0、F20.0)和NaAsO2(0.0、2.5、5.0、10.0 mg/kg,本文中记为As0.0、As2.5、As5.0、As10.0)单独和联合灌胃染毒。对照组给予去离子水灌胃,染毒剂量设计依据课题组前期动物实验基础。动物自由摄取食物和饮水,自动控制昼夜循环(12 h/12 h),室温(22±1)℃,每周连续灌胃染毒6 d,停灌1 d,称重一次,据此调节并维持给药量,连续染毒6个月后,0.9%苯巴比妥腹腔注射麻醉,心脏采血处死大鼠后迅速分离大鼠下颚中切牙齿组织,剔除肌肉及结缔组织,于-80℃低温冰箱(Thermo,美国)冻存。

1.2   氟斑牙判断

氟斑牙分度标准[12]:Ⅰ度,牙表面黄白相间,白条纹清晰;Ⅱ度,牙表面无光泽有粉笔样白色斑;Ⅲ度,牙表面出现小沟、裂纹或部分脱落,牙齿呈锯齿状严重缺损。

1.3   牙氟、牙砷含量测定

取牙组织,105℃烘烤至恒重,分为两份:一份使用马弗炉(上海路达,中国)灰化后采用氟离子选择电极(PXS-270型,上海仪电科学,中国)测定牙氟含量[13];另一份使用微波消解仪(Milestone ETH,意大利)消解后采用原子荧光光谱仪(AF-630A型,北京瑞利,中国)检测牙砷含量[14]

1.4   大鼠牙齿组织BMP-2RANKPI3KAkt1基因检测

传统Trizo(l TaKaRa,日本)法提取大鼠牙齿组织总RNA,实时荧光定量PCR(quantitive real-time PCR,RT-qPCR)法检测mRNA表达量,以大鼠甘油醛三磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参,引物由GENEray(上海捷瑞,中国)合成,反应程序:95.0℃ 30s,95.0℃ 5s,55.0℃/52.0℃ 30 s,72.0℃ 30 s,共40个循环。扩增完毕后进行溶解曲线分析,采用实时荧光定量PCR仪自动生成循环值,将原始数据换算成目的基因mRNA相对量表达值(2-ΔΔCt)进行统计分析。

1.5   统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件建立数据库并进行统计分析。偏态分布数据经对数转换呈正态分布资料后进行统计分析,采用几何均数表示;正态分布数据以x±s表示。组间两两比较,方差齐采用SNK法,方差不齐采用Dunnett’s T3法。组间氟斑牙检出率比较采用χ2检验。检验水准α=0.05。

联合作用类型有非交互作用和交互作用,采用析因设计方差分析并判断是否存在交互作用,并分析交互作用是协同作用或是拮抗作用类型:当|(氟砷联合组指标-对照组指标)|>|(NaF组指标-对照组指标)|+|(NaAsO2组指标-对照组指标)|时,可判定交互作用类型为协同作用;当|(氟砷联合组指标-对照组指标)|<|(NaF组指标-对照组指标)|+|(NaAsO2组指标-对照组指标)|时,可判定交互作用类型为拮抗作用[15]

2   结果

2.1   大鼠氟斑牙发生情况

无氟染毒的4组大鼠均无氟斑牙出现。在进行氟染毒的大鼠中,F5.0剂量的4个砷染毒组大鼠均以Ⅰ度氟斑牙为主,F10.0剂量的4个砷染毒组以Ⅰ、Ⅱ度氟斑牙为主,F20.0剂量的4个砷染毒组以Ⅱ、Ⅲ度氟斑牙为主;各氟染毒组大鼠氟斑牙发生率均高于F0.0As0.0组(均P<0.05)。见表 1

表1

各组大鼠氟斑牙发生情况(n=10)

Table1.Incidence of dental fluorosis in rats

2.2   各组大鼠牙氟、牙砷含量

2.2.1   单独染毒

氟单独染毒时,牙氟含量呈现随染毒剂量升高而增高的趋势(P<0.05),牙砷含量未发生明显变化(P>0.05)。砷单独染毒时,牙砷含量也呈现随染毒剂量升高而增高的趋势(P=0.000),牙氟含量组间比较差异亦无统计学意义(P>0.05)。见图 1

