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2018, 35(6):541-545.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2018.17701

脱锰后大鼠PARK2基因表达及运动和记忆功能的变化


1. 遵义医学院第三附属医院, 贵州 遵义 563000 ;
2a. 遵义医学院公共卫生学院, 贵州 遵义 563000 ;
2b. 遵义医学院基础药理省部共建教育部重点实验室, 贵州 遵义 563000 ;
3. 遵义医学院遵义医药高等专科学校卫生管理系, 贵州 遵义 563006

收稿日期: 2017-11-30;  发布日期: 2018-07-06

基金项目: 国家自然科学基金项目(编号:81260420)

通信作者: 范奇元, Email: qiyuan_fan@yahoo.cn  

[目的] 探讨大鼠脱锰前后全血中PARK2基因表达水平的改变,及其与大鼠运动、记忆功能的关系。

[方法] 60只健康成年SPF级SD大鼠(6周龄,160~180 g)随机分为对照组(生理盐水)、低剂量锰组(1 mg/kg)、高剂量锰组(5mg/kg),每组20只。以5mL/kg体积大鼠腹腔注射MnCl2染锰,隔天1次,连续4周。每组随机抽取10只大鼠进行转棒和Y迷宫实验分别检测运动和记忆功能;麻醉后取全血,石墨炉原子吸收仪检测全血中锰质量浓度(后称浓度),实时荧光定量PCR检测全血中PARK2基因表达情况。各组余下大鼠停止染锰,继续常规饲养5个月后操作同前。期间每月对大鼠进行乙醚麻醉后取内眦静脉全血动态检测血液中PARK2表达变化。

[结果] 染锰1个月后:与对照组[(2.10±0.15)mg/L]比较,高[(5.31±0.23)mg/L]、低[(3.13±0.16)mg/L]剂量组大鼠血锰浓度增高(P < 0.05);高、低剂量组大鼠PARK2基因相对表达水平分别为6.83±1.97、13.15±3.84,均低于对照组(26.05±3.66)(P < 0.05);高剂量组大鼠转棒距离[(743.56±99.66)cm]低于对照组[(1 547.09±192.53)cm](P < 0.05);大鼠全血锰浓度与转棒距离(r=-0.74)、全血PARK2表达(r=-0.57)均呈负相关(均P < 0.05),全血PARK2水平与转棒距离呈正相关(r=0.61,P=0.02)。脱锰5个月后:高剂量组大鼠血锰浓度[(2.54±0.20)mg/L]较前下降(P < 0.05),但仍高于对照组[(1.80±0.09)mg/L](P < 0.05);高剂量组大鼠转棒距离为(1 105.73±132.23)cm,较染锰1个月时增加(P < 0.05)。

[结论] 亚急性锰染毒大鼠脱锰后,全血PARK2基因相对表达水平及运动功能可恢复,PARK2基因可能作为锰致大鼠运动功能损伤的潜在标志。

关键词: 锰;  PARK2 运动;  记忆 

锰是维持机体正常运转的微量元素之一,也是骨骼形成的必备元素之一,参与人体内多种酶的合成。随着锰冶炼厂和锰矿开采等锰相关工业的迅速发展,以及新型有机锰如三羧基甲基环戊二烯合锰替代传统汽油抗爆剂——四乙基铅的使用,生活环境中锰浓度升高,非职业人群接触锰的机会迅速增多。长期锰接触会导致锰在人体内蓄积,导致锰中毒。锰中毒最突出的影响是神经系统损害[1],症状与帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)类似,引起大脑神经元损害。患者以运动功能失调为主的临床表现,如肢体强直、震颤、步态障碍等[2]。泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)是生物体内蛋白质选择性降解的重要途径之一,它可以清除细胞中突变、损伤和异常折叠的蛋白质,从而维持细胞内环境的稳态[3]PARK2基因的表达产物为Parkin蛋白,作为UPP途径中的重要成员,对清除沉积于机体内的错误折叠蛋白起关键作用。FAN等[4]对贵州某锰铁合金冶炼厂工人的调查研究发现,暴露组工人血浆和红细胞中的锰浓度是对照组的3.3倍和2.6倍。FAN等[5]的另一项研究结果显示,锰铁合金冶炼厂工人PARK2基因的表达随着锰在体内的蓄积量增多而减少,提示锰可能是导致神经系统损伤的原因之一。虽然许多研究致力于探索锰暴露的早期标志物,但灵敏度和特异度欠佳。本研究拟探究脱锰后大鼠全血中PARK2基因及运动和记忆功能的变化。

