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2018, 35(12):1134-1138.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2018.18156

美洲大蠊活性组分对矽尘致大鼠肺纤维化的影响


1. 大理大学药学与化学学院, 云南 大理 671000 ;
2. 云南省昆虫生物医药研发重点实验室, 云南 大理 671000 ;
3. 楚雄医药高等专科学校, 云南 楚雄 675005

收稿日期: 2018-02-11;  发布日期: 2019-01-07

基金项目: 国家自然科学基金(编号:81360634,81560634);云南省科技厅重点项目(编号:2015FA025)

通信作者: 肖培云, Email: xpy990120@126.com  

作者简介: 张春妹(1991-), 女, 硕士生; 研究方向:抗纤维化研究; E-mail:

[目的] 探讨美洲大蠊抗肺纤维化活性组分(ML-HB)对矽肺大鼠纤维化的影响。

[方法] 成年雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、ML-HB高、中、低剂量组,每组32只。除正常组外,其余各组采用气管暴露法注入SiO2混悬液复制矽肺模型,模型复制后第3天,经腹腔给药干预,ML-HB高、中、低剂量组以120、60、30 mg(/kg·d)给药,模型组给予等剂量生理盐水,正常组无特殊处理。给药后第30、45、60、75天分别处死8只大鼠,并观察大鼠肺组织外观,采用免疫组织化法观察α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)与I型胶原(COL-I)的表达,ELISA法检测肺匀浆中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β1(TGF-β1)的质量体积浓度。

[结果] 模型组大鼠肺组织体积明显增大,颜色暗红且不均匀,表面被灰白色斑状结节覆盖,触之有沙粒感,无弹性,表明矽肺模型复制成功。与正常组比,各时间点模型组α-SMA、COL-I阳性表达增强,TNF-α和TGF-β1质量体积浓度升高(P<0.05)。与模型组相比,ML-HB各剂量组α-SMA、COL-I表达有所降低,中剂量组改善最明显;ML-HB中剂量组TNF-α、TGF-β1质量体积浓度均降低(P<0.05)。

[结论] ML-HB可降低SiO2染毒后肺组织中α-SMA、COL-I、TNF-α和TGF-β1的表达,延缓肺组织炎性病变、干预胶原蛋白的沉积,从而抑制肺纤维化的进一步发展。

关键词: 美洲大蠊;  活性组分;  矽肺;  大鼠;  肺纤维化 

矽肺是由于长期吸入游离SiO2粉尘引起的职业性肺疾病, 通常表现为持续的炎症反应、成纤维细胞增生、过量的胶原沉积, 最终导致肺间质纤维化[1]。肺纤维化中细胞外基质合成和沉积[2-3]主要来源于肌成纤维细胞, α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin, α-SMA)是肺组织中出现肌成纤维细胞的标志, 也是肌成纤维细胞具有收缩活性及迁徙能力的结构基础[4]。胶原蛋白是细胞外基质的主要成分, 其过量积聚是肺纤维化的特征性病理变化, I型胶原(collagen type I, COL-I)是肺内主要胶原成分之一, 常作为反映肺纤维化的指标[5]。对矽肺的治疗, 目前临床上多选用糖皮质激素、干扰素、秋水仙碱等药物进行长期治疗, 但这类药物副作用大, 且不能有效阻止肺纤维化的进一步发展[6-7]。因此, 寻找能更好治疗肺纤维化疾病的药物是目前研究的热点之一。

美洲大蠊(Periplaneta Americana)为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫, 蜚蠊作为药用最早记载于《神农本草经》, "味咸、寒, 生川泽, 治血瘀症坚、寒热, 破积聚, 喉咽痹, 内寒无子"[8]。近年来的研究表明, 美洲大蠊具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗肝损伤及抗肝纤维化等药理作用[9-11], 但未见其对抗肺纤维化方面的研究报道。课题组前期对药用昆虫美洲大蠊的研究发现, 其提取物对转化生长因子-β1 (transforming growth factor-beta 1, TGF-β1)诱导的人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblast, HEL)增殖过程中COL-I mRNA和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)mRNA的表达具有明显的抑制作用, 并筛选得到了抗肺纤维化活性组分[12], 命名为ML-HB。本研究拟建立大鼠矽肺模型, 研究ML-HB对矽尘致大鼠肺纤维化的影响, 为美洲大蠊提取物抗肺纤维化的深入研究提供理论基础。