图 1

各组大鼠牙氟(A)、牙砷(B)的相对表达水平(n=10)

2.2.2   联合染毒

在同一氟染毒剂量下,随砷染毒剂量的增加,大鼠牙氟含量组内比较差异无统计学意义(P>0.05),牙砷呈现增加趋势(P<0.05)。在同一砷染毒剂量下,随氟染毒剂量的增加,牙氟、牙砷含量均呈现增加趋势(均P<0.05)。见图 1

2.3   氟、砷单独染毒时大鼠牙齿组织BMP-2RANKPI3KAkt1 mRNA相对表达

2.3.1   单独染毒

氟单独染毒时,随着染毒剂量的增加,大鼠牙齿组织BMP-2Akt1 mRNA相对表达呈现增加的趋势,RANKPI3K mRNA相对表达水平呈现下降的趋势(P<0.05)。砷单独染毒时,随着剂量的增加,大鼠牙齿组织BMP-2RANKPI3KAkt1 mRNA相对表达水平组间差异均无统计学意义(均P>0.05)。见图 2

图 2

氟(A)、砷(B)单独染毒时大鼠牙齿组织基因mRNA相对表达水平(x±sn=10,2-ΔΔCt

2.3.2   联合染毒

图 3A可知大鼠牙齿组织BMP-2 mRNA相对表达在F10.0As2.5和F20.0As2.5分别低于F10.0As0.0和F20.0As0.0P<0.05),在F20.0As10.0高于F20.0As0.0和F0.0As10.0组(P<0.05)。由图 3B可知大鼠牙齿组织RANK mRNA相对表达在F20.0As5.0和F20.0As10.0低于F5.0As0.0、F0.0As10.0和F0.0As0.0组(P<0.05)。由图 3C可知大鼠牙齿组织PI3K mRNA相对表达在低砷组(包括F5.0As2.5、F10.0As2.5、F5.0As10.0组)均低于F0.0As2.5组(P<0.05),F20.0As5.0、F20.0As10.0低于F0.0As5.0、F0.0As10.0组(P<0.05)。由图 3D可知大鼠牙齿组织Akt1 mRNA相对表达在F5.0As10.0组高于F5.0As0.0、F0.0As10.0和F0.0As0.0组(P<0.05)。

图 3

各组大鼠牙齿组织BMP-2(A)、RANK(B)、PI3K(C)、Akt1(D)mRNA相对表达(n=10,x±s,2-ΔΔCt

2.4   氟、砷染毒对大鼠牙齿组织BMP-2RANKPI3KAkt1基因mRNA表达的交互作用

统计结果显示:氟砷联合染毒对大鼠牙齿组织BMP-2Akt1基因mRNA相对表达水平存在交互作用(F=4.341、2.447,均P<0.05),但对RANKPI3K mRNA表达不存在交互作用(F=1.502、1.610,P=0.154、0.119)。

2.5   氟、砷染毒与大鼠牙齿组织BMP-2RANKPI3KAkt1 mRNA表达的偏相关分析

氟染毒剂量、牙氟含量分别与大鼠牙齿组织BMP-2Akt1基因表达水平呈正相关(r=0.382、0.302,0.292、0.246,均P<0.05),与RANKPI3K基因表达水平呈负相关(r=-0.323、-0.332,-0.193、-0.185,均P<0.05),牙砷含量与RANKPI3K基因表达呈负相关(r=-0.193、-0.192,P<0.05)。见表 2

表2

氟、砷染毒与大鼠牙齿组织BMP-2RANKPI3KAkt1 mRNA表达的偏相关分析

Table2.Partial correlation analysis between exposure to fluoride and arsenic and mRNA expression levels of BMP-2, RANK, PI3K, and Akt1

