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2018, 35(4):297-302.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2018.17694

氟、砷染毒对大鼠破骨细胞骨吸收能力的影响及其机制


贵州医科大学公共卫生学院, 环境污染与疾病监控教育部重点实验室, 贵州 贵阳 550025

收稿日期: 2017-11-27;  发布日期: 2018-07-06

基金项目: 国家自然科学基金项目(编号:81472927)

通信作者: 洪峰, Email: hongfeng-73@163.com  

作者简介: 杨德山(1987-), 男, 硕士生; 研究方向:毒物联合作用机制及防治; E-mail:

[目的] 研究氟砷联合染毒对大鼠破骨细胞骨吸收能力的影响及其机制。

[方法] 54只清洁级SD大鼠随机分为9组,每组6只,雌雄各半。根据预实验及文献确定染毒剂量,用NaF和NaAsO2分别对实验动物予以灌胃染毒,各染毒组毒物剂量及缩写分别为:对照组(F0As0)、低氟组(5 mg/kg,F5)、高氟组(20 mg/kg,F20)、低砷组(2.5 mg/kg,As2.5)、高砷组(10 mg/kg,As10)、低氟低砷组(5 mg/kg+2.5 mg/kg,F5As2.5)、低氟高砷组(5 mg/kg+10 mg/kg,F5As10)、高氟低砷组(20 mg/kg+2.5 mg/kg,F20As2.5)、高氟高砷组(20 mg/kg+10 mg/kg,F20As10)。酶联免疫吸附法(ELISA法)测定大鼠血清中抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)、Ⅰ型胶原吡啶交联终肽(ICTP)含量及大鼠右侧股骨组织匀浆上清液中骨保护素(OPG)、前列腺素E2(PGE2)、1,25二羟基维生素D3[1,25(OH)2D3]含量。

[结果] 大鼠血清中ICTP、TRACP-5b蛋白表达水平在高氟组均较对照组升高(F0As0:1.352±0.025,2.942±0.078;F20:1.427±0.026,3.202±0.142;均P < 0.05),而单独染砷组与对照组的差异均无统计学意义(Ps>0.05)。对于氟砷联合染毒组,染氟剂量在20mg/kg时,ICTP、TRACP-5b蛋白含量在高氟高砷组较高氟低砷组明显降低(F20As2.5:1.442±0.034,3.280±0.095;F20As10:1.345±0.042,3.053±0.084;均P < 0.05)。氟砷的偏相关分析及交互作用结果显示TRACP-5b、ICTP蛋白含量的改变与氟浓度呈正相关(偏相关系数:0.663,0.392;均P < 0.05),氟起到主效应作用(F=24.560,8.188;均P < 0.05)。大鼠骨组织OPG、PGE2、1,25(OH)2D3表达水平在高氟组均较对照组升高(F0As0:12.278±0.220,1.352±0.025,9.582±0.363;F20:14.087±0.797,1.427±0.026,11.915±0.931;均P < 0.05)。对于氟砷联合染毒组,染氟剂量为2.5 mg/kg时,低氟高砷组的PGE2较低氟低砷组低(F5As2.5:1.442±0.034;F5As10:1.345±0.080;P < 0.05);染氟剂量为20 mg/kg时,高氟高砷组1,25(OH)2D3较高氟低砷组低(F20As2.5:12.082±0.860;F20As10:10.567±0.695;均P < 0.05)。氟砷的偏相关分析及交互作用结果显示OPG、PGE2、1,25(OH)2D3含量改变与氟呈正相关(偏相关系数:0.804,0.487,0.748;均P < 0.05),氟起到主效应作用(F=47.100,9.031,3.114;均P < 0.05);砷对OPG、PGE2、1,25(OH)2D3的直接影响不明显(P>0.05)。

[结论] 砷能抑制氟暴露对大鼠破骨细胞骨吸收功能的促进作用,氟砷之间的交互作用主要表现为拮抗作用。PGE2、1,25(OH)2D3可能是氟砷对破骨细胞骨吸收功能进行调控的重要因子。

关键词: 氟;  砷;  骨;  联合作用;  破骨细胞 

骨骼的生长与发育是依赖成骨细胞(osteoblast,OB)的骨重建功能和破骨细胞(osteoclast,OC)的骨吸收功能来维持的,当骨重建与骨吸收之间的动态平衡在外源因素的干扰下发生破坏,就会引发骨代谢的紊乱,最终导致骨骼发生病理性变化。