1   材料与方法

1.1   动物

SPF级雄性大鼠(6周龄,160~180 g),由第三军医大学实验动物中心提供,许可证号:SCXK(渝)2012-0005。

1.2   试剂和仪器

MnCl2×4H2O(生工生物,中国),Trizol试剂(Invtrogen,美国),TAKARA反转录试剂盒(TAKARA,日本),IQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad,美国)。ZB-200疲劳转棒仪(泰盟,中国),Y迷宫实验仪器(Clever Sys Inc,美国),高速低温离心机(Eppendorf,德国),Bio-Rad imark酶标仪和实时荧光定量PCR(RT-PCR)扩增仪(Bio-Rad,美国)。

1.3   分组与处理

60只健康成年雄性大鼠随机分为3组,每组20只。分别是对照组(生理盐水)、低剂量组(1 mg/kg,以体重计,后同)、高剂量组(5 mg/kg)。染锰剂量参照本课题组前期实验[6],昼夜交替各12 h,适应性喂养1周后以5 mL/kg(以体重计)体积通过腹腔注射MnCl2染毒,隔天1次,连续4周。每组随机抽取10只大鼠(染锰1个月)进行转棒和Y迷宫等行为学实验,然后用水合氯醛麻醉后取全血,石墨炉原子吸收仪检测全血中锰的质量浓度(简称“浓度”),RT-PCR法检测全血中PARK2基因表达情况。各组余下大鼠停止染锰,继续常规饲养5个月后(脱锰5个月)操作同前,用于观察动物脱锰后全血中的锰、PARK2表达情况及行为学变化。期间每月定时对大鼠进行乙醚麻醉后取内眦静脉血,动态检测血液中PARK2表达变化。

1.4   血锰浓度的检测

取500 μL血液于离心管中,加入800 μL浓HNO3溶液室温硝化至澄清,将硝化的样品加热至干燥,最后加入1%的稀HNO3溶液定容至50 mL,将所有样品在原子吸收标准曲线内适当稀释,石墨炉原子吸收法中Mn2+的检出下限为0.1 ng/mL。

1.5   转棒实验和Y迷宫实验

转棒实验用于测试大鼠的运动协调能力。转棒距离=转棒直径×转棒速度,平均速度=转棒距离/转棒时间,转棒时间即老鼠从站上棒开始跑步到跌落下来的时间,大鼠刚上棒速度为6转/min,之后以6转/min递增。转棒距离和转棒速度可作为反映大鼠运动功能的指标。Y迷宫由三条等长、夹角120°的臂组成,用于测试大鼠的学习和记忆能力。记录大鼠进入各支臂的次数,连续3次均进入不同的臂为一次正确的交替数,交替率=[正确的交替次数(/进入臂的总次数-2)] × 100%。

1.6   RT-PCR法检测PARK2表达

采血后立即加600 μL Trizol液混匀置于冰上保存,防治溶血,再加入120 μL三氯甲烷,混匀后离心(15 294× g,10 min,4℃),取上层清液加入200 μL异丙醇后混匀,离心(15 294× g,10 min,4℃),提取总RNA,加入75%乙醇洗脱有机相,最后将提出的RNA溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)水中,测量RNA浓度(D260/D280值在1.8~2.0之间可认为RNA纯度较佳)。用TAKARA反转录试剂盒将提取的总RNA反转成cDNA,后进行RT-PCR反应。RT-PCR反应体系:IQ SYBR Green Supermix 7.5 μL,正向引物(10 μmol/L)和反向引物(10 μmol/L)混合液0.5 μL,模板3 μL,DEPC水4 μL。反应条件为95℃ 3min,95℃ 10 s,60℃ 45 s,40个循环。引物序列见表 1

表1

PARK2β-actin引物序列

1.7   统计学分析

数据录入SPSS 18.0进行统计分析。计量结果以x± s表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用Bonferroni校正。交替率采用χ2 检验。同一变量重复测量采用双因素重复测量方差分析。相关分析采用皮尔森相关分析。检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   脱锰后全血锰浓度变化

与染锰1个月时相比,脱锰5个月后高剂量组大鼠血锰浓度降低(t=7.89,P < 0.05)。染锰1个月时各剂量组大鼠血锰浓度差异均有统计学意义(F=70.28,P < 0.05)。脱锰5个月后,仅高剂量组与对照组大鼠血锰浓度差异有统计学意义(P < 0.05)(见表 2)。

表2

染锰和脱锰大鼠血锰浓度比较(xs, mg/L, n=10)

2.2   脱锰后大鼠行为学实验结果

转棒实验发现,染锰1个月和脱锰5个月时高剂量组大鼠转棒距离间的差异有统计学意义(t=-4.27,P < 0.05)。染锰1个月时,对照组、低剂量组及高剂量组大鼠转棒距离间的差异有统计学意义(F=10.86,P < 0.05),高剂量组大于对照组(P < 0.05)。脱锰5个月后,对照组、低剂量组及高剂量组大鼠转棒距离间差异无统计学意义(F=1.752,P=0.19)(见表 3)。Y迷宫实验中,染锰和脱锰时,对照组大鼠与各染锰组大鼠交替率差异均无统计学意义(P > 0.05)(见表 3)。

