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2018, 35(4):291-296.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2018.17743

氮杂纳米二氧化钛对肺的损伤效应


1. 贵州医科大学公共卫生学院毒理卫生教研室, 贵州 贵阳 550025 ;
2. 陆军军医大学军事预防医学院环境卫生教研室, 重庆 400038 ;
3. 北京科技大学材料科学与工程学院, 北京 100083 ;
4. 中国人民解放军第306医院, 北京 100101 ;
5. 四川成都市金牛区凤凰山77120部队卫生连, 四川 成都 610081

收稿日期: 2017-12-18;  发布日期: 2018-07-06

基金项目: 军队后勤科研重点项目(编号:BZZ14J001);军队后勤科研重大项目(编号:ASW13J002);国家重点研发计划(编号:2016YFC0700901);北京市科技计划(编号:Z151100003915091)

通信作者: 周紫垣, Email: ziyuanzhou@tmmu.edu.cn   张爱华, Email: aihuagzykd@163.com  

作者简介: 于彩霞(1990-), 女, 硕士生; 研究方向:环境毒理学; E-mail:

[目的] 探究新型纳米材料氮杂纳米二氧化钛(N-nTiO2)对肺的损伤效应。

[方法] 42只健康SPF级SD大鼠随机分为1个空白对照组和5个N-nTiO2暴露组,每组7只,暴露组剂量设置分别为13.64、27.27、40.91、54.55、68.18 mg/kg(以体重计,余同)。每3 d气管滴注一次,染毒28 d。肺功能仪监测气管滴注前后肺功能变化,采用多功能酶标仪测定肺泡灌洗液中总蛋白质量浓度(下称浓度)、乳酸脱氢酶活性、碱性磷酸酶活性,HE染色观察肺组织病理损伤。

[结果] 暴露组大鼠体重增长均较空白对照组降低(P < 0.05)。54.55、68.18 mg/kg N-nTiO2暴露组大鼠每分通气量高于空白对照组(P < 0.05),40.91 mg/kg及以上N-nTiO2暴露组的最大呼气流量高于空白对照组(P < 0.05),68.18 mg/kg N-nTiO2暴露组的潮气量、最大吸气流量高于空白对照组(P < 0.05)。与空白对照组相比,仅40.91 mg/kg N-nTiO2暴露组大鼠肺泡灌洗液中总蛋白浓度增高(P < 0.05),27.27 mg/kg及以上N-nTiO2暴露组乳酸脱氢酶活性升高(P < 0.05),54.55 mg/kg以上N-nTiO2暴露组碱性磷酸酶活性升高(P < 0.05)。肺病理组织学检测结果显示,染毒大鼠肺组织主要表现为细胞增生、充血、炎性细胞浸润、肺阻塞、肺不张及肺实变等,且随着染毒剂量的增加,肺组织损伤程度也逐渐加重。

[结论] 经气管滴注N-nTiO2后会引起大鼠肺部病理损伤及肺功能降低。

关键词: 氮杂纳米二氧化钛;  气管滴注;  肺功能;  肺泡灌洗液;  肺毒性 

氮杂纳米二氧化钛(nitrogen-doped nano titanium dioxide,N-nTiO2)是本课题组前期在国家“十二五”重大专项支持下首次实现在纳米二氧化钛晶格中稳定掺入氮分子后获得的一种新型纳米材料[1]。与目前各种纳米二氧化钛(nano titanium dioxide,nTiO2)均需在紫外线照射下才能发挥活性所不同的是,N-nTiO2价带电子跃迁所需能量明显降低,在可见光激发下即可在表面生成活性超氧基团,其表面的高氧化还原活性为其应用于环境净化、消毒等领域提供了基础[2-5]。本课题组在前期实验中也证实,N-nTiO2对微生物、空气中有机污染物等具有极高的杀灭和分解效能[6],具有十分广泛的应用价值。

