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2018, 35(8):761-766.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2018.18189

孕哺期至成年前铝暴露对子鼠空间学习记忆能力和海马miR-132转录的影响


a. 贵州医科大学公共卫生学院职业卫生与环境卫生学系, 贵州 贵阳 550025 ;
b. 贵州医科大学教育部环境污染与疾病监控重点实验室, 贵州 贵阳 550025 ;
c. 贵州医科大学法医病理学教研室, 贵州 贵阳 550025 ;
d. 贵州医科大学基础医学院药理学教研室, 贵州 贵阳 550025

收稿日期: 2018-03-11;  发布日期: 2018-11-05

基金项目: 国家自然科学基金(编号:81560519);贵州省科技支撑计划(编号:黔科合支撑[2018]2753)

通信作者: 谢春, Email: xiechun36@163.com  

作者简介: 葛启迪(1990-), 男, 硕士生; 研究方向:环境与健康; E-mail:

[目的] 探讨孕哺期至成年前持续铝暴露对子鼠空间学习记忆和海马miR-132转录的影响。

[方法] 将12只清洁级健康SD孕鼠随机分为3组,每组4只。各组饮水中氯化铝浓度分别为0、600、1 000 mg/L,即对照组、低铝组、高铝组。母鼠从妊娠第0天至子鼠出生第21天染毒。从每组中随机选择8只子鼠(4雌4雄,同一窝别雌雄比为1:1)延续同组剂量继续染毒至成年(出生第90天),每2周称一次体重,子鼠处死前收集24 h尿液,Morris水迷宫实验检测空间学习记忆能力。处死后光镜观察海马组织的病理变化,采用石墨炉原子吸收法测定尿铝和脑铝含量,用实时荧光定量PCR方法检测海马组织中miR-132转录水平。

[结果] 与对照组比较,高铝组子鼠出生后0~12周体重均降低(均P < 0.01)。水迷宫结果显示:与对照组相比,染毒组在第3天和第4天逃避潜伏期延长(均P < 0.01),高铝组子鼠首次达台时间延长及穿越平台次数减少(P < 0.05,P < 0.01)。低铝组、高铝组子鼠尿铝和脑铝水平分别为(11.84±1.03)、(16.32±1.32)μg/L,(12.69±0.43)、(16.61±0.93)μg/g,均高于对照组(均P < 0.01)。与对照组比较,染毒组海马神经细胞出现核固缩,染色加深,数量减少和排列紊乱变形等病理改变;miR-132在低铝组、高铝组中的相对转录水平分别为1.48±0.35、1.62±0.38,与对照组(1.00±0.12)比较,miR-132在染毒组中转录水平均升高(P < 0.05,P < 0.01)。

[结论] 持续铝暴露损害子鼠的空间学习记忆能力,可能与海马组织中的miR-132转录水平升高有关。

关键词: 孕哺期;  铝;  miR-132;  子鼠;  学习记忆 

铝是一种神经毒物,长期暴露会对神经系统造成一定的损害,在人群流行病学和动物铝中毒模型中均发现摄入过量铝会造成学习记忆的损伤[1-2]。本课题组前期研究发现,铝会损害子鼠空间学习记忆能力[3-4],但铝致学习记忆损害的具体机制尚不清楚。母体孕期是子代神经细胞生长发育的重要阶段,母体在该阶段遭受铝暴露,是否会对子代的生长发育产生影响,特别是对智力和认知功能产生影响,这是关系到子代生长发育的重要课题。