2.6   氟斑牙与大鼠牙齿组织BMP-2RANKPI3KAkt1基因mRNA表达的相关分析

氟斑牙与牙齿组织RANKPI3K基因表达存在负相关关系(r=-0.283、-0.273,P<0.05),与BMP-2Akt1表达无相关性。

3   讨论

氟化物对骨组织形成起着重要作用。摄入少量的氟化物可以使龋齿发生率下降。然而,在牙釉质形成期,摄入过量的氟化物会导致牙釉质氟中毒。如饮用水中的氟化物超过美国联邦制定标准,将会导致氟骨症和氟牙症[16]。氟斑牙是一种由过量氟化物引起的疾病,表现为牙齿着色和易磨损。有学者对31种元素进行定量分析,发现氟、锰、砷等元素含量与釉质着色程度成正相关,因此认为釉质中过量氟不直接引起釉质着色,而是牙齿萌出后锰、砷、硒等元素与釉质结合呈现出不同程度的着色[17]。人类氟斑牙的病变性质主要表现为釉质的成熟缺陷,其特征性改变为釉质表面下方的多孔性和矿化不全,从而使得病变部位釉质表面的抵抗力降低,从而导致釉质缺损,牙齿容易发生破碎和剥落[18-20]

本研究显示:氟斑牙的检出率及严重程度与氟染毒剂量存在明显剂量-反应关系,而砷染毒剂量与氟斑牙之间无直接相关;氟砷联合染毒对氟斑牙的严重程度主要表现氟的主效应,在同一氟染毒剂量下,随染砷剂量增加,氟斑牙严重程度随之增加,提示在此暴露条件下砷能促进氟致氟斑牙的严重程度。单独氟染毒剂量与牙氟含量具有明显剂量-效应关系,氟砷联合染毒对氟化物在牙组织中的蓄积主要表现氟的主效应,在同一氟染毒剂量下,随着染砷剂量增加,牙氟含量随之呈轻度增加趋势,提示在此暴露条件下砷能促进氟化物在牙组织中蓄积,与氟斑牙发生情况一致。单独砷染毒与牙砷含量具有明显剂量-效应关系,提示砷化物亦可在牙组织中蓄积,氟砷联合染毒,在同一砷染毒剂量下,随着染氟剂量增加,牙砷含量随之呈轻度增加趋势,提示在此暴露条件下氟亦能促进砷化物在牙组织中蓄积。综上,氟化物可直接致牙齿损伤,砷则可在牙齿中蓄积可能与氟斑牙着色有关,间接参与牙齿损伤作用。王海慧等[21]研究表明,亲代大鼠摄入过量的氟化物会影响子代牙齿萌出时间和牙冠长度等,从而影响牙齿发育并引起氟斑牙的发生,且与亲代大鼠染氟剂量存在相关性。

有研究报道,氟可以通过影响釉基质蛋白及蛋白酶的功能障碍,导致釉质发育成熟和充分矿化障碍,这可能是导致釉质多孔性和低矿化的基本环节[22]。本次实验研究结果显示:大鼠牙齿组织中BMP-2Akt1基因转录水平与氟染毒和牙氟含量呈正相关关系,结合氟与砷交互作用对BMP-2Akt1基因相对量的表达分析可知,在此暴露条件下表现为氟的主效应,RANKPI3K基因转录水平与氟染毒、牙氟和牙砷含量呈负相关关系;氟斑牙与RANKPI3K基因转录水平呈负相关关系,结合氟与砷交互作用对RANKPI3K基因相对量的表达分析可知,在该暴露条件下表现为氟的主效应,砷间接参与牙齿损伤过程。

综上,氟可能通过上调BMP-2Akt1基因相对量转录水平和下调RANKPI3K基因相对量转录水平,参与牙齿釉质的成熟或矿化过程,从而参与牙齿发育,参与氟牙症的发生,砷可通过参与调节BMP-2Akt1基因相对量转录水平,间接参与牙齿损伤过程。

表1

各组大鼠氟斑牙发生情况(n=10)

Table 1 Incidence of dental fluorosis in rats

图 1

各组大鼠牙氟(A)、牙砷(B)的相对表达水平(n=10)

