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2018, 35(6):536-540.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2018.17744

PM2.5染毒干扰心肌细胞分化发育的体外实验


a. 苏州大学医学部公共卫生学院, 江苏 苏州 215123 ;
b. 苏州大学医学部基础医学与生物科学学院, 江苏 苏州 215123

收稿日期: 2017-12-18;  发布日期: 2018-07-06

基金项目: 国家自然科学基金项目(编号:81741004)

通信作者: 姜岩, Email: yjiang@suda.edu.cn  

作者简介: 王会敏(1990-), 女, 硕士生; 研究方向:PM心肌发育毒性; E-mail:

[目的] 研究PM2.5染毒对心肌细胞分化发育的影响。

[方法] 利用P19畸胎瘤干细胞,建立体外心肌定向分化模型,MTT法检测PM2.5染毒对P19细胞毒性,PM2.5染毒浓度为0、1、10、100 mg/L,选择未产生明显细胞毒性的10 mg/L PM2.5于P19细胞未分化时期染毒48 h后启动分化。显微镜下观察形态学改变,实时荧光定量PCR检测不同分化期OCT4ISL-1MLC2V的表达变化(OCT4ISL-1MLC2V分别为干细胞全能性阶段、心肌前体期、成熟心肌期标志基因),免疫荧光及流式细胞术检测成熟心肌肌钙蛋白cTNT的表达效率。

[结果] 与对照组相比,PM2.5组细胞形态学发生改变;分化各阶段的标志物表达异常:OCT4在未分化时期表达降低约80%(P < 0.01),分化启动后反而增高(P < 0.05);ISL-1于心肌前体期表达降低为对照组的59%(P < 0.01);MLC2V于成熟细胞期表达降低为对照组的39%(P < 0.01)。成熟心肌cTNT表达比例由对照组的61%下降到47%,但差异无统计学意义。

[结论] 心肌分化早期染毒PM2.5,可阻碍干细胞向心肌细胞的分化过程。

关键词: PM2.5 心肌分化;  P19畸胎瘤干细胞;  心肌毒性 

近年来,大气污染带来的健康损失和经济负担引起了公众和政府的高度关注[1]。大量流行病学研究表明PM2.5会造成多种健康问题,尤其是呼吸系统疾病和心血管系统疾病[2]。因此,开展大气污染对健康危害的研究十分迫切[3-4]

心脏是胚胎发育中形成最早的脏器,一旦心脏发育异常,胚胎发育将受到严重干扰[5]。有研究表明,胎儿期及婴儿期PM2.5暴露与成年期心血管疾病相关[6]。但目前国内外关于PM2.5的研究多为流行病学研究,机制性研究相对较少,实验性研究多关注成年动物和人的呼吸系统及心血管系统疾病,涉及胚胎心脏发育毒性的研究相对匮乏,特别是PM2.5是否具有心脏发育毒性亟待验证[7]

本课题组前期研究表明,PM2.5染毒会增加斑马鱼心脏发育畸形率[8]。但在胚胎发育过程中,尤其是心肌分化过程中,PM2.5的作用机制仍有待于进一步研究。本研究采用P19畸胎瘤干细胞建立体外心肌分化模型,初步探讨PM2.5的心肌发育毒性。

1   材料与方法

1.1   PM2.5样品的采集和提取

应用智能中流量总悬浮颗粒物采样器(天虹,TH-150C,中国)采集PM2.5样品,采样速率为100L/min,采样时间为2015年8月1—7日共7 d,每天采样24 h,采样地点为苏州市工业园区。收集7d的PM2.5样品混合在一起,提取有机提取物后储存在-20℃冰箱中备用。PM2.5成分分析显示硫酸盐(29%,质量分数,后同)、有机碳(19%)、铵盐(18%)、硝酸盐(14%)构成PM2.5总量的80%,有机提取物中含有美国环境保护署优先检测的16种多环芳烃中的9种,且含有多种芳烃受体激动剂[9]。本实验中PM2.5均指PM2.5有机提取物。PM2.5采样、有机提取物的提取过程详见本课题组前期研究[8]