1   材料与方法

1.1   动物

SPF级昆明种SD大鼠, 雄性[湖南斯莱克景达实验动物有限公司, 中国, 许可证号: SCXK (湘) 2013-0004, 批号: 20150911], 体重180~200 g, 自由采食和饮水, 饲养环境符合GB 14952-2010 《实验动物环境及设施》有关无特定病原体的要求。

1.2   仪器与试剂

SN255939多功能酶标仪(BioTek, 德国); 80-2台式电动离心机(金坛市科析仪器有限公司, 中国); AL204-IC电子分析天平(Mettler Toledo, 瑞士); U570-86超低温冰箱(Eppendorf, 德国); PHY- Ⅲ病理组织漂烘仪、RHY Ⅲ组织切片机、BMJ- Ⅲ组织包埋机(常州市中威电子仪器有限公司, 中国); TS00倒置显微镜(Nikon, 日本); ASP-300S自动脱水机(Leica, 德国)。

ML-HB由实验室自制; SiO2分散型粉末(99%, 0.5~5μm; Sigma, 美国); 肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)抗体、TGF-β1抗体、ELISA试剂盒(欣博盛生物科技有限公司, 中国); α-SMA抗体和COL-I抗体(Proteintech, 美国); 戊巴比妥钠(Sigma, 德国)。

1.3   ML-HB的制备

取美洲大蠊药材适量, 粉碎, 以乙醇为溶剂, 按料液比1:5提取3次, 每次2.5 h, 提取温度为80℃。合并提取液, 减压浓缩, 脱脂后经HP20大孔吸附树脂静态吸附8 h, 用2倍柱体积的水、3倍柱体积的70%乙醇依次洗脱, 收集洗脱液, 减压浓缩, 冷冻干燥, 即得。命名为ML-HB, 提取率约1.0%。

1.4   溶液配制

1.4.1   SiO2混悬溶液的配制[13]

称取2 500 mg SiO2于玛瑙研钵中, 加15 mL生理盐水研磨2~3 h, 将SiO2混悬溶液转移至50 mL容量瓶中, 研钵用生理盐水洗净。洗液转移至容量瓶中, 再加适量青霉素液, 用生理盐水定容成含1 000 U/mL青霉素的50 g/L SiO2混悬溶液。临用现配。

1.4.2   麻醉药的配制

10 g戊巴比妥钠加200 mL生理盐水, 即得5%的戊巴比妥钠溶液。

1.5   动物分组及染毒

大鼠按体重随机分为正常组, 模型组, ML-HB高、中、低剂量组, 每组32只。按1 mL/100 g (以体重计)的剂量腹腔给予各组大鼠5%的戊巴比妥钠溶液, 10~20 min后进入浅麻后, 采用气管暴露式注入50 g/L的SiO2混悬液0.5 mL [14], 正常组给予等体积的生理盐水。复制模型第3天开始, 进行药物干预, ML-HB高、中、低剂量组按前期预实验结果分别给予120、60、30 mg(/ kg·d)的ML-HB冻干粉溶液[15], 模型组给予等剂量生理盐水, 正常组无特殊处置。采用腹腔给药, 每天一次, 至实验结束。

1.6   肺组织病理学观察

取各时间点处死大鼠的全肺, 观察其外观, 并将整个左肺放入10%福尔马林溶液中固定, 石蜡包埋, 制作厚度5 µm切片, 用于免疫组化染色, 光学显微镜下观察肺组织中α-SMA与COL-I的表达。

1.7   TNF-α和TGF-β1的测定

在连续给药第30、45、60、75天时, 各组分别取8只大鼠根据体重经腹腔注射戊巴比妥钠(1 mL/100 g)麻醉后处死, 精密称取大鼠右肺组织约0.4 g, 制备匀浆液, 3 000 r/min (r=163.5 mm)离心取上清液, -80℃保存备用。采用ELISA法检测匀浆液中的TNF-α和TGF-β1质量浓度。

1.8   统计学分析

用SPSS 17.0进行统计分析。计数资料采用x±s表示, 组间比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   各组大鼠肺组织外观观察