MicroRNA(miRNA)是一类长度约19~22个核苷酸的非编码单链RNA分子。在动物中,miRNA是一群高度保守的非编码小核糖核酸,通过联结到目标mRNA的3'-非翻译区,随后使目标mRNA转录退化[5]。一个miRNA可能抑制超过100种mRNA,人体中有超过60%的蛋白编码基因的mRNA的3'-非翻译区包含有miRNA结合位点,足以证明miRNA在人体内基因调控过程中的重要性。近来研究发现,miRNA在哺乳动物大脑中有特定的时空表达模式,通过引起转录后的基因沉默,在中枢神经系统中起着至关重要的作用[6]。在突触形成、突触功能维持乃至突触可塑性改变中起关键和核心调节性作用,与高级认知功能如学习和记忆有关[7-9]

miR-132是一种特定于神经元的miRNA,在神经系统的突触发生、突触可塑性和结构重塑和支持生存、抗炎和促进记忆功能等方面起着至关重要的作用,学习记忆功能的减退也与miR-132转录升高有关[10-13]。尚未见miR-132和持续铝暴露对子鼠学习记忆影响的研究。故本研究通过模拟孕哺期亲代暴露及子代成年前自身暴露,建立亲代孕哺期至子代成年前铝暴露子鼠模型,观察子鼠空间学习记忆能力和海马组织结构形态学变化,检测尿、脑中铝含量和海马组织中miR-132的转录情况,以便为后续研究提供线索。

1   材料与方法

1.1   主要试剂与仪器

氯化铝(AlCl3,分析纯,贵州鼎国生物科技有限公司,中国),Trizol、焦碳酸二乙酯、RT-PCR kit、SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(贵阳沃尔森生物技术有限公司,中国),miR-132-3p和U6的引物(广州锐博生物科技有限公司,中国),酶标仪Multiskan GO(Thermo Scientific,美国),实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad,美国),Morris水迷宫游泳池(中国医学科学院药物研究所制备,中国),倒置显微镜(尼康,日本),ContrAA 700连续光源原子吸收光谱仪(耶拿,德国),微波消解仪(上海新仪微波化学科技有限公司,中国)。

1.2   动物分组

选择清洁级健康的Sprague Dawley孕鼠12只,随机分为3组,每组4只,体重约为210~250 g,由贵州医科大学动物实验中心提供。设施合格证编号SCXK(黔)2012-0001,动物质量合格证编号SCXK(军)2012-0011。实验经贵州医科大学动物伦理学委员会批准实施(批准编号1603184)。实验期间,大鼠自由饮水与摄食,于贵州医科大学动物实验中心饲养。饲养条件:室温(26.5±2)℃,相对湿度(60±2)%,昼夜交替为12 h。

采用自由饮水方式染毒,在各组饮水中添加AlCl3,配成溶液,均为临用现配。总离子缓冲溶液调节染毒组饮水中pH值,使其与对照组饮水中pH一致。根据课题组前期实验结果,确定对照组、低剂量组和高剂量组饮水中的AlCl3质量浓度分别为0、600、1 000 mg/L。

母鼠染毒时间为受孕第0天至子鼠出生第21天。子鼠断乳后,从每组随机选取8只子鼠(4雌4雄,同一窝别中雌雄比为1:1),延续同组剂量和方式染毒至出生第90天。每天观察动物的一般状况。实验结束后用异氟烷麻醉子鼠,心脏采血处死后,右脑用于HE染色,分离左脑海马(冰上操作)组织后-80℃保存备用。子鼠处死前收集24 h尿液。

1.3   检测指标及方法

1.3.1   子鼠体重

每2周称量一次子鼠体重,记录时间为从出生时至出生后第12周。

1.3.2   空间学习记忆能力

子代大鼠处死前,进行Morris水迷宫实验:(1)定位航行实验是用于测量实验动物对学习的获取能力。测试前,将平台固定于某一象限,测试时,将子鼠面向池壁,分别从池壁的4个象限中点入水,每次测试时各子鼠的入水点是相同的。记录每只子鼠找到平台所用的时间(即为逃避潜伏期),若找到平台时让其在平台上站立20 s,若超过60 s未找到平台,逃避潜伏期计为60 s。以逃避潜伏期的算术平均值作为该时间段的学习成绩。(2)空间探索实验用于测量受试动物对平台空间位置记忆的保持能力。在测试第5天,撤除平台,空间探索实验历时1 d,即将子鼠任选某一象限中点面向池壁入水池,让子鼠在没有平台的情况下寻找记忆中平台位置,记录子鼠穿越平台的时间和穿越平台的次数。且在测试的整个过程中,水池周围的参照物位置保持不变[14]