特殊的地质环境使贵州部分地区环境中蓄积了大量的氟和砷,由氟砷联合作用导致的一系列疾病称为“氟砷综合征”,氟砷中毒能够引起人体多个组织器官的病理性变化,其中骨骼是氟砷联合中毒的重要靶器官之一,本课题组前期实验研究结果[1]表明,氟砷联合作用能够改变大鼠骨组织基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)、核转录因子-kβ受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factorkβ ligand,RANKL)蛋白含量;而MMP-9、RANKL蛋白含量的改变提示了大鼠骨组织OC骨吸收功能可能发生了变化[2-3]。因此,本研究拟通过对大鼠进行氟、砷及氟砷联合染毒,对实验大鼠OC骨吸收能力相关指标如抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrateresistant acid phosphatase 5b,TRACP-5b)、Ⅰ型胶原吡啶交联终肽(pyridinoline cross linked carboxyterminal telopeptide of type Ⅰ collagen,ICTP)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)、1,25二羟基维生素D3 [1,25-Dihydroxy vitamin D3,1,25(OH)2D3]进行检测,通过观察TRACP-5b、ICTP及OPG、PGE2、1,25(OH)2D3含量的变化探讨氟、砷及氟砷联合对大鼠OC骨吸收能力的毒性影响及其机制。

1   材料与方法

1.1   仪器与试剂

超净工作台(越平科学仪器有限公司,中国),纯水仪(Nikon,日本),高速低温离心机(Sigma,美国),超级酶联免疫检测仪(Thermo,美国),氟化钠(NaF)、亚砷酸钠(NaAsO2,山东西亚试剂公司,中国),大鼠ICTP ELISA试剂盒、大鼠TRACP-5b ELISA试剂盒、大鼠OPG ELISA试剂盒、大鼠PGE2 ELISA试剂盒、大鼠1,25(OH)2D3 ELISA试剂盒(上海江莱生物公司,中国)。

1.2   动物的分组与染毒

取8周龄、清洁级SD大鼠54只,体重为(109.71± 10.52)g [许可证号:SCXK(渝)2007-0003],按析因设计方法将SD大鼠随机分成9组,每组6只,雌雄各半。分别以NaF(5、20 mg/kg,按体重计,后同)和NaAsO2(2.5、10 mg/kg)进行单独或联合染毒。9个实验组命名(缩写)为:对照组(F0As0)、低氟组(F5)、高氟组(F20)、低砷组(As2.5)、高砷组(As10)、低氟低砷组(F5As2.5)、低氟高砷组(F5As10)、高氟低砷组(F20As2.5)、高氟高砷组(F20As10)。NaF和NaAsO2用去离子水溶解,按上述分组,分别予以灌胃。动物自由摄取饲料、自由饮水,自动控制昼夜循环(12/12 h),室温(22±1)℃。每周染毒5 d,连续灌胃染毒26周。每周称重一次,调节并维持给药量;每周调换笼位一次。

1.3   检测指标及方法

1.3.1   血清中TRACP-5b、ICTP蛋白含量的检测

ELISA法检测血清中TRACP-5b和ICTP含量。

1.3.2   骨组织中OPG、PGE2、1,25(OH)2D3含量的检测

称取0.3g右侧股骨组织,加入少量液氮,在研钵中迅速将骨组织碾碎至粉末状;将骨组织粉末转入2 mL Eppendorf管中,加入1.2 mL PBS缓冲液(pH=7.4),充分振荡混匀,2000×g、4℃,离心20 min。仔细收集上清液。获取骨骼匀浆上清液后采用ELISA法检测骨骼中OPG、PGE2、1,25(OH)2D3含量。

1.4   统计学分析

Excel建立数据库,SPSS 17.0统计软件录入数据并对实验数据进行正态性检验、方差齐性检验、单因素方差分析、偏相关分析、交互作用分析。实验结果均以均数±标准差表示,经检验,数据符合正态分布;对数据进行方差齐性检验,方差齐时,组间两两比较采用LSD检验,方差不齐时,采用Tamhane’s T2法比较;采用析因设计方差分析判断有无交互作用,并分析两者交互作用类型;以氟砷互为控制变量进行氟砷与各指标的偏相关分析。检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   各染毒组大鼠血清中ICTP、TRACP-5b蛋白含量的变化