1.2   MTT细胞毒性实验

MTT试剂盒(BOSTOR,美国)检测PM2.5对未分化P19细胞(中科院细胞所细胞库,型号:TCM27)毒性效应,操作按照MTT试剂盒说明书进行。未分化P19细胞接种于96孔板,接种密度为5× 104个/mL,PM2.5染毒质量浓度(后称浓度)为:0(阴性对照组)、1、10、100 mg/L,设置阳性对照组(0.5%Triton× 100)和空白对照组(不接种细胞),处理48h。每孔加入10μL MTT染色液,培养4 h,再加入100 μL Formanzan溶解液,置摇床上低速震动30 min。用酶标仪(Molecular Devices,美国)于570 nm测定光密度值。重复三次实验,计算相对增殖力,相对增殖力=(D实验组-D空白对照组)/(D阴性对照组-D空白对照组)。经MTT细胞毒性试验,筛选出合适的非细胞毒性PM2.5染毒浓度进行后续研究。

1.3   P19细胞的培养和体外分化

未分化P19培养在P19培养基中,α-MEM基础培养基和胎牛血清体积比为9: 1,补加双抗(100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素),置于37℃培养箱中(95%湿度,5%CO2)孵育。未分化时期染毒PM2.5 48 h,设立对照组,以10 mg/L浓度染毒启动分化(第0天,记作D0),1%DMSO作诱导剂,细胞密度5× 105个/mL,悬浮培养4 d,形成的细胞拟胚体转移至包被0.1%明胶的6孔板,贴壁培养至分化第14天(记作D14)。

1.4   免疫荧光法检测心肌肌钙蛋白(cardiac troponin T,cTnT)的分布

取D14成熟心肌细胞用0.25%胰蛋白酶(Hyclone,美国)消化1 min,轻轻吹打成单个细胞后接种于带10 mm盖玻片的6孔板中,预铺0.1%明胶。贴壁培养24 h,4%多聚甲醛固定30 min,0.5%Triton透膜30 min,1%牛血清白蛋白封闭1 h,加入一抗cTnT(1: 250,Abcam,美国),4℃孵育过夜;次日,PBS洗3次,加荧光二抗(1: 500,Sigma,美国)孵育1 h,4'6-二脒基-2-苯基吲哚(4'6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染核后,封片固定。于激光共聚焦荧光显微镜下观察心肌肌钙蛋白cTNT的分布情况。

1.5   流式细胞仪检测心肌肌钙蛋白cTnT的表达

收集贴壁分化D14成熟心肌细胞,PBS洗后4%甲醛室温固定0.5 h;冰上加入9 mL冰甲醇破膜15 min;1%牛血清白蛋白室温封闭1 h;加入100 μL cTNT一抗(1: 250)抗体,4℃孵育过夜;次日,PBS洗后加入1: 100的荧光二抗(同上)100 μL,室温避光孵育1 h;0.2%Triton× 100(碧云天,中国)洗后,PBS洗,加入500μL PBS重悬,流式细胞仪(Beckman Coulter,美国)检测cTcT蛋白表达。

1.6   实时荧光定量PCR测定不同分化期标志基因表达

分别于D0、D4、D8、D14收集部分细胞产物。Trizo(l天根,中国)用于提取细胞产物总RNA,RevertAcid First Strand cDNA Synthesis Ki(t Takara,日本)用于RNA逆转录为cDNA,定量1μg,总体系20μL。逆转录产物稀释5倍后,取2 μL作为实时荧光定量PCR的模板,2× SYBR Green qPCR Master Mix用于PCR扩增。反应条件为:95℃ 2 min,95℃ 15 s变性,60℃ 1 min延伸,40个循环,绘制溶解曲线。干细胞全能性阶段、心肌前体期、成熟心肌期的标志基因分别为OCT4ISL-1MLC2V,内参为GAPDH(引物序列详见表 1)。2-ΔΔCt表示实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。

表1

实时荧光定量PCR引物序列

1.7   统计学分析

所有的数据均以x±s表示,使用Graphpad Prism5软件作图及统计学分析,两组间比较使用成组t检验,多组间比较使用单因素方差分析,进一步两两比较采用Dunnett’s t检验。检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   PM2.5无细胞毒性实验剂量的确定