1.3.3   尿铝和脑铝

尿铝用石墨炉原子吸收法测定铝元素[15-16],该方法检出限为0.25μg/L,回收率为96.2%~101.4%,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为1.9%~3.0%。脑组织经微波消解后再用石墨炉原子吸收法测定脑铝含量,该方法检出限为0.25μg/g,回收率为98.2%~104.2%,RSD为1.9%~2.6%。

1.3.4   海马组织病理学检查

用10%的中性福尔马林固定子鼠左侧脑组织24 h,经梯度浓度的乙醇溶液脱水、二甲苯透明、浸蜡和包埋后用石蜡切片机对海马区域进行连续切片,切片厚度为4μm,收于防脱玻片,置于75℃的烤片机上烘烤1 h后,HE染色,镜下观察。

1.3.5   miR-132的转录

采用实时荧光定量PCR(RTqPCR)法测定海马中miR-132。每组取8只子鼠左侧海马组织。称取30 mg海马组织,Trizol法提取总RNA,将D260/D280=1.8~2.0的所有样品浓度调整为2 μg,用PrimeScriptTM RT reagent Kit将RNA逆转录cDNA,PCR反应根据SYBR Green PCR Master Mix试剂盒说明书进行。10 μL反应体系:SYBR Green 5 μL,上、下游引物各0.5 μL,cDNA 1 μL和3 μL DEPC水。每个反应样品重复3次。PCR程序:95℃ 3 min;95℃ 30 s,56℃ 30 s退火和延伸72℃ 30 s,40个循环;延伸72℃ 5 min。U6作为内参。根据2- △△Ct法计算其相对转录水平。

1.4   统计学分析

采用SPSS 18.0软件进行统计处理,实验结果采用均数±标准差表示。其中,体重和逃避潜伏期采用重复测量方差分析,其余各组均数比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法。检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   一般情况

孕鼠每日饮水量约为120 mL/kg(以体重计),从染毒开始至断乳期,各组母鼠饮水、摄食无明显差异,活动状态良好。表 1可见子鼠体重随着染毒时间的延长而逐渐增加。与对照组比较,除第0周和第2周外,低铝组在其余时间段体重均降低(均P < 0.01);高铝组在出生第0周至第12周体重均较对照组低(均P < 0.01)。

表1

持续铝暴露对子鼠体重的影响(n=8,x±sg

2.2   空间学习记忆能力

Morris水迷宫实验结果显示:与对照组比较,染毒组子鼠在第3天和第4天逃避潜伏期均较对照组明显延长(均P < 0.01);与对照组比较,高铝组子鼠首次达台时间延长(P < 0.05),穿越平台次数减少(P < 0.01);高铝组子鼠在第4天逃避潜伏期较低铝组延长(P < 0.05)。见表 2

表2

铝暴露子鼠Morris水迷宫实验结果(n=8,x±s

2.3   尿铝和脑铝浓度

表 3可见:与对照组比较,染毒组子鼠尿铝、脑铝浓度均升高(均P < 0.01);与低铝组比较,高铝组子鼠尿铝、脑铝浓度均升高(均P < 0.05)。

表3

铝暴露对子鼠尿铝和脑铝浓度的影响(n=8,x±s

2.4   海马组织病理改变

图 1可见:对照组子鼠海马区组织结构清晰,神经元大小一致、排列紧密均匀,细胞核较规则、染色淡、核仁可见;低铝组子鼠海马区神经元出现细胞体积缩小,胞浆红染,细胞核固缩,结构模糊等变化;高铝组子鼠海马区神经细胞受损程度较低铝组重。

图 1

各组子鼠海马组织病理结果(HE)

2.5   miR-132的转录

与对照组(1.00±0.12)比较,miR-132在低铝组(1.48±0.35)、高铝组(1.62±0.38)子鼠中的相对转录水平均升高(P < 0.05或P < 0.01)。