染氟组ICTP、TRACP-5b蛋白含量在高氟组均高于对照组(P < 0.05);与低氟组相比,高氟组TRACP-5b含量高于低氟组,差异有统计学意义(P < 0.05)。染砷组ICTP、TRACP-5b蛋白含量随着染砷剂量的增加,其变化均不明显(P > 0.05)。与低氟低砷组相比,低氟高砷组的ICTP、TRACP-5b蛋白含量变化不明显(P > 0.05);与高氟低砷组相比,高氟高砷组的ICTP、TRACP-5b蛋白含量明显降低,差异有统计学意义(P < 0.05)。与低氟低砷相比,高氟低砷组的TRACP-5b蛋白含量明显升高,差异有统计学意义(P < 0.05);与低氟高砷组相比,高氟高砷组的ICTP蛋白含量明显降低,差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 1

表1

各染毒组ICTP、TRACP-5b、OPG、PGE2、1,25(OH)2D3含量的变化(n=6,x±s,ng/L)

Table1.Changes of ICTP, TRACP-5b, OPG, PGE2, and 1, 25 (OH)2D3 levels in each group

2.2   各染毒组大鼠骨组织中OPG、PGE2、1,25(OH)2D3含量的变化

高氟组OPG、1,25(OH)2D3含量高于低氟组,差异有统计学意义(P < 0.05);染砷组各指标变化不明显,高砷组和低砷组组间差异均无统计学意义(P > 0.05)。与低氟低砷组相比,低氟高砷组的OPG、1,25(OH)2D3含量变化不明显(P > 0.05),但PGE2蛋白含量降低,差异有统计学意义(P < 0.05);与高氟低砷组相比,高氟高砷组的1,25(OH)2D3含量明显降低,差异有统计学意义(P < 0.05)。与低氟低砷组相比,高氟低砷组的OPG、1,25(OH)2D3含量增加,差异有统计学意义(P < 0.05);与低氟高砷组相比,高氟高砷组的OPG、PGE2含量增加,差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 1

2.3   氟砷联合染毒对大鼠TRACP-5b、ICTP、OPG、PGE2、1,25(OH)2D3水平的交互作用

氟对大鼠TRACP-5b、ICTP、OPG、PGE2、1,25(OH)2D3含量的效应均为主效应(P < 0.05);而砷的主效应不明显(P > 0.05);氟砷联合染毒对TRACP-5b、ICTP蛋白含量的影响存在交互作用(P < 0.05),对OPG、PGE2、1,25(OH)2D3含量交互作用无统计学意义。见表 2

表2

氟砷交互作用分析

Table2.Analysis of the interaction effect of fluoride and arsenic

2.4   氟砷与TRACP-5b、ICTP、OPG、PGE2、1,25(OH)2D3的偏相关分析

氟与TRACP-5b、ICTP、OPG、PGE2、1,25(OH)2D3的含量均为正相关关系(均P < 0.05);砷与TRACP-5b、ICTP、OPG、PGE2、1,25(OH)2D3相关性均无统计学意义(均P>0.05)。见表 3

表3

氟砷的偏相关分析

Table3.Partial correlation analysis of fluoride and arsenic

3   讨论

ICTP是OC发生溶骨反应时,骨基质Ⅰ型胶原蛋白在MMP介导下释放的一种交联降解产物[4],以完整的免疫源性肽形式进入血液之中,不会进一步发生降解,是反映OC骨吸收速率的敏感指标。TRACP是OC溶酶体中一种特异性高表达的酶,血液中的TRACP-5b主要由骨组织的OC分泌,因此血液中的TRACP-5b蛋白含量可以反映骨组织中OC的含量。本研究偏相关分析结果表明,大鼠血清中ICTP、TRACP-5b蛋白含量均与氟呈正相关;且各染毒组ICTP、TRACP-5b蛋白含量的变化结果表明氟促进OC的分化,增加骨组织中OC的含量,加速OC对骨骼的降解速率。氟砷联合染毒结果显示,氟对ICTP、TRACP-5b蛋白含量均呈主效应作用,砷的主效应作用不明显;氟砷联合染毒对ICTP、TRACP-5b的影响表现出明显的交互作用,在氟砷联合染毒组中,染氟浓度在20 mg/kg时,与高氟低砷组相比,高氟高砷组的ICTP、TRACP-5b均降低,这一结果表明砷虽然并未对大鼠血清中ICTP、TRACP-5b蛋白含量表现出直接的毒性影响,却能通过抑制氟对大鼠血清中ICTP、TRACP-5b蛋白含量的促进作用,间接对大鼠血清中ICTP、TRACP-5b蛋白含量进行调控,因此高氟时氟、砷对ICTP、TRACP-5b的交互作用表现为拮抗作用。