Figure 1 Levels of teeth fluoride(A) and teeth arsenic(B) in rats

[注]a:与F0.0As0.0组比较,P<0.05;b:与F5.0As0.0组比较,P<0.05;c:与F10.0As0.0组比较,P<0.05;d:与F20.0As0.0组比较,P<0.05;e:与F0.0As2.5组比较,P<0.05;f:与F0.0As5.0组比较,P<0.05;g:与F0.0As10.0组比较,P<0.05;h:与F5.0As2.5组比较,P<0.05;i:与F5.0As5.0组比较,P<0.05;j:与F5.0As10.0组比较,P<0.05;k:与F10.0As2.5组比较,P<0.05;l:与F10.0As5.0组比较,P<0.05;m:与F10.0As10.0组比较,P<0.05。 [Note] a: Compared with the F0.0As0.0 group, P<0.05; b: Compared with the F5.0As0.0 group, P<0.05; c: Compared with the F10.0As0.0 group, P<0.05; d: Compared with the F20.0As0.0 group, P<0.05; e: Compared with the F0.0As2.5 group, P<0.05; f: Compared with the F0.0As5.0 group, P<0.05; g: Compared with the F0.0As10.0 group, P<0.05; h: Compared with the F5.0As2.5 group, P<0.05; i: Compared with the F5.0As5.0 group, P<0.05; j: Compared with the F5.0As10.0 group, P<0.05; k: Compared with the F10.0As2.5 group, P<0.05; l: Compared with the F10.0As5.0 group, P<0.05; m: Compared with the F10.0As10.0 group, P<0.05.
图 2

氟(A)、砷(B)单独染毒时大鼠牙齿组织基因mRNA相对表达水平(x±sn=10,2-ΔΔCt

Figure 2 Gene mRNA expression levels in dental tissues of rats exposed to independent fluoride(A) or arsenic(B)

[注]BMP-2:骨形成发生蛋白2;RANK:核因子-κB受体活化因子;PI3K:磷脂酰肌醇3激酶;Akt1:蛋白激酶B1。*:与F0.0As0.0比较,P<0.05。 [Note] BMP-2: Bone morphogenetic protein Ⅱ; RANK: Receptor activator for nuclear factor-κB; PI3K: Phosphatidylinositol 3-kinase; Akt1: Protein kinases B1. *: Compared with the F0.0As0.0 group, P<0.05.
图 3

各组大鼠牙齿组织BMP-2(A)、RANK(B)、PI3K(C)、Akt1(D)mRNA相对表达(n=10,x±s,2-ΔΔCt

Figure 3 mRNA expression of BMP-2(A), RANK(B), PI3K(C), and Akt1(D) in dental tissues of rats

[注]BMP-2:骨形态发生蛋白2;RANK:核因子-κB受体活化因子;PI3K:磷脂酰肌醇3激酶;Akt1:蛋白激酶B1。a:与F0.0As0.0组比较,P<0.05;b:与F5.0As0.0组比较,P<0.05;c:与F10.0As0.0组比较,P<0.05;d:与F20.0As0.0组比较,P<0.05;e:与F0.0As2.5组比较,P<0.05;f:与F0.0As5.0组比较,P<0.05;g:与F0.0As10.0组比较,P<0.05;h:与F5.0As2.5组比较,P<0.05;i:与F10.0As2.5组比较,P<0.05;j:与F20.0As2.5组比较,P<0.05;k:与F20.0As5.0组比较,P<0.05。 [Note] BMP-2: Bone morphogenetic protein Ⅱ; RANK: Receptor activator for nuclear factor-κB; PI3K: Phosphatidylinositol 3-kinase; Akt1: Protein kinases B1. a: Compared with the F0.0As0.0 group, P<0.05; b: Compared with the F5.0As0.0 group, P<0.05; c: Compared with the F10.0As0.0 group, P<0.05; d: Compared with the F20.0As0.0 group, P<0.05; e: Compared with the F0.0As2.5 group, P<0.05; f: Compared with the F0.0As5.0 group, P<0.05; g: Compared with the F0.0As10.0 group, P<0.05; h: Compared with the F5.0As2.5 group, P<0.05; i: Compared with the F10.0As2.5 group, P<0.05; j: Compared with the F20.0As2.5 group, P<0.05; k: Compared with the F20.0As5.0 group, P<0.05.
表2

氟、砷染毒与大鼠牙齿组织BMP-2RANKPI3KAkt1 mRNA表达的偏相关分析

Table 2 Partial correlation analysis between exposure to fluoride and arsenic and mRNA expression levels of BMP-2, RANK, PI3K, and Akt1

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[基金项目] 国家自然科学基金(编号:81472927)

[作者简介] 覃子秀(1990-), 女, 硕士生; 研究方向:毒物联合作用; E-mail: 1140260310@qq.com

[收稿日期] 2018-03-18 00:00:00.0

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