在连续给药第30、45、60、75天时, 正常组大鼠双肺无异常, 呈粉红色, 颜色均匀, 大小正常, 表面光滑, 富有弹性。模型组第30天时肺组织体积明显增大, 双肺颜色暗红且不均匀, 边缘可见点状出血, 肺脏润泽度下降, 可见大小不一、凹凸不平的少量灰白色斑状结节, 弹性差, 触之较硬, 第45天时较第30天时灰白色斑状矽结节增多, 第60天时双肺触之有沙粒感, 无弹性, 气管质地变硬, 脆性较大, 肺组织表面几乎被灰白色斑状结节覆盖, 第75天时较第60天, 肺组织表面几乎完全被灰白色斑状结节覆盖。ML-HB各组第30天时出现少量灰白色斑状结节, 第45天时灰白色斑状矽结节增多, 第60、75天肺组织表面大量灰白色斑状结节, 但各时间点病症的较模型组轻, 其中中剂量组最轻。

2.2   ML-HB对大鼠肺组织中α-SMA的影响

正常组在连续给药第30、45、60、75天时, 仅在血管、气道平滑肌呈现α-SMA棕褐色阳性染色, 肺间质中均未见阳性表达。模型组第30天起, 肺组织间质成纤维细胞、成纤维细胞样细胞出现α-SMA强阳性表达, 在纤维化程度高的区域内可见少量棕褐色着色颗粒, 颗粒体积小; 随着时间的延长, 棕褐色着色颗粒数量增多, 体积变大; 第75天时矽肺结节周围可见密集的棕褐色着色颗粒, 且体积更大。ML-HB各剂量组第30、45、60、75天时的α-SMA阳性表达较模型组低, 且中剂量组棕褐色颗粒最少, 阳性表达最低。见图 1

图 1

矽肺大鼠肺组织α-SMA染色结果(×100)

2.3   ML-HB对大鼠肺组织中COL-I的影响

免疫组化染色结果显示, 正常组第30、45、60、75天时肺组织结构清晰, 肺泡壁未见增厚, 肺泡上皮细胞结构完整, 无明显胶原沉积。模型组在第30天时出现胶原沉积; 随着时间推移, 阳性表达增强, 成纤维细胞及其基质增生明显, 即纤维化程度明显; 第60、75天出现玻璃样变矽结节, 矽结节周围棕黄色着色的COL-I明显沉积, 矽结节中心区域高度纤维化, 呈大面积弥漫状分布, 即洋葱样病变, 故难以着色。ML-HB各剂量组第30天时肺泡间隔增宽, 成纤维细胞及其基质增生明显, 棕黄色着色的COL-I沉积较少; 第45天时棕黄色着色的COL-I沉积明显; 第60天、75天时肺泡间隔增宽, 成纤维细胞及其基质增生明显, 呈棕黄色着色的COL-I沉积, 胶原分布于矽结节周围。ML-HB各剂量组第30、45、60、75天时均较模型组低。见图 2

图 2

矽肺大鼠肺组织COL-I染色结果(×100)

2.4   ML-HB对TNF-α的影响

正常组、模型组、ML-HB各剂量组的肺匀浆中TNF-α质量体积浓度随染毒时间延长而增加; 与第30天相比, 第60、75天时TNF-α质量体积浓度均增加, 差异有统计学意义(P<0.05)。与正常组相比, 各时间点模型组TNF-α质量体积浓度均增加, 差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比, 各时间点ML-HB中剂量TNF-α质量体积浓度均降低, 差异有统计学意义(P<0.05)。见表 1

表1

ML-HB对矽肺大鼠肺组织TNF-α质量体积浓度的影响

2.5   ML-HB对TGF-β1的影响

正常组肺匀浆中TGF-β1质量体积浓度随时间延长, 差异无统计学意义(P > 0.05)。模型组、ML-HB各剂量组TGF-β1质量体积浓度随时间延长而增加; 与第30天相比, 第60、75天时TGF-β1质量体积浓度均增加, 差异有统计学意义(P<0.05)。与正常组比, 各时间点模型组TGF-β1质量体积浓度均增加, 差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比, 各时间点MLHB中剂量组TGF-β1质量体积浓度均降低, 差异有统计学意义(P<0.05)。见表 2

表2

ML-HB对矽肺大鼠肺组织TGF-β1质量体积浓度的影响

3   讨论

中医将肺纤维化称为"肺痿" "肺痹", 从中医的辨证分型来看, 肺纤维化属"气阴两虚、气滞血瘀、血脉瘀阻证"[16], 在治疗上以活血化瘀通络, 补肺健脾益肾为主。美洲大蠊具有抗肺纤维化的作用, 可能与其具有"治血瘀症坚、破积聚"[8]的功效有关。