与阴性对照组相比,1、10 mg/L组PM2.5细胞相对增殖力变化不明显,100 mg/L组产生了明显的细胞毒性(图 1A)且细胞出现片状死亡现象(图 1B)。故选择未产生明显细胞毒性的10 mg/L为后续研究的染毒浓度。

图 1

PM2.5对P19细胞的毒性

2.2   P19心肌定向分化模型的建立及形态学变化

显微镜下观察对照组和10 mg/L PM2.5组细胞分化过程中的形态差异,可见PM2.5组未分化期P19细胞克隆松散,克隆性下降;悬浮期拟胚体紧致性下降,边缘不整齐,基线不清晰;贴壁分化期细胞分化慢(图 2)。

图 2

P19干细胞心肌不同分化阶段形态学变化

2.3   cTNT蛋白表达的变化

免疫荧光结果显示,PM2.5染毒组与对照组的细胞形态表征无明显差别(图 3)。流式细胞术结果显示,对照组与PM2.5染毒组cTNT蛋白表达的差异(61% vs 47%)没有统计学意义(P> 0.05)。

图 3

免疫荧光和流式细胞术检测成熟心肌标志物cTnT蛋白的变化

2.4   P19干细胞心肌定向分化各时期相关标志物的变化

与对照组相比,PM2.5染毒组心肌分化各阶段特异性标志物表达轨迹异常。对照组OCT4于未分化时期(D0)大量表达,随着分化的启动表达量迅速下降;PM2.5染毒后,未分化阶段OCT4表达明显受到抑制(降低约80%,P < 0.01),随着分化的进行反而增高(图 4A)。对照组ISL-1于心肌前体细胞形成阶段(D4至D8)表达逐渐升高,随着D8至D14期间成熟心肌细胞的形成,其表达降低;PM2.5染毒后,ISL-1于分化早期有所升高,分化中晚期受到抑制(降低为对照组的59%,P < 0.01)(图 4B)。对照组MLC2V于成熟心肌细胞形成阶段表达逐渐上升,至分化末期达到峰值;PM2.5染毒后,峰值明显下降(为对照组的39%),分化过程受到抑制(P < 0.01)(图 4C)。

图 4

实时荧光定量PCR检测心肌定向分化各阶段标志基因表达

3   讨论

P19细胞系是小鼠畸胎瘤细胞系,具有干细胞的全能性,在体外培养条件下,可无限复制增殖,传代过程中不会丧失干细胞的全能性,是一种常用的心肌毒性研究模型[10-11]。P19广泛用于评估多种药物和毒物的发育毒性,尤其是神经发育毒性和心肌发育毒性[12]

影响P19心肌分化的因素较多,如P19干细胞的干性,化学诱导剂添加的剂量及时程,接种悬液的密度及均匀度,成球过程中外力的作用等[13]。本研究控制影响分化的干扰因素,使混杂因素尽量保持一致。由于客观因素影响,如P19细胞的干性、悬液的均一度、外力作用的力度等,多次重复的结果存在一定差异,但总体趋势是一致的,多次重复实验结果均表明PM2.5染毒能干扰P19心肌分化过程。

PM2.5是空气动力学直径小于或等于2.5 μm的悬浮颗粒物的总称,含有多种有机组分和无机组分[14]。研究表明,PM2.5中的金属成分会导致心血管疾病,对心血管内皮产生氧化损伤效应[15]。本研究所收集的PM2.5平均总浓度为66.5 mg/m3,提取其中的有机成分后,按浓度高低依次为:二苯并蒽、苯并蒽、苯丙芘、苯并荧蒽、菲、屈、蒽、芴、茚并芘,这些多环芳烃类物质中含有多种常见的芳烃受体激动剂,进入有机体及细胞后通过异常激活内源性多环芳烃受体信号通路,扰乱机体及细胞的正常分化过程,从而产生发育毒性[8-9]。据此,本课题组提出并展开了PM2.5有机提取物产生胚胎心脏发育毒性的相关研究。