表3

染猛和脱猛大鼠的转棒时间、平均速度、转棒距离及Y迷宫交替率比较(x±s, n=10)

2.3   大鼠全血PARK2表达水平

各组大鼠全血PARK2表达在染锰1个月和脱锰1~5个月各时间点上的差异有统计学意义(F=12.53,P < 0.001),时间和分组无交互效应(F=1.62,P=0.21)。对染锰1个月和脱锰1~5个月各组大鼠全血PARK2表达进行两两比较发现:染锰1个月后,各组间大鼠全血PARK2表达差异有统计学意义(P < 0.05);脱锰后各时间点上各组大鼠全血PARK2表达差异均无统计学意义(P> 0.05)(见图 1)。

图 1

染锰和脱锰大鼠PARK2基因表达变化

2.4   大鼠血锰浓度与各指标的相关分析

染锰1个月时,大鼠全血锰浓度与转棒距离、全血PARK2表达均呈负相关(r=-0.74,P < 0.01;r=-0.57,P=0.03),全血PARK2表达与转棒距离呈正相关(r=0.61,P=0.02)。脱锰5个月后,各剂量组转棒距离及全血PARK2表达与锰浓度无相关关系(P>0.05)。

3   讨论

PARK2基因表达Parkin蛋白,Parkin蛋白是UPP中的一种关键酶,参与了蛋白质的降解,避免异常蛋白在细胞内蓄积形成蛋白聚集体和路易小体,从而保护神经细胞[7]。此外,Parkin蛋白还能泛素化细胞内异常折叠蛋白,促进其水解[8],从而起到对神经细胞的保护作用。近年来,老年特发性PD的发病率明显增高。研究表明,环境锰暴露与老年特发性PD之间存在正相关关系[9]。流行病学研究发现锰暴露是PD发病的主要环境危险因素之一,锰接触可以使PD的发病年龄提前,职业接触工人锰中毒后期也会出现帕金森样症状[10],一旦出现运动障碍,便不可逆转。本研究通过大鼠锰中毒模型,探究大鼠在脱锰后运动与记忆功能能否逆转以及PARK2基因表达的变化情况。

本研究发现:高剂量染锰组大鼠全血PARK2基因表达比对照组、低剂量染锰组低;大鼠血锰水平随着染锰剂量增加而上升,与转棒距离、全血PARK2表达呈负相关;全血PARK2表达与转棒距离呈正相关。罗英等[11]也发现染锰组大鼠血锰浓度上升,PARK2表达下降,运动功能受损;脱锰后各组间全血PARK2表达无差异,脱锰5个月后染锰组大鼠全血锰浓度较染锰1个月时下降。ZHENG等[12]通过对成年SD雄性健康大鼠静脉注射MnCl2发现,锰在血浆内的半衰期为1.8 h,血浆锰浓度在12 h后恢复至正常水平。然而TAKEDA等[13]通过放射自显影技术显示,锰在各脑区持续存在,锰可通过血-脑屏障和血-脑脊液屏障进入脑组织,进入脑内的锰通过螯合作用缓慢排出大脑。ROMANÍ-AUMEDES等[14]研究发现,在特发性PD中,Parkin蛋白功能缺失会导致多巴胺能神经元细胞死亡。TAN等[15]研究发现,在果蝇中共表达人类Parkin蛋白可以抑制果蝇dNrdp1过表达产生的毒性,dNrdp1可导致大脑中多巴胺能神经元丧失,而多巴胺能神经元变性死亡是PD的主要特征[16]。陶冬等[17]研究发现,Parkin在抵抗锰导致的神经毒性作用中发挥了关键作用。本研究发现染锰1个月时大鼠全血PARK2表达下调,运动功能下降,可能原因是锰暴露导致PARK2表达下调,引起UPP异常,从而导致神经毒性。

本研究发现脱离锰染毒后,大鼠血锰浓度下降,PARK2表达上升,运动功能损伤得到恢复。因此,本研究推测PARK2可作为判断锰致运动功能损伤的参考指标,其具体机制仍需进一步研究。今后可通过锰致线粒体自噬的研究,进一步明确PARK2与锰暴露的关系。

表1

PARK2β-actin引物序列

Table 1
表2

染锰和脱锰大鼠血锰浓度比较(xs, mg/L, n=10)

Table 2
表3

染猛和脱猛大鼠的转棒时间、平均速度、转棒距离及Y迷宫交替率比较(x±s, n=10)

Table 3
图 1

染锰和脱锰大鼠PARK2基因表达变化

Figure 1 [注]*:P<0.05。

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[基金项目] 国家自然科学基金项目(编号:81260420)

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[收稿日期] 2017-11-30 00:00:00.0

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