矽肺肺纤维化是一种进行性致命的疾病。在形成纤维化的过程中, TNF-α在局部损伤和炎症反应中起着至关重要的作用[17-18], 主要由脂多糖激活的单核巨噬细胞和活化的T淋巴细胞产生, 是介导多向性炎症反应和免疫调节反应的细胞因子, 其表达在肺纤维化发病过程中起重要作用[19]。TGF-β1对成纤维细胞既是一种强有力的趋化因子, 又是一种强烈的促进细胞分裂剂, 能够促进成纤维细胞产生结缔组织蛋白, 促其转型为肌成纤维细胞[20-21], 而后者又分泌TGF-β1进一步促其转型分化, 从而导致纤维化的迁延[22]。TNF-α、TGF-β1一方面参与矽肺病变中的肺部炎症反应, 使其在损伤组织中局部表达量增高, 另一方面, 促进肺组织胶原沉积, 启动肺纤维化发生, 共同推动矽肺纤维化不可逆发展。因此, 研究肺组织TNF-α、TGF-β1含量的变化可以确定矽肺纤维化的程度。

研究结果表明, 模型组肺组织中TNF-α、TGF-β1表达明显高于正常组, 说明矽肺大鼠模型存在TNF-α、TGF-β1异常增高的病理状态。用美洲大蠊提取物MLHB进行干预后, 与模型组比较, ML-HB各剂量组的TNF-α、TGF-β1、COL-I、α-SMA均较低, 表明ML-HB对肺纤维化大鼠有一定的治疗作用, 但中剂量组较高、低剂量组效果更明显, 药效与剂量之间呈现U型分布, 这可能与实验方案中药物剂量的设计不尽完善有关, 在后续实验中将进一步改进。

对于实验中正常组肺匀浆中TNF-α质量体积浓度随时间而增加这个现象, 可能是因为正常组在造模过程中同样采用气管暴露法注入等量生理盐水, 对肺产生刺激, 引起一定的炎症应激反应。

综上, 美洲大蠊提取物ML-HB可在一定程度上延缓肺组织炎性病变, 抑制肺纤维化的进一步发展, 其抗肺纤维化的作用可能是通过降低TNF-α、TGF-β1、α-SMA和COL-I的表达, 干预胶原蛋白的沉积, 进而改善大鼠肺纤维化程度, 但在矽肺炎性反应和纤维化病程中, TNF-α、TGF-β1、α-SMA、COL-I彼此之间以及与其他细胞因子之间的协同和拮抗作用的网络机制尚不清晰, 有待后续深入研究。

图 1

矽肺大鼠肺组织α-SMA染色结果(×100)

Figure 1 [注]A:正常组(第75天);B:模型组(第30天);C:模型组(第75天);D:ML-HB中剂量组(第30天);E:ML-HB中剂量组(第75天)。正常组病理切片在各个时间点无明显差异,因此仅展示正常组第75天时α-SMA染色结果。ML-HB高、低剂量组大鼠肺纤维化的改善效果较中剂量组稍差,但无明显差异,因此仅展示中剂量组的图片。箭头所指为免疫组化染色后α-SMA棕褐色颗粒。
图 2

矽肺大鼠肺组织COL-I染色结果(×100)

Figure 2 [注]A:正常组;B:模型组(第30天);C:模型组(第75天);D:ML-HB中剂量组(第30天);E:ML-HB中剂量组(第75天)。正常组病理切片在各个时间点无明显差异,因此仅展示正常组第75天时COL-I染色结果。ML-HB高、低剂量组肺纤维化的改善效果较中剂量组稍差,但无明显差异,因此仅展示中剂量组的图片。箭头所指为免疫组化染色后COL-I棕黄色着色。
表1

ML-HB对矽肺大鼠肺组织TNF-α质量体积浓度的影响

Table 1
表2

ML-HB对矽肺大鼠肺组织TGF-β1质量体积浓度的影响

Table 2

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[基金项目] 国家自然科学基金(编号:81360634,81560634);云南省科技厅重点项目(编号:2015FA025)

[作者简介] 张春妹(1991-), 女, 硕士生; 研究方向:抗纤维化研究; E-mail: 542058681@qq.com

[收稿日期] 2018-02-11 00:00:00.0

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