然而,该纳米材料在生物体内是否仍具有更强的氧化还原活性以及产生更强的生物活性效应,目前尚无研究。由于喷涂于物体表面或直接喷洒是N-nTiO2目前在环境净化、消毒领域最可能的实际应用方式,因此经呼吸道是优先考虑的主要暴露途径。本课题组在前期进行的经呼吸道大鼠急性染毒实验中,以最大耐受滴注体积染毒后,未观察到肺功能和肺组织病理学有明显改变。本研究拟采用短期重复实验设计,以气管滴注方式建立大鼠肺部亚急性染毒模型,以进一步评估较长时间(28 d)暴露后,N-nTiO2对呼吸功能和呼吸系统的影响,为系统的毒性评价和毒性机制研究提供基础。

1   材料与方法

1.1   仪器与试剂

BUXCO肺功能仪(DSI,美国),JEM-100CX电子透射显微镜(JEOL,日本),Zetasizer Nano ZS激光粒度分析仪(Malvern,英国),SpectraMax M2型全自动多功能酶标仪(Themo,美国)。

N-nTiO2分散液(北京科技大学,中国),质量浓度0.02 g/mL。乳酸脱氢酶、总蛋白、碱性磷酸酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所,中国)。

透射电镜观察N-nTiO2表征,激光粒度分析仪分析N-nTiO2在溶剂中的分散情况。

1.2   实验动物及分组

SPF级雄性SD大鼠42只,体重150~160 g,由第三军医大学实验动物中心提供,动物合格证号SCXK(渝)2012-0011,设施合格证编码SCXK(渝)2017-0002。饲养条件:温度20℃,相对湿度为45%~50%,昼夜均为12 h。将42只雄性SD大鼠随机分为1个空白对照组和5个N-nTiO2暴露组,每组7只。

1.3   剂量设置及染毒

根据预实验结果,大鼠最大耐受滴注体积为0.75 mL。结合预实验结果估算可能的最大实验动物体重为220 g,以N-nTiO2固定质量浓度0.02 g/mL给予大鼠最大滴注体积作为最高剂量组,呈等差数列形式依次设置5个剂量组,分别为13.64、27.27、40.91、54.55、68.18mg/kg(以体重计,余同)滴注体积均为0.75mL;另设1个空白对照组,实验过程中正常饮食饮水,不做处理。大鼠经无水乙醚麻醉后采用非暴露式气管滴注进行染毒,每3 d染毒一次,染毒28 d。染毒期间,动物自由进食饮水。末次染毒后禁食、不禁水。

1.4   染毒液配制

染毒液由N-nTiO2分散剂加水配制而成,N-nTiO2分散剂原液由2%N-nTiO2粉剂中加入97%的水及1%六偏磷酸钠(助剂),沙磨分散配制而成。

1.5   体重称量及记录

于每周末对大鼠体重进行称量并记录,分别记录第0周、第1周、第2周、第3周、第4周大鼠体重,其中第0周代表实验开始前(尚未染毒时)大鼠体重。

1.6   肺功能检测

实验开始24 h前和末次染毒24 h后,将大鼠置于肺功能仪整体扫描箱内,待动物熟悉环境并处于生理平稳状态后开始测试,采集100个稳定数据后结束。测定指标为每分钟呼吸频次、潮气量、每分通气量、最大吸气流量、最大呼气流量、增强的呼吸间歇。

1.7   大鼠肺脏脏器系数计算

于末次染毒完成肺功能测定后,大鼠经质量分数10%水合氯醛腹腔麻醉后进行体重称量,开胸取大鼠全肺进行称重,用于肺脏脏器系数计算,肺脏脏器系数=(肺湿重/体重)×100%。

1.8   支气管肺泡灌洗液的采集与检测

于末次染毒完成肺功能测定后,大鼠经质量分数10%水合氯醛腹腔麻醉后,开胸暴露气管并结扎左肺主支气管后剥离肺称重,沿主气管处将灌洗针头插入右肺,结扎固定。以37℃生理盐水5 mL灌洗右肺3次,支气管肺泡灌洗液以2 500 r/min离心15 min(离心半径420 mm),取上清液。多功能酶标仪检测支气管肺泡灌洗液中乳酸脱氢酶和碱性磷酸酶活性及总蛋白质量浓度(下称浓度)。