本研究表明,PM2.5有机提取物能导致P19心脏分化异常和分化效率降低,但由于只是细胞模型,不能判断其导致心肌发育异常的类型。而且,PM2.5有机提取物成分复杂,难以确定产生心肌发育毒性的具体成分及各成分之间是否会产生联合效应等。尽管如此,人体接触PM2.5不可避免且以混合成分吸入,本研究将PM2.5混合物作为一个不可分割的整体物质,研究这种物质整体的危害及其可能机制,具有实际意义。

体外干细胞心肌分化模型符合毒理学试验3R原则中的“replacement”原则,但研究结果外推至人时存在多种不确定性。PM2.5为大气污染物的主要构成之一,不易沉降,可长时间悬浮于大气中。人体主要通过吸入的方式暴露于PM2.5,本实验中直接将PM2.5有机提取物溶于有机溶剂后加入培养的细胞中,这种染毒方式更加直接,但与人体实际的接触方式存在差异。大气中PM2.5通过呼吸道进入肺部的过程中,其中的大粒径颗粒物及不溶性成分会被上呼吸道的纤毛防御系统及黏液物质吸附并随着呼吸及喷嚏作用排出人体,只有部分粒径较小的可溶性成分能够深入到细支气管及肺泡并通过血气屏障进入血液循环,对人体的心血管系统及其他系统产生毒性作用,所以实验剂量的PM2.5有机提取物实际进入人体的内剂量及相应的成分存在较大的差异,其产生的毒性类型及强度存在差异。

流行病学调查表明,胚胎发育过程染毒PM2.5与成年期心血管疾病高发呈正相关,但没有对染毒窗口期的研究[16]。胚胎的心脏发育启动较早,对外源化学物较敏感[17]。本研究在P19未分化阶段加药处理48 h后启动分化过程,发现PM2.5早期染毒可导致P19心肌细胞形态学发生改变;分化过程和分化标志物表达异常,包括:全能性标志OCT4表达下降,随着分化的进行反而相对增高;心肌前体标志ISL-1、成熟心肌标志MLC2V分别于心肌前体期、成熟心肌期表达下降,据此推断PM2.5染毒阻滞并抑制了干细胞向心肌细胞的分化过程。同样的,成熟心肌蛋白cTnT表达下降,表明胚胎发育初期是PM2.5染毒的敏感期,可能是造成成年期心血管疾病高发的危险因素之一。综上所述,胚胎干细胞心脏发育早期染毒PM2.5会导致胚胎心脏的发育异常,扰乱心肌细胞的正常分化。

表1

实时荧光定量PCR引物序列

Table 1
图 1

PM2.5对P19细胞的毒性

Figure 1 [注]A:MTT试验;B:镜下观察(×200)。1:阴性对照组;2:Tritonx-100;3:1 mg/L PM2.5;4:10 mg/L PM2.5;5:100 mg/L PM2.5。**:与对照组相比,P < 0.01。
图 2

P19干细胞心肌不同分化阶段形态学变化

Figure 2 [注]A:对照组;B:10 mg/L PM2.5组。1:未分化期;2:悬浮成球期;3:贴壁分化期。
图 3

免疫荧光和流式细胞术检测成熟心肌标志物cTnT蛋白的变化

Figure 3 [注]A:对照组;B:10 mg/L PM2.5组。1:DAPI;2:cTcT;3:Merge。DAPI代表细胞核定位,Merge代表细胞核与cTcT蛋白的共定位。于荧光显微镜下观察,绿色荧光表示cTnT染色阳性,cTnT分布在细胞胞浆中。
图 4

实时荧光定量PCR检测心肌定向分化各阶段标志基因表达

Figure 4 [注]OCT4为全能性相关标志;ISL-1为心肌前体标志;MLC2V为成熟心肌标志。与对照组比较,*:P < 0.05;**:P < 0.01。

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[基金项目] 国家自然科学基金项目(编号:81741004)

[作者简介] 王会敏(1990-), 女, 硕士生; 研究方向:PM心肌发育毒性; E-mail: fly.wanghuimin@gmail.com

[收稿日期] 2017-12-18 00:00:00.0

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