OPG是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)受体家族中一个缺乏跨膜结构域的受体蛋白,主要分布在骨组织及免疫系统,是OC调控终末因子,其调控机制主要是凭借着高亲和性与核转录因子-kβ受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-kβ,RANK)竞争性结合,阻断RANKL与RANK的结合,从而抑制破骨细胞前体(osteoclast precursors,OCPs)向OC的分化[5]。本研究的偏相关分析结果显示,OPG在骨组织的蛋白含量与染氟浓度呈正相关;各染毒组OPG蛋白含量的变化结果表明OPG蛋白含量的变化与染砷浓度无明显相关性,氟起到主效应作用,氟砷联合作用不明显,提示了氟能促进大鼠骨组织OPG蛋白含量的升高。OPG作为OC的抑制因子,其含量变化通常与OC的含量及骨吸收能力呈负相关,但是在本研究中,从TRACP-5b、ICTP蛋白含量变化来看,大鼠骨组织OC含量及骨吸收能力并没有随着OPG含量的升高而降低。对于这一现象,可结合本课题组前期研究的一些结果来讨论,在本课题组前期研究[1]中观察到大鼠骨组织RANKL蛋白含量在各染毒组主要表现为升高;RANKL的升高抵消了OPG的升高对OC的抑制作用,这可能是本实验中OC骨吸收能力并没有随着OPG蛋白含量上升的原因之一。在本课题组前期研究中观察到RANKL蛋白含量在高氟浓度下随着染砷剂量的升高而逐渐降低;而在本实验中观察到OPG蛋白含量在高氟浓度下,并未随着染砷浓度的增加而变化,而前期研究发现[1]OPG/RANKL值在高氟高砷组高于高氟低砷组,这可能是氟、砷在F20As2.5、F20As10组对OC骨吸收能力表现为拮抗作用的机制之一。

1,25(OH)2D3是维生素D的主要活性代谢产物,与维生素D受体结合可以上调RANKL的表达[6]。PGE2属于前列腺素家族,研究指出,PGE2能够影响OC中MMP-9的表达,进而实现对MMPs家族的间接调控[7]。根据PGE2、1,25(OH)2D3在各染毒组含量的变化、偏相关分析结果可知,氟与PGE2、1,25(OH)2D3含量呈正相关关系,与染砷剂量无相关性。而PGE2、1,25(OH)2D3的升高可能是本课题组前期研究中观察到大鼠骨组织MMP-9、RANKL表达升高的原因之一;氟砷的交互作用结果显示,氟起到主效应作用,砷的主效应作用不明显,氟砷之间存在联合作用。氟砷联合染毒组,染氟浓度在5mg/kg时,PGE2随着染砷剂量的增加而明显降低,而1,25(OH)2D3变化不明显;染氟浓度在20 mg/kg时,PGE2变化不明显,1,25(OH)2D3随着染砷剂量的增加而降低,这一结果提示了砷虽然不能直接影响大鼠骨组织PGE2、1,25(OH)2D3含量,却可以通过抑制氟的主效应作用,达到调控的目的,氟砷的联合毒性在F20As10组对PGE2、1,25(OH)2D3主要表现为拮抗作用。

综上所述,在本实验条件下,砷能抑制氟暴露对大鼠OC骨吸收功能的促进作用,氟砷之间主要表现为拮抗作用。砷可以在高氟浓度下协同氟对OPG的促进作用,抑制OC骨吸收能力,这可能是氟砷在高氟浓度下对OC骨吸收能力表现为拮抗作用的机制之一。PGE2、1,25(OH)2D3可能是氟砷对OC骨吸收功能进行调控的重要因子。

表1

各染毒组ICTP、TRACP-5b、OPG、PGE2、1,25(OH)2D3含量的变化(n=6,x±s,ng/L)

Table 1 Changes of ICTP, TRACP-5b, OPG, PGE2, and 1, 25 (OH)2D3 levels in each group

表2

氟砷交互作用分析

Table 2 Analysis of the interaction effect of fluoride and arsenic

表3

氟砷的偏相关分析

Table 3 Partial correlation analysis of fluoride and arsenic

参考文献

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[基金项目] 国家自然科学基金项目(编号:81472927)

[作者简介] 杨德山(1987-), 男, 硕士生; 研究方向:毒物联合作用机制及防治; E-mail: 403292089@qq.com

[收稿日期] 2017-11-27 00:00:00.0

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