1.9   肺组织病理学检测

取大鼠右肺下叶,经体积分数10%中性甲醛固定后,进行脱水、石蜡包埋、切片,HE染色,常规光镜下观察肺组织病理损伤情况。

1.10   统计学分析

采用SPSS 18.0统计学软件进行统计分析。计量资料以x±s表示,多组间比较采用方差齐性检验和随机区组方差分析;组间比较采用LSD检验(方差齐性)和Dunnett’s t3检验(方差不齐性)。检验水准为α=0.05。

2   结果

2.1   N-nTiO2表征

N-nTiO2为锐钛型纳米材料,纯度为99%。透射电镜对N-nTiO2表征结果显示,颗粒大小均匀,在分散液中呈细梭状(图 1)。将母液质量浓度为0.02 g/mL的N-nTiO2分散剂用超纯水分别稀释10、20、50倍后微波震荡15 min,激光粒度分析仪检测结果显示,多分散指数(polymer dispersion index,PDI)为0.196,颗粒分散均匀,平均粒径为74.33 nm。

图 1

氮杂纳米二氧化钛表征

2.2   大鼠体重变化

染毒期间,27.27 mg/kg及以上暴露组大鼠体重均高于第0周(P < 0.05)。与同期空白对照组相比,暴露组体重较轻(P < 0.05),其中第4周时27.27 mg/kg以上暴露组与对照组相比体重的差异有统计学意义。各暴露组体重的增长均明显低于对照组(P < 0.05)。见表 1

表1

气管滴注N-nTiO2后大鼠体重变化情况(x±s,g,n=7)

Table1.Changes of body weights of rats after intratracheal instillation of N-nTiO2

2.3   大鼠肺脏脏器系数变化

与空白对照组(4.54±0.33)相比,27.27、40.91、54.55、68.18 mg/kg N-nTiO2暴露组肺脏脏器系数均升高,分别为5.45±0.80、6.03±0.74、5.76±0.53、5.73±0.25(P < 0.05)。

2.4   大鼠肺功能

气管滴注前对大鼠肺功能各项指标进行测定,各组间差异均无统计学意义,平行性较好。气管滴注28 d后,肺功能指标测定结果显示,54.55、68.18 mg/kg N-nTiO2暴露组每分通气量高于空白对照组(P < 0.05)。40.91 mg/kg及以上N-nTiO2暴露组的最大呼气流量高于空白对照组(P < 0.05)。68.18 mg/kg N-nTiO2暴露组的潮气量、最大吸气流量高于空白对照组(P < 0.05)。各N-nTiO2暴露组每分钟呼吸频次、增强的呼吸间歇与空白对照组相比差异均无统计学意义(P > 0.05)。见表 2

表2

气管滴注N-nTiO2后大鼠肺功能变化(x±sn=7)

Table2.Lung function changes of rats after intratracheal instillation of N-nTiO2

2.5   肺泡灌洗液中总蛋白浓度和酶活性

与空白对照组相比,乳酸脱氢酶活性在27.27mg/kg及以上N-nTiO2暴露组升高(P < 0.05),碱性磷酸酶活性在54.55、68.18mg/kg N-nTiO2暴露组升高(P < 0.05),总蛋白浓度仅在40.91 mg/kg N-nTiO2暴露组升高(P < 0.05)。见表 3

表3

气管滴注N-nTiO2后大鼠肺泡灌洗液指标变化(n=7)

Table3.Changes of indicators in alveolar lavage fluid of rats after in tratracheal instillation of N-nTiO2