3   讨论

本实验中,随着AlCl3染毒浓度的增加和染毒时间的延长,染毒组子鼠体重增长缓慢,提示铝暴露抑制了子鼠的生长发育。尿铝为机体摄入铝、机体吸收铝及排泄铝能力等综合作用的结果,能有效反映机体铝负荷情况及环境中铝暴露水平。有研究发现脑铝含量的增加可干扰大鼠脑细胞活动,破坏神经元结构,形成神经纤维缠结,导致中枢神经系统功能障碍,进而影响长时程增强的形成和维持,从而影响认知功能[17]。本实验结果显示:染毒组子鼠尿铝、脑铝含量均高于对照组,提示机体摄入铝后,虽可通过尿液排出,但铝仍可通过血脑屏障并蓄积于脑组织中。

海马是脑组织内参与学习记忆的重要结构。在神经系统发育过程中,大脑内神经元及突触可形成复杂的突触网络,是脑内信息传递和储存的场所,也是脑内的高级神经活动-学习和记忆的神经生物学基础。有研究表明,海马结构异常与认知功能障碍和学习、记忆能力下降有关[18-19]。大鼠孕期染铝可导致子代鼠脑神经元数量减少,从而导致子代鼠神经发育障碍[20]。本研究发现:与对照组比较,染毒组子鼠海马神经细胞体积缩小,胞浆红染,细胞核固缩,结构模糊,病变神经元大小不一,形态不规则,排列紊乱,说明铝通过血脑屏障蓄积在脑组织中,损害了海马结构,推测可能因此影响学习记忆的功能。本研究还发现:在定位航行实验中,染毒组子鼠在第3天和第4天逃避潜伏期均较对照组延长,表明持续铝暴露可损伤子鼠的学习记忆获取的能力;在空间探索实验中,高铝组子鼠首次达台时间延长,穿越平台次数减少,提示铝暴露可损害子鼠对平台位置记忆的能力。

在中枢神经系统中,miRNA已经成为一系列发育、生理和认知过程的重要效应物。受环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cyclic AMP-response element binding protein,CREB)调控的miR-132已经被证明可以影响神经元的成熟。在成熟的神经系统中,正常生理条件下miR-132的转录量必须维持在有限的范围内,以保证正常的学习和记忆形成,miR-132的失调在许多神经认知障碍中起作用[21]。轻度认知障碍患者血清中miR-132水平较正常对照组升高[22]。miR-132可参与慢性脑低灌注和甲基CpG结合蛋白2的下调,可能通过脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)及其下游通路在永久双侧颈总动脉闭塞后,通过BDNF和其下游通路参与认知缺失[23]。围生期氟暴露对仔鼠学习和记忆损伤可能部分是由于miR-132的增强和靶基因的改变[24]。本研究中染毒组子鼠miR-132转录水平较对照组中明显升高,说明孕哺期至成年前持续铝暴露可导致子鼠海马中的miR-132高转录,推测其可能是子鼠空间学习记忆损害的中间环节,但其具体机制有待探索。

综上所述,持续铝暴露可能导致子鼠海马组织中miR-132的高转录,从而对子鼠学习记忆产生损害,但其具体机制仍有待进一步深入研究。

表1

持续铝暴露对子鼠体重的影响(n=8,x±sg

Table 1
表2

铝暴露子鼠Morris水迷宫实验结果(n=8,x±s

Table 2
表3

铝暴露对子鼠尿铝和脑铝浓度的影响(n=8,x±s

Table 3
图 1

各组子鼠海马组织病理结果(HE)

Figure 1 [注]A:对照组;B:低铝组;C:高铝组。黑色箭头指示正常结构,绿色箭头指示结构模糊、核固缩等病理变化。

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[基金项目] 国家自然科学基金(编号:81560519);贵州省科技支撑计划(编号:黔科合支撑[2018]2753)

[作者简介] 葛启迪(1990-), 男, 硕士生; 研究方向:环境与健康; E-mail: 1032169845@qq.com

[收稿日期] 2018-03-11 00:00:00.0

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