2.6   组织病理学观察

光镜下可见空白对照组大鼠支气管和肺泡结构清晰,肺泡壁薄而完整,肺泡扩张良好,肺泡腔及肺泡间隙未见沉积物、吞噬细胞、炎性渗出物及充血水肿等(图 2A)。与空白对照组相比,随着N-nTiO2剂量的增加,肺泡扩张不良及闭塞程度增加,肺泡腔、肺泡壁及肺泡腔间隔内炎性细胞数量增多,肺泡间隙增宽且充血现象加重(图 2B~F)。54.55 mg/kg(图 2E)、68.18 mg/kg(图 2F)N-nTiO2暴露组大鼠肺组织损伤严重,大量肺泡塌陷萎缩,闭塞程度达70%~80%,肺部实变程度加深。

图 2

气管滴注N-nTiO2后大鼠肺组织损伤病理组织学结果(HE×200)

3   讨论

以往一直认为二氧化钛是一种化学性质较稳定的低毒性物质,美国食品及药物管理局于1966年批准其可在食品添加剂中使用,并规定其含量不得超过1% [7]。但许多研究提示,nTiO2颗粒不仅在不同器官和组织中均有明显蓄积作用,且具有老化、致敏作用,甚至诱发肿瘤等毒性效应[8-9]。nTiO2经呼吸道进入机体可对肺部产生有害作用[10-11]。与nTiO2需要紫外光才能发挥光催化作用相比,N-nTiO2仅需在可见光条件下即可发挥光催化效应,其毒性是否会随着光催化条件的改变而变化未见报道。由于N-nTiO2实际应用途径以呼吸道暴露为主,因此,探索这种新型纳米材料对呼吸系统毒性尤为重要。

实验动物的体重变化可以在整体水平上反映外环境因素对机体的影响,是一个客观简便的综合评价指标[12]。本研究中,N-nTiO2染毒后,暴露组大鼠体重增长均较对照组降低,说明N-nTiO2在整体水平上对大鼠产生了毒性效应。

肺功能是最直接反映肺损伤的指标之一。有研究显示,大鼠连续吸入18 nm的银粒子90 d后,出现炎症应答和肺功能的改变[13]。本研究结果显示,随着N-nTiO2剂量的升高,大鼠每分通气量、潮气量、最大吸气流量、最大呼气流量不断升高,提示N-nTiO2气管滴注28 d后会引起大鼠肺功能的下降,主要表现为支气管收缩限制,最终引起动物呼吸困难、呼吸衰竭等。

肺泡灌洗液中乳酸脱氢酶是反映肺泡受损程度的灵敏指标。本研究发现,随着N-nTiO2剂量升高,乳酸脱氢酶活性增加;同时,反映肺泡上皮-毛细血管屏障完整性的总蛋白浓度也增加,提示N-nTiO2经气管滴注染毒会造成肺泡细胞膜损害,导致细胞溶解死亡等现象发生。病理组织学检查也发现,N-nTiO2染毒大鼠支气管和肺泡均有不同程度损伤,主要表现为炎性细胞浸润,血细胞渗出等。这与nTiO2和纳米氧化镍的肺毒性研究结果一致[14-15]。碱性磷酸酶主要由肺泡Ⅱ型细胞及中性粒细胞产生,其活性增减可反映肺泡Ⅱ型细胞的受损程度和中性粒细胞的浸润程度。有报道称吸入纳米颗粒可观察到肺泡巨噬细胞的积聚[16-19]。本研究结果显示,随着染毒剂量的升高,54.55、68.18 mg/kg N-nTiO2暴露组碱性磷酸酶活性与空白对照组相比升高,其他暴露组与空白对照组相比差异无统计学意义,推测气管滴注N-nTiO2在高剂量染毒时会造成肺泡Ⅱ型细胞受损及中性粒细胞的大量聚集。病理组织学检查发现,N-nTiO2染毒大鼠肺泡间隙变窄,细胞增生,肺泡受损,直至实变,进一步证实N-nTiO2气管滴注可引起肺泡肺损害。常旭红等[11]也证实,nTiO2能导致Ⅱ型肺泡上皮细胞增生及肺上皮细胞凋亡,肺泡隔严重受损。有研究表明3.3 mg/kg nTiO2气管滴注3d后大鼠肺内可见巨噬细胞增加[20],另有研究发现纳米炭黑颗粒通过呼吸道暴露7 d后,大鼠肺泡巨噬细胞聚集,其中以嗜中性粒细胞居多[21-22]。MOHAMMADI等[23]证实,经呼吸道染毒28 d后在5 mg/kg nTiO2剂量组中可见大鼠肺泡融合成片,在30 mg/kg剂量组可引起慢性肺泡壁毛细血管充血、局灶性出血并伴有肺实变现象发生。本研究在13.64 mg/kg以上N-nTiO2剂量组观察到大鼠肺组织病理改变,主要表现为细胞增生、肺泡塌陷,直至肺实变,提示N-nTiO2气管滴注后可导致肺部明显的组织病理损伤。

虽然本课题组在前期进行的14 d气管滴注(隔天染毒)实验中,阴性对照组(生理盐水)与空白对照组相比,在肺脏脏器系数、肺功能指标、肺部组织病理变化方面未观察到明显的肺损伤效应;但由于本研究未设置阴性对照组(生理盐水),因此对最低剂量组(13.64 mg/kg)的实验结果,特别是以炎性细胞浸润和水肿为主要损伤表现的解释应该更加谨慎。另外,本研究中所使用的纳米颗粒为新近构建成功的一种将氮分子稳定掺杂纳米二氧化钛晶格后获得的新型N-nTiO2,尚未实际应用。根据在目前实验室条件下对环境净化应用测得的用量(0.4 g/m3)估算,人每日(以每日暴露8 h计)实际暴露剂量为26.58 mg/kg。本研究中动物染毒剂量分别相当于人实际可能暴露剂量的0.5、1.0、1.5、2.0、2.5倍,与真实日常暴露之间可能存在一定差异。

综上,本研究的结果表明,N-nTiO2经气管滴注后可导致大鼠肺部病理损伤及肺功能降低,提示在长期呼吸道暴露下,N-nTiO2可能在肺部聚集并导致呼吸系统受损。这些结果为今后N-nTiO2的实际应用及相关毒性评价和毒作用机制研究提供了线索。

图 1

氮杂纳米二氧化钛表征

Figure 1 Characteristics of nitrogen-doped nano titanium dioxide

表1

气管滴注N-nTiO2后大鼠体重变化情况(x±s,g,n=7)

Table 1 Changes of body weights of rats after intratracheal instillation of N-nTiO2

表2

气管滴注N-nTiO2后大鼠肺功能变化(x±sn=7)

Table 2 Lung function changes of rats after intratracheal instillation of N-nTiO2

表3

气管滴注N-nTiO2后大鼠肺泡灌洗液指标变化(n=7)

Table 3 Changes of indicators in alveolar lavage fluid of rats after in tratracheal instillation of N-nTiO2

图 2

气管滴注N-nTiO2后大鼠肺组织损伤病理组织学结果(HE×200)

Figure 2 Histopathological results of lung lesion induced by intratracheal instillation of N-nTiO2 in rats

[注]A:空白对照组;B~F:13.64、27.27、40.91、54.55、68.18 mg/kg氮杂纳米二氧化钛暴露组。白色箭头:炎性细胞浸润;白色三角:充血现象;黑色箭头:肺部阻塞、肺不张、肺实变。 [Note] A: Blank control group; B-F: 13.64, 27.27, 40.91, 54.55, and 68.18 mg/kg N-nTiO2 groups, respectively. White arrow represents in flammatory cell infiltration; white triangle represents hypermia; black arrow represents pulmonary obstruction, atelectasis, and consolidation.

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[基金项目] 军队后勤科研重点项目(编号:BZZ14J001);军队后勤科研重大项目(编号:ASW13J002);国家重点研发计划(编号:2016YFC0700901);北京市科技计划(编号:Z151100003915091)

[作者简介] 于彩霞(1990-), 女, 硕士生; 研究方向:环境毒理学; E-mail: 1393380684@qq.com

[收稿日期] 2017-12-18 00:00